一种酶法制备莱鲍迪苷m的方法
【技术领域】
[0001] 本发明利用番茄UDP-糖基转移酶和马铃薯蔗糖合成酶，高效催化莱鲍迪苷A制备 莱鲍迪苷M，属于生物催化转化技术领域。
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【背景技术】
[0003] 甜菊糖（Steviol glycosides)是从菊科草本植物甜叶菊（SieFia reAawt/iafla)叶 中提取的天然甜味剂。它是30多种糖苷的混和物，不同糖苷在味质上存在较大的差异。甜 菊叶中三种最主要的糖苷成分在叶片中的含量通常为：甜菊苷（Stevioside)占叶片干重 9. 1%，莱鲍迪昔 A (Rebaudioside A, Reb A)占 3. 8%，莱鲍迪昔 C (Rebaudioside C，Reb C) 占0. 6%。甜菊糖具有高甜度、低热量、高稳定性，以及抗高血糖、抗高血压、抗炎症、抗肿瘤、 抗腹泻等潜在疗效，和利尿，免疫调节等效果，将其作为甜味剂应用于食品和饮料中的相关 研宄与经济性受到广泛关注。食品添加剂联合专家委员会（JECFA)对甜菊糖的使用已有相 关申明。在美国和欧盟高纯度的甜菊糖产品已被正式批准作为食品添加剂。
[0004] 近年来，包括以上三种糖苷组分在内，研发人员已从甜叶菊中分离得到11种糖 苷。莱鲍迪苷M ( Rebaudioside M，Reb M)是一种新发现的糖苷，与其它糖苷相比，其甜度 高，约为蔗糖的400倍，且甜味纯正，口感也更接近蔗糖，甘苦味和甘草异味低，稳定性好， 是一种理想的天然高倍甜味剂产品。2013年，美国FDA批准使用从甜叶菊叶子中提取的含 有50%含量Reb M的甜菊糖产品，并承认它的一般安全性（GRAS)。2014年，美国FDA通过 从甜叶菊叶子中提取的含有95%含量Reb M的GRAS认可，批准在除婴幼儿食品以外的饮料 和食品中使用。2015年，澳大利亚新西兰食品标准局批准Reb M作为甜味剂用于食品。
[0005] 甜叶菊叶子中Reb M的含量极少(少于1%)，且只在甜菊Morita植株中被检测到。 采用提取法生产Reb M需要大量的甜叶菊原料，另外富集Reb M的工艺繁琐，提取后需要多 次过柱和脱盐、脱色、重结晶，并在生产过程中产生大量的废水，其生产成本较高，不适合工 业化大生产。另外目前生物酶法合成Reb M的方法需要外加昂贵的UDP-葡萄糖为底物，通 过UDP-葡萄糖基转移酶的作用，催化Reb A生成Reb M，致使酶催化Reb A合成Reb M的经 济性较差、缺乏市场竞争力。
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【发明内容】
[0007] 本发明所要解决的问题是提供一种酶法制备莱鲍迪苷M的方法，该方法使用能够 过表达UDP-糖基转移酶和/或蔗糖合酶的工程菌，催化Reb A转化制备Reb M苷，利用生 物酶催化莱鲍迪苷A制备莱鲍迪苷M。该方法合成鲍迪苷M的转化率高，经济可靠，适于鲍 迪苷M的生产。
[0008] 为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案如下： 一种酶法制备莱鲍迪苷M的方法，包括以下步骤： 1) 构建工程菌：克隆m)P-糖基转移酶基因与蔗糖合成酶基因，构建双酶共表达或分别 表达的载体，并转移到大肠杆菌、酿酒酵母、毕赤酵母或谷氨酸棒杆菌等宿主菌中，获得过 表达m)P-糖基转移酶和/或蔗糖合酶的工程菌； 2) 制备莱鲍迪苷M (简称Reb M):将构建好的工程菌发酵产酶，发酵得到的菌体超声或 高压破碎，获得m)P-糖基转移酶和蔗糖合成酶的粗酶液；以莱鲍迪苷A (简称Reb A)和蔗 糖为原料，由制得的粗酶液中的m)P-糖基转移酶催化莱鲍迪苷A进行转化反应制备得到莱 鲍迪苷M ;该过程生成的UDP再由蔗糖合成酶催化生成UDP-葡萄糖。
[0009] 进一步改进，所述工程菌是导入UDP-糖基转移酶基因和蔗糖合成酶基因的大肠 杆菌、酿酒酵母、毕赤酵母和谷氨酸棒杆菌等，用于催化Reb A制备Reb M。
