一种利用海螺消化腺酶解紫菜获得体细胞的方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于海产品养殖技术领域，具体设及一种利用海螺消化腺酶解紫菜获得体 细胞的方法。
【背景技术】
[0002] 紫菜是海中互生藻类的统称，其富含蛋白质、舰、憐、巧等多种营养成分，还具有软 坚化疲、清热利水、补肾养屯、等药用功效，是一种集营养价值和保健功效于一体的天然的健 康食品，也是目前世界上经济价值最高的一种栽培海藻，其产值约占全世界人工栽培海藻 总产值的Ξ分之二。
[0003] 每年从自然种群或栽培群体中选出具有优良性状的紫菜成熟藻体作为种藻，再由 种藻取得果抱子或者采用腐烂法、分块法或酶解法获得体细胞后培养成丝状体，接种贝壳， 大量培养贝壳丝状体，是目前紫菜育种中最常用且传统的方法。而酶解法反应条件溫和，能 使体细胞受到的伤害降到最低程度，是目前最有效的一种获得细胞的方法。但目前酶解法 需使用裂解酶、纤维素酶等多种酶共同进行处理，且所使用的酶多为进口商品，价格昂贵。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的在于提供一种利用海螺消化腺酶解紫菜获得体细胞的方法，其不仅 可简化操作，缩短酶解时间，且酶解效果好，酶解过程中无需加入纤维素酶等其他酶，可有 效降低成本，具有较好经济效益，适合产业化生产推广。
[0005] 为实现上述目的，本发明采用如下技术方案： 一种利用海螺消化腺酶解紫菜获得体细胞的方法，其包括W下步骤： 1) 取新鲜海螺的消化腺，用水漂洗2次后，放入匀浆机中进行匀浆，然后将其溶解在pH 值为7.0、浓度为0.1mol/L的憐酸盐缓冲液中； 2) 在步骤1)所得溶液中加入硫酸锭，使溶液中硫酸锭的饱和度为30%进行盐析，于4°C 透析过夜，然后于lOOOr/min离屯、15min后，取上清液加硫酸锭至饱和度为90%进行二次盐 析，经透析、离屯、后取沉淀； 3) 将步骤2)所得沉淀加水配制成浓度为0.2-0.化gAiL的酶液； 4) 将紫菜组织剪碎，按l-2mL/g的量加入酶液，于10°C、8化/min摇床上酶解处理2-化， 然后用100皿筛絹过滤去除未酶解的组织碎片，2500 r/min离屯、5min，收集游离的体细胞。
[0006] 所述海螺为粒花冠小月螺或朝鲜花冠小月螺。
[0007] 海螺消化腺的提取方法为:将新鲜海螺在海水中清洗5-8次后，放在清水中饥饿2 天，再用海水清洗3-5次后，将海螺敲碎，取出消化腺。
[000引本发明的显著优点在于:现有技术中往往将取出的消化器官经盐析后干燥制成酶 粉，再用其与纤维素酶、离析酶共同对藻类组织进行酶解，其酶解时间一般需6-化，不仅操 作周期长，烘干过程中若控制不当易使酶失活，且多种酶的使用还增加了生产成本。本发明 直接将盐析后的沉淀物作为酶液，可简化操作，缩短2/3W上的酶解时间，且其酶解率可达 95% W上，酶解效果好，酶解过程中无需加入纤维素酶等其他酶，可降低60%W上成本，而所 得紫菜体细胞的活力可提高20%W上，且抗病及抗逆性强，具有较好经济效益，适合产业化 生产推广。
【具体实施方式】
[0009] -种利用海螺消化腺酶解紫菜获得体细胞的方法，其包括W下步骤： 1) 取新鲜海螺的消化腺，用水漂洗2次后，放入匀浆机中进行匀浆，然后将其溶解在pH 值为7.0、浓度为0.1mol/L的憐酸盐缓冲液中； 2) 在步骤1)所得溶液中加入硫酸锭，使溶液中硫酸锭的饱和度为30%进行盐析，于4°C 透析过夜，然后于lOOOr/min离屯、15min后，取上清液加硫酸锭至饱和度为90%进行二次盐 析，经透析、离屯、后取沉淀； 3) 将步骤2)所得沉淀加水配制成浓度为0.2-0.化gAiL的酶液； 4) 将紫菜组织剪碎，按l-2mL/g的量加入酶液，于10°C、8化/min摇床上酶解处理2-化， 然后用100皿筛絹过滤去除未酶解的组织碎片，2500 r/min离屯、5min，收集游离的体细胞。
[0010] 所述海螺为粒花冠小月螺或朝鲜花冠小月螺。
[0011] 海螺消化腺的提取方法为:将新鲜海螺在海水中清洗5-8次后，放在清水中饥饿2 天，再用海水清洗3-5次后，将海螺敲碎，取出消化腺。
[0012] 为了使本发明所述的内容更加便于理解，下面结合【具体实施方式】对本发明所述的 技术方案做进一步的说明，但是本发明不仅限于此。
