光检测insulin表达检测诱导分化结果。
[0026]本发明合成了可用于干细胞培养的PLGA支架，将骨髓间充质干细胞移植到PLGA支架后，通过胰岛β细胞诱导液培养后分化获取了一种具有高糖反应性、可用于治疗移植的胰岛β细胞，为治疗糖尿病带来了希望。
【附图说明】
[0027]图1:不同孔径PLGA支架的制备。NaCl颗粒比例为50%，粒径范围分别为100?150 μπι(图1Α)、150?200 μm(图1B)和200?250 μπι(图1C)PLGA支架纵切面的扫描电镜结果。
[0028]图2:支架孔径大小对大鼠骨髓间充质干细胞向胰岛β分化的影响。粒径范围分别为 100 ?150 μm(图 2A)、150 ?200 μπι(图 2Β)和 200 ?250 μπι(图 2C)PLGA 支架纵切面的扫描电镜结果。
[0029]图3:骨髓间充质干细胞在粒径范围分别为100?150 μ m、150?200 μ m和200?250 μ mPLGA支架上定向分化后Insl实时定量PCR结果。
[0030]图4:不同孔径率PLGA支架的制备。NaCl粒径为150?200 μπι，25% (图4Α)、50% (图4Β)、75% (图4C)NaCl颗粒比例制备的PLGA支架纵切面的扫描电镜结果。
[0031]图5:支架孔径率对大鼠骨髓间充质干细胞向胰岛β分化的影响。NaCl颗粒比例为25% (图5Α)、50% (图5Β)、75% (图5C)的PLGA支架纵切面的扫描电镜结果。
[0032]图6:骨髓间充质干细胞在NaCl粒径为150?200 μ m，25%、50%、75% NaCl颗粒比例制备的PLGA支架Insl基因的表达最高。
[0033]图7:CCK8法检测诱导过程细胞增殖情况。将大鼠间充质干细胞以相同的细胞密度同时接种到96孔培养板和96孔大小的PLGA支架表面，细胞接种密度为I X 104个细胞/孔，然后分别用胰腺β诱导液和普通培养液(10% FBS/α MEM)进行培养，于接种后I天、3天、5天、7天、14天和21天时分别进行CCK8检测，检测方法为将10 μ I CCK8加到100 μ I培养液中，37°C孵育4小时，然后在450nm处检测其吸光值，OD值反映细胞数量的多少。
[0034]图8:扫描电镜观察大鼠骨髓间充质干细胞在支架表面的粘附和生长。图A，B，C，D分别为诱导分化后第O，5，10，15天扫描电镜图像。(标尺为150 μπι)
[0035]图9:RT-PCR法检测胰岛β细胞特异性基因的表达。RT-PCR及其产物的半定量分析 PDX1，Ngn3，Glucagon，insulin，glucose transporter 2 (Glut2)。
[0036]图10:免疫荧光检测insulin表达。图中1、2为DAPI染色，呈蓝色，为细胞核。3为免疫荧光染色，呈绿色，代表insulin。
[0037]图11:insulin释放试验。PLGA支架诱导分化组高糖孵育后胰岛素分泌量是低糖孵育胰岛素分泌量的2倍。而单层培养诱导分化组在高糖孵育和低糖孵育两种状态下胰岛素分泌量大致相同。
【具体实施方式】
[0038]现结合实施例对本发明作详细描述，但本发明的实施不仅限于此。
[0039]实施例1:多孔PLGA支架的制备
[0040]将0.5g PLGA (分子量15KD) (PLA:PGA为85:15购自山东省医疗器械研究所)原料溶于1，4 二氧六环溶液中，配制成PLGA浓度为10% (w/v)的溶液。向上述浓度为10%w/v的聚乳酸羟基乙酸溶液中加入粒径大小为150?200 μm、比例为50% (w/w)的NaCl颗粒，搅拌后得到均匀悬液，倒入尺寸为8cmX8cm的培养皿。室温下干燥48h,冷冻干燥48h0脱模后用蒸馏水滤去多孔膜中的NaCl，室温干燥48h，搅拌烧杯中的去离子水可加速NaCl颗粒的溶出，待NaCl颗粒完全溶出后干燥薄膜，密封保存。
