一种鼠李糖苷酶的生产方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及鼠李糖苷酶领域，特别是涉及一种鼠李糖苷酶的生产方法。
【背景技术】
[0002]鼠李糖苷酶是一种水解酶。鼠李糖苷酶的来源比较广，广泛分布于自然界的细菌和真菌中。国内关于鼠李糖苷酶研究，主要集中在代谢产生的鼠李糖苷酶，国外研究相对较多，主要有黑曲霉、白曲霉、棘孢曲霉、青霉菌、拟杆菌属和热微菌门等。鼠李糖苷酶在实际工艺中具有很多潜在的应用价值，如工业上用于去除柑桔汁中柚皮苷的苦味，将橘皮苷水解为鼠李糖和橘皮素糖苷等。其中橘皮素糖苷是工业生产甜味剂的重要前体物。另外，鼠李糖苷酶可以作用于萜烯基糖苷，在改善葡萄汁和饮料的香气成分方面有很重要的应用。它在食品、医药、饲料等行业中得到了广泛应用。其工业化生产是利用微生物发酵法生产，但该方法存在发酵活力低、产量低、生产成本高等限制性因素，故为了克服上述问题，技术人员在应用各种遗传学手段提高微生物的生产性能方面，做了大量工作，而对通过培养方法的改进来提高发酵性能方面所做的工作还有所欠缺。
【发明内容】
[0003]本发明的目的在于提供一种工艺简单、发酵活力高的鼠李糖苷酶的生产方法。
[0004]—种鼠李糖苷酶的生产方法，其特征在于，包括以下步骤:
[0005](I)取细丽毛壳菌种按5?20%的接种量接种于一级种子培养基中，在25?38°C培养10?30h，控制溶氧在60%以上，培养即得一级种子液；
[0006](2)将所述一级种子液按5?20%的接种量接种于二级种子培养基中，在25?38°C培养10?30h，控制溶氧在60 %以上，培养即得二级种子液；
[0007](3)将所述二级种子液按5?20%的接种量接种于发酵培养基中，在25?38°C培养40?55h，控制溶氧在60%以上，得到混合培养基，后按每升混合培养基添加5?1g蔗糖的比例添加蔗糖，并开始按每升混合培养基流加橘皮苷0.5?5g/小时的比例添加橘皮苷，同时控制pH为4.5?5.5，培养70?96h后即得酶活达到500U/mL以上的鼠李糖苷酶发酵液，其中，所述发酵培养基的成分为:橘皮苷60?80g/L、酵母抽提物10?15g/L、氯化钠3?5g/L、磷酸二氢铵2?3g/L、硫酸镁0.5?lg/L、氯化锌0.2?0.5g/L、丙酸钙20?30g/L;
[0008](4)将所述鼠李糖苷酶发酵液进行过滤，除去菌体及其他微小颗粒，后对滤液超滤浓缩，直至得到酶活达到1250U/mL以上的鼠李糖苷酶酶液；
[0009](5)将所述鼠李糖苷酶酶液以淀粉为载体，进行喷雾干燥，即可得到酶活达到3500U/mL以上的固体鼠李糖苷酶；
[0010]其中，步骤(I)中的所述一级种子培养基和步骤(2)中的所述二级种子培养基的成分都为:橘皮苷60?80g/L、酵母抽提物10?15g/L、氯化钠3?5g/L、磷酸二氢钱2?3g/L、硫酸镁0.5?lg/L、氯化锌0.2?0.5g/L、丙酸钙20?30g/L。
[0011 ]在其中一个实施例中，所述一级种子培养基、所述二级种子培养基的成分都为:橘皮苷60g/L、酵母抽提物15g/L、氯化钠3g/L、磷酸二氢钱3g/L、硫酸镁lg/L、氯化锌0.2g/L、丙酸钙20g/L。
[0012]在其中一个实施例中，步骤(2)中，所述发酵培养基的成分为:橘皮苷60g/L、酵母抽提物10g/L、氯化钠5g/L、磷酸二氢铵3g/L、硫酸镁0.5g/L、氯化锌0.5g/L、丙酸钙30g/L。
[0013]在其中一个实施例中，步骤(3)中，通过添加氨水的方式控制pH为5.0?5.5。
[0014]在其中一个实施例中，步骤(1)、(2)、(3)中控制溶氧的方法都为:在培养过程中，调整搅拌转速或通入无菌空气控制溶氧在60%以上。
[0015]在其中一个实施例中，步骤(4)中，将鼠李糖苷酶发酵液通过板框过滤方法，除去菌体及其他微小颗粒。
[0016]上述鼠李糖苷酶的生产方法，通过在发酵培养基中控制鼠李糖的加入量，从而控制菌体生长速度，防止发酵培养后期菌体生长后劲不足；另外，在发酵培养基中加入蔗糖，可以限制鼠李糖苷酶对橘皮苷的作用，减少鼠李糖的产生，有利于促进鼠李糖苷酶的合成。
[0017]上述鼠李糖苷酶的生产方法，工艺简单、操作容易、生产效率高，且生产的鼠李糖苷酶活力高，稳定性好，易于储存。
【具体实施方式】
[0018]为使本发明的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面对本发明的【具体实施方式】做详细的说明。在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本发明。但是本发明能够以很多不同于在此描述的其它方式来实施，本领域技术人员可以在不违背本发明内涵的情况下做类似改进，因此本发明不受下面公开的具体实施的限制。