[OOU]实施例1 1) 将新鲜粒花冠小月螺在海水中清洗5次后，放在清水中饥饿2天，再用海水清洗3次 后，将海螺敲碎，取出消化腺，用水漂洗2次； 2) 将漂洗后的消化腺放入匀浆机中进行匀浆，然后将其溶解在pH值为7.0、浓度为 O.lmol/L的憐酸盐缓冲液中； 3) 在步骤2)所得溶液中加入硫酸锭，使溶液中硫酸锭的饱和度为30%进行盐析，于4°C 透析过夜，然后于lOOOr/min离屯、15min后，取上清液加硫酸锭至饱和度为90%进行二次盐 析，经透析、离屯、后取沉淀； 4) 将步骤3)所得沉淀加水配制成浓度为0.化gAiL的酶液； 5) 将紫菜组织剪碎，按ImL/g的量加入酶液，于10°C、8化/min摇床上酶解处理化，然后 用100WI1筛絹过滤去除未酶解的组织碎片，2500 r/min离屯、5min，收集游离的体细胞，其酶 解率为95.2%。
[0014] 实施例2 1) 将新鲜粒花冠小月螺在海水中清洗6次后，放在清水中饥饿2天，再用海水清洗4次 后，将海螺敲碎，取出消化腺，用水漂洗2次； 2) 将漂洗后的消化腺放入匀浆机中进行匀浆，然后将其溶解在pH值为7.0、浓度为 O.lmol/L的憐酸盐缓冲液中； 3) 在步骤2)所得溶液中加入硫酸锭，使溶液中硫酸锭的饱和度为30%进行盐析，于4°C 透析过夜，然后于lOOOr/min离屯、15min后，取上清液加硫酸锭至饱和度为90%进行二次盐 析，经透析、离屯、后取沉淀； 4) 将步骤3)所得沉淀加水配制成浓度为ο.化gAiL的酶液； 5) 将紫菜组织剪碎，按2mL/g的量加入酶液，于12°C、8化/min摇床上酶解处理2.化，然 后用100皿筛絹过滤去除未酶解的组织碎片，2500 r/min离屯、5min，收集游离的体细胞，其 酶解率为95.6%。
[001引实施例3 1) 将新鲜朝鲜花冠小月螺在海水中清洗8次后，放在清水中饥饿2天，再用海水清洗5次 后，将海螺敲碎，取出消化腺，用水漂洗2次； 2) 将漂洗后的消化腺放入匀浆机中进行匀浆，然后将其溶解在pH值为7.0、浓度为 O.lmol/L的憐酸盐缓冲液中； 3) 在步骤2)所得溶液中加入硫酸锭，使溶液中硫酸锭的饱和度为30%进行盐析，于4°C 透析过夜，然后于lOOOr/min离屯、15min后，取上清液加硫酸锭至饱和度为90%进行二次盐 析，经透析、离屯、后取沉淀； 4) 将步骤3)所得沉淀加水配制成浓度为0.化gAiL的酶液； 5) 将紫菜组织剪碎，按2mL/g的量加入酶液，于10°C、8化/min摇床上酶解处理化，然后 用100WI1筛絹过滤去除未酶解的组织碎片，2500 r/min离屯、5min，收集游离的体细胞，其酶 解率为95.7%。
[0016]采用化kada法对实施例1步骤3)所得沉淀与等量现有技术中制备的酶粉（胡远皆 等，"鲍鱼酶的制备和应用试验"）进行酶活力测定，其结果见表1。
[0017]表1酶活力现憶结果
由表1可见，按本发明处理所得沉淀中酶活力明显高于现有酶粉。
[0018] W上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与 修饰，皆应属本发明的涵盖范围。
【主权项】
1. 一种利用海螺消化腺酶解紫菜获得体细胞的方法，其特征在于:包括以下步骤： 1) 取新鲜海螺的消化腺，用水漂洗2次后，放入匀浆机中进行匀浆，然后将其溶解在pH 值为7.0、浓度为0. lmol/L的磷酸盐缓冲液中； 2) 在步骤1)所得溶液中加入硫酸铵，使溶液中硫酸铵的饱和度为30%进行盐析，于4°C 透析过夜，然后于l〇〇〇r/min离心15min后，取上清液加硫酸铵至饱和度为90%进行二次盐 析，经透析、离心后取沉淀； 3) 将步骤2)所得沉淀加水配制成浓度为0.2-0.3yg/mL的酶液； 4) 将紫菜组织剪碎，按l_2mL/g的量加入酶液，于10°C、80r/min摇床上酶解处理2-3h， 然后用100μπι筛絹过滤去除未酶解的组织碎片，2500 r /min离心5min，收集游离的体细胞。2. 根据权利要求1所述利用海螺消化腺酶解紫菜获得体细胞的方法，其特征在于:所述 海螺为粒花冠小月螺或朝鲜花冠小月螺。3. 根据权利要求1所述利用海螺消化腺酶解紫菜获得体细胞的方法，其特征在于:海螺 消化腺的提取方法为:将新鲜海螺在海水中清洗5-8次后，放在清水中饥饿2天，再用海水清 洗3-5次后，将海螺敲碎，取出消化腺。
【专利摘要】本发明公开了一种利用海螺消化腺酶解紫菜获得体细胞的方法，其是将新鲜海螺的消化腺经匀浆、盐析后直接作为酶液，对紫菜组织进行酶解获得所需体细胞。按本发明方法进行处理，可简化操作，缩短酶解时间，且酶解效果好，酶解过程中无需加入纤维素酶等其他酶，可有效降低成本，具有较好经济效益，适合产业化生产推广。
【IPC分类】A01G33/02, C12N5/04
【公开号】CN105670984
【申请号】CN201610122944
【发明人】高丽华, 高文, 刘燕飞
【申请人】福建省平潭县水产良种实验有限公司
【公开日】2016年6月15日
【申请日】2016年3月4日