[0010] 另一种改进，所述底物莱鲍迪苷A的初始反应浓度为2-50 g/L，蔗糖与莱鲍迪苷A 的质量比为1-10,由共表达上述两个酶的工程菌制备的粗酶液在反应体系中的总蛋白浓度 为 2-20 mg/mL。
[0011] 另一种改进，所述转化反应采用水相体系，粗酶液在pH 6-8的缓冲溶液中进行生 物转化。
[0012] 另一种改进，所述转化反应的反应温度为20-50°C，反应时间为1-24 h。
[0013] 本发明的酶法制备莱鲍迪苷M的方法，具有以下有益效果： (1)利用基因工程技术获得m)P-葡萄糖基转移酶和蔗糖合酶的高产重组菌株，得到 适合产业化的廉价易得的高活性生物酶，以酶法合成获得大量莱鲍迪苷M。
[0014] (2)与其他酶法合成莱鲍迪苷M的方法相比，本项目不需添加昂贵的UDP-葡萄糖， 以廉价易得的莱鲍迪苷A和蔗糖为原料，通过蔗糖合酶催化蔗糖合成UDP-葡萄糖，通过番 茄m)P-葡萄糖基转移酶的作用，催化莱鲍迪苷A生成莱鲍迪苷M，反应转化率高（90%)，进 一步降低了生产成本。
[0015] (3)与其他酶法催化合成莱鲍迪苷M相比，利用基因工程技术获得的高活性 UDP-葡萄糖基转移酶和蔗糖合酶，不需通过复杂的蛋白纯化步骤分离出纯品，只需收集生 物酶粗品，即可直接进行催化反应，进一步缩短了工艺步骤，降低生产成本。
【具体实施方式】
[0016] 根据下述实施例，可以更好地理解本发明。然而，本领域的技术人员容易理解，实 施例中所描述的具体物料配比、工艺条件及其结果仅用于说明本发明，而不应当也不会限 制权利要求书中所详细描述的本发明。
[0017] 以下莱鲍迪苷A和莱鲍迪苷M分别简称为Reb A和Reb M，结构式分别参见I和 IIo
【主权项】
1. 一种酶法制备莱鲍迪苷M的方法，其特征在于，包括以下步骤： 1) 构建工程菌：克隆m)P-糖基转移酶基因与蔗糖合成酶基因，构建双酶共表达或分别 表达的载体，并转移到大肠杆菌、酿酒酵母、毕赤酵母或谷氨酸棒杆菌等宿主菌中，获得过 表达m)P-糖基转移酶和/或蔗糖合酶的工程菌； 2) 制备莱鲍迪苷M:将构建好的工程菌发酵产酶，发酵得到的菌体超声或高压破碎，获 得UDP-糖基转移酶和蔗糖合成酶的粗酶液；以莱鲍迪苷A和蔗糖为原料，由制得的粗酶液 中的m)P-糖基转移酶催化莱鲍迪苷A进行转化反应制备得到莱鲍迪苷M;该过程生成的 m)P再由蔗糖合成酶催化生成UDP-葡萄糖。
2. 根据权利要求1所述的酶法制备莱鲍迪苷M的方法，其特征在于，所述工程菌是导入 UDP-糖基转移酶基因和蔗糖合成酶基因的大肠杆菌、酿酒酵母、毕赤酵母和谷氨酸棒杆菌。
3. 根据权利要求1所述的酶法制备莱鲍迪苷M的方法，其特征在于，所述底物莱鲍迪 苷A的初始反应浓度为2-50g/L，蔗糖与莱鲍迪苷A的质量比为1-10,由共表达上述两个 酶的工程菌制备的粗酶液在反应体系中的总蛋白浓度为2-20mg/mL。
4. 根据权利要求1所述的酶法制备莱鲍迪苷M的方法，其特征在于，所述转化反应采用 水相体系，粗酶液在pH6-8的缓冲溶液中进行生物转化。
5. 根据权利要求1所述的酶法制备莱鲍迪苷M的方法，其特征在于，所述转化反应的反 应温度为20-50°C，反应时间为1-24h。
【专利摘要】本发明公开了一种酶法制备莱鲍迪苷M的方法，该方法利用番茄UDP-糖基转移酶和土豆蔗糖合成酶，以莱鲍迪苷A和蔗糖为原料生产莱鲍迪苷M。本发明的方法首先利用基因工程技术获得UDP-葡萄糖基转移酶和蔗糖合酶的高产重组菌株，然后收集生物酶粗品直接进行催化反应，反应体系中不添加UDP或UDP-葡萄糖，以莱鲍迪苷A和蔗糖为原料，通过蔗糖合酶催化UDP-葡萄糖高效循环，通过番茄UDP-葡萄糖基转移酶的作用，催化莱鲍迪苷A生成莱鲍迪苷M。与已有的莱鲍迪苷M制备方法相比，工艺步骤短，成本低，具有重要的应用价值和良好的经济性。
【IPC分类】C12N15-81, C12N15-74, C12P19-56, C12N15-70
【公开号】CN104726523
【申请号】CN201510139428
【发明人】李艳, 严明, 陈量量
【申请人】南京工业大学
【公开日】2015年6月24日
【申请日】2015年3月28日