[0019]—实施方式的鼠李糖苷酶的生产方法，包括以下步骤:
[0020]取细丽毛壳菌种按5?20%的接种量接种于一级种子培养基中，在25?38°C培养10?30h，控制溶氧在60 %以上，培养即得一级种子液。
[0021 ]其中，一级种子培养基的成分为:橘皮苷60?80g/L、酵母抽提物10?15g/L、氯化钠3?5g/L、磷酸二氢铵2?3g/L、硫酸镁0.5?lg/L、氯化锌0.2?0.5g/L、丙酸钙20?30g/L0
[0022]将所述一级种子液按5?20%的接种量接种于二级种子培养基中，在25?38°C培养10?30h，控制溶氧在60%以上，培养即得二级种子液。
[0023]其中，二级种子培养基的成分为:橘皮苷60?80g/L、酵母抽提物10?15g/L、氯化钠3?5g/L、磷酸二氢铵2?3g/L、硫酸镁0.5?lg/L、氯化锌0.2?0.5g/L、丙酸钙20?30g/L0
[0024]将所述二级种子液按5?20%的接种量接种于发酵培养基中，在25?38°C培养40?55h，控制溶氧在60%以上，得到混合培养基，后按每升混合培养基添加5?1g蔗糖的比例添加蔗糖，并开始按每升混合培养基流加橘皮苷0.5?5g/小时的比例添加橘皮苷，同时控制pH为4.5?5.5，培养70?96h后即得酶活达到500U/mL以上的鼠李糖苷酶发酵液。
[0025]其中，所述发酵培养基的成分为:橘皮苷60?80g/L、酵母抽提物10?15g/L、氯化钠3?5g/L、磷酸二氢铵2?3g/L、硫酸镁0.5?lg/L、氯化锌0.2?0.5g/L、丙酸钙20?30g/L0
[0026]优选的，发酵培养基的成分为:橘皮苷60g/L、酵母抽提物15g/L、氯化钠3g/L、磷酸二氢铵3g/L、硫酸镁I g/L、氯化锌0.2g/L、丙酸钙20g/L。
[0027]控制pH值步骤为:通过添加氨水的方式控制pH为5.0?5.5。
[0028]上述中控制溶氧的方法都为:在培养过程中，调整搅拌转速或通入无菌空气控制溶氧在60%以上。
[0029]将鼠李糖苷酶发酵液进行过滤，除去菌体及其他微小颗粒，后对滤液超滤浓缩，直至得到酶活达到1250U/mL以上的鼠李糖苷酶酶液。
[0030]优选的，将鼠李糖苷酶发酵液通过板框过滤方法，除去菌体及其他微小颗粒。
[0031]将鼠李糖苷酶酶液以淀粉为载体，进行喷雾干燥，即可得到酶活达到3500U/mL以上的固体鼠李糖苷酶。
[0032]喷雾干燥方法的优点为:生产效率高，生产能力大，且产品质量高。淀粉作为载体可以充当鼠李糖苷酶的保护剂，减少储存过程中的损失。
[0033]在鼠李糖苷酶发酵生产中，蔗糖作为菌体利用的碳源，可以使发酵缓慢持续进行，橘皮苷作为鼠李糖苷酶生产的诱导物，其代谢产物鼠李糖会阻碍鼠李糖苷酶的合成。为此，本发明在发酵初期，在发酵培养基中降低蔗糖和橘皮苷的加量，控制菌体生长速度，防止发酵后期菌体生长后劲不足，及防止鼠李糖的大量累积，阻碍鼠李糖苷酶的合成；同时在发酵培养基中添加丙酸钙既可以作为孢子附着的载体，有利于细丽毛壳菌的生长，又可以抑制杂菌的产生，有效缓解PH下降过快，减轻鼠李糖的阻碍作用。到发酵中期，发酵液中蔗糖和橘皮苷的浓度下降，此时流加蔗糖和橘皮苷既可以维持菌体的生长，又可以持续诱导鼠李糖苷酶的合成。
[0034]本发明的鼠李糖苷酶的生产方法工艺简单、操作容易、生产效率高，且生产的鼠李糖苷酶活力高，稳定性好，易于储存。
[0035]下面结合具体实施例，对本发明作进一步的阐述。
[0036]实施例1
[0037]—种鼠李糖苷酶的生产方法，包括以下步骤:
[0038](I)取细丽毛壳菌种按5%的接种量接种于一级种子培养基中，在38°C培养30h，控制溶氧在60 %以上，培养即得一级种子液。
[0039]其中，一级种子培养基的成分为:橘皮苷60g/L、酵母抽提物15g/L、氯化钠3g/L、磷酸二氢铵3g/L、硫酸镁I g/L、氯化锌0.2g/L、丙酸钙20g/L。
[0040](2)将所述一级种子液按5的接种量接种于二级种子培养基中，在38°C培养30h，控制溶氧在60 %以上，培养即得二级种子液。
[0041 ]其中，二级种子培养基的成分为:橘皮苷60g/L、酵母抽提物15g/L、氯化钠3g/L、磷酸二氢铵3g/L、硫酸镁I g/L、氯化锌0.2g/L、丙酸钙20g/L。
[0042](3)将所述二级种子液按20%的接种量接种于发酵培养基中，在25°C培养40h，控制溶氧在60%以上，得到混合培养基，后按每升混合培养基添加5g蔗糖的比例添加蔗糖，并开始按每升混合培养基流加橘皮苷5g/小时的比例添加橘皮苷，同时控制pH为4.5，培养96h后即得酶活达到500U/mL以上的鼠李糖苷酶发酵液。
[0043]其中，所述发酵培养基的成分为:橘皮苷60g/L、酵母抽提物10g/L、氯化钠5g/L、磷酸二氢铵3g/L、硫酸镁0.5g/L、氯化锌0.5g/L、丙酸钙30g/L。
[0044](4)将鼠李糖