[0041]实施例2:多孔PLGA支架的制备
[0042]将0.5g PLGA (分子量15KD) (PLA:PGA为85:15购自山东省医疗器械研究所)原料溶于1，4 二氧六环溶液中，配制成PLGA浓度为10% (w/v)的溶液。向上述浓度为10%w/v的聚乳酸羟基乙酸溶液中加入粒径大小为150?200 μm、比例为25% (w/w)的NaCl颗粒，搅拌后得到均匀悬液，倒入尺寸为8cmX8cm的培养皿。室温下干燥48h,冷冻干燥48h0脱模后用蒸馏水滤去多孔膜中的NaCl，室温干燥48h，搅拌烧杯中的去离子水可加速NaCl颗粒的溶出，待NaCl颗粒完全溶出后干燥薄膜，密封保存。本实施例与实施例1差别在于PLGA制备过程中加入NaCl颗粒的比例不相同。
[0043]实施例3:多孔PLGA支架的制备
[0044]将0.5g PLGA (分子量15KD) (PLA:PGA为85:15购自山东省医疗器械研究所)原料溶于1，4 二氧六环溶液中，配制成PLGA浓度为10% (w/v)的溶液。向上述浓度为10%w/v的聚乳酸羟基乙酸溶液中加入粒径大小为150?200 μm、比例为75% (w/w)的NaCl颗粒，搅拌后得到均匀悬液，倒入尺寸为8cmX8cm的培养皿。室温下干燥48h,冷冻干燥48h0脱模后用蒸馏水滤去多孔膜中的NaCl，室温干燥48h，搅拌烧杯中的去离子水可加速NaCl颗粒的溶出，待NaCl颗粒完全溶出后干燥薄膜，密封保存。本实施例与实施例1差别在于PLGA制备过程中加入NaCl颗粒的比例不相同。
[0045]实施例4:多孔PLGA支架的制备
[0046]将0.5g PLGA (分子量15KD) (PLA:PGA为85:15购自山东省医疗器械研究所)原料溶于1，4 二氧六环溶液中，配制成PLGA浓度为10% (w/v)的溶液。向上述浓度为10%w/v的聚乳酸轻基乙酸溶液中加入粒径大小为100?150 μπι，比例为50% (w/w)的NaCl颗粒，搅拌后得到均匀悬液，倒入尺寸为8cmX8cm的培养皿。室温下干燥48h,冷冻干燥48h0脱模后用蒸馏水滤去多孔膜中的NaCl，室温干燥48h，搅拌烧杯中的去离子水可加速NaCl颗粒的溶出，待NaCl颗粒完全溶出后干燥薄膜，密封保存。本实施例与实施例1差别在于PLGA制备过程中加入NaCl颗粒的粒径不相同。
[0047]实施例5:多孔PLGA支架的制备
[0048]将0.5g PLGA (分子量15KD) (PLA:PGA为85:15购自山东省医疗器械研究所)原料溶于1，4 二氧六环溶液中，配制成PLGA浓度为10% (w/v)的溶液。向上述浓度为10%w/v的聚乳酸羟基乙酸溶液中加入粒径大小为200?250 μm，比例为50% (w/w)的NaCl颗粒，搅拌后得到均匀悬液，倒入尺寸为8cmX8cm的培养皿。室温下干燥48h,冷冻干燥48h0脱模后用蒸馏水滤去多孔膜中的NaCl，室温干燥48h，搅拌烧杯中的去离子水可加速NaCl颗粒的溶出，待NaCl颗粒完全溶出后干燥薄膜，密封保存。本实施例与实施例1差别在于PLGA制备过程中加入NaCl颗粒的粒径不相同。
[0049]试验例1:大鼠骨髓间充质干细胞在不同孔径PLGA支架上向胰岛β的诱导分化
[0050]1.过程:制备不同孔径的PLGA支架:向浓度为10% (w/v)的PLGA中加入比例为50%，粒径范围分别为100?150 μπι、150?200 μπι和200?250 μπι的NaCl颗粒(图1)(即实施例1、4、5，分别为图中B、A、C)。取Ρ3代大鼠骨髓间充质干细胞，将细胞接种到上述制备方法得到的已消毒的多孔PLGA支架表面，细胞接种密度为2.5 X 105个/24孔大小支架或4.5X 104个/96孔大小支架，24小时后将普通培养液(a MEM+10% FBS)换为胰岛β细胞诱导