用于生产l-2-氨基丁酸的转氨酶的制作方法
【技术领域】
[0001]本发明属于生物催化技术领域，具体地说，涉及通过基因工程构建的用于生产L-2-氨基丁酸的转氨酶。
【背景技术】
[0002] L-2-氨基丁酸，英文名为L( + )-2_Aminobutyric acid，分子式为C4H9N02，CAS No. 为1492-24-6,是一种非天然的手性α-氨基酸。L-2-氨基丁酸是新型抗癫痫药一左乙拉西坦 的主要生产原料，也是合成抑菌抗结核药乙胺丁醇、以及许多手性药物的关键手性前体，市 场需求量正在大幅增加。
[0003] L-2-氨基丁酸的生产包括化学法和生物方法。化学法生产L-2-氨基丁酸的生产工 艺可参见中国发明专利ZL200610030420.X和ZL201210034250.8,该工艺以2-溴丁酸或者丙 醛和氰化钠为底物生产，但是生产需要大量使用有机溶剂，有毒的芳香醛，以及拆分剂等， 生产成本较高，对环境的危害也比较严重。
[0004] 生物法生产L-2-氨基丁酸的途径有氨基酸氧化酶法、转氨酶法、脱氢酶法和发酵 法等。氨基酸氧化酶法以化学合成的混旋2-氨基丁酸为底物，使用D-氨基酸氧化酶在金属 催化剂的作用下制备L-2-氨基丁酸，分离收率可达95%以上[Fotheringham I，et al·， Biochemical Society Transactions，2006,34(2) :287-290]，但是由于化学合成混旋2-氨 基丁酸的成本较高，特别是金属催化剂的成本高，所以该路线并不适合于工业化生产。转氨 酶法生产L-2-氨基丁酸存在转化率低、生产浓度低、杂质干扰等问题[Fotheringham I，et al·，Bioorganic&medicinal chemistry,1999,7(10):2209-2213；Zhu L,Tao R,et al., AppliedMicrobiology and Biotechnology ,2011,90(3) :903-910]。发酵法生产的产量和 转化率也不高[Zhang K, Li H, et al·, Proceedings of the National Academy of Sciences of the UnitedStates of America,2010，107(14) :6234-6239]，所以也没有实 现工业化生产。脱氢酶法以丁酮酸为底物，在L-苏氨酸脱氨酶、L-亮氨酸脱氢酶作用下生成 L-2-氨基丁酸，但反应需要NADH作为辅酶，所以在转化体系需耦合辅酶的再生体系，增加了 生产的复杂性和成本[Tao R,Jiang Y,Zhu F，et al.，Biotechnology letters,2014,36 (4) :835-841]〇
[0005] 转氨酶法使用ω -转氨酶（ω -TA)，以胺和酮类化合物为原料，通过立体选择性地 转氨基作用，可以高效生产手性胺。Ochrobactrum anthropi来源ω -转氨酶在异丙胺存在 下可将底物丁酮酸转化为L-2-氨基丁酸。而丁酮酸以L-苏氨酸为原料通过L-苏氨酸脱氨酶 转化获得，L-苏氨酸和异丙胺都比较廉价，而且整个催化过程可以达到较高的转化率，因此 具有较好的应用前景。但是目前的转化浓度较低，只有〇. 1Μ，酶的活性也比较低[Park E S， Dong J Y，Shin J S.，0rganic&biomolecular chemistry,2013，11(40):6929_6933]，因此 酶的活性和转化浓度成为了生产L-2-氨基丁酸的限制性因素。
【发明内容】
[0006] 为了克服现有L-2-氨基丁酸生产技术的上述缺陷，得到酶活性更高的转氨酶，本 发明利用基因工程技术来对微生物来源的野生型转氨酶进行改造和筛选，构建高酶活性的 转氨酶突变体，从而进行L-2-氨基丁酸的工业化生产。
[0007] 为此，本发明通过大量筛选ω-转氨酶，并通过随机突变、半理性设计等蛋白工程 技术对Ochrobactrum anthropi来源 ω -转氨酶（0ΑΤΑ)、Brucella neotomae来源 ω -转氨酶 (BNTA)、0chrobactrum intermedium来源ω -转氨酶（OITA)、以及比活力较高的其他来源 ω_转氨酶进行改造，获得酶活和稳定性提高的转氨酶突变体，有效地降低转氨酶法生产L-2_氨基丁酸的生产成本。
[0008] 因此，本发明的第一个目的在于提供一种用于生产L-2-氨基丁酸的转氨酶。
[0009] 本发明的第二个目的在于提供编码上述转氨酶的基因。
[0010]本发明的第三个目的在于提供包含上述基因的质粒。
[0011] 本发明的第四个目的在于提供转化了上述质粒的微生物。
[0012] 本发明的第五个目的在于提供上述转氨酶或微生物在生产L-2-氨基丁酸的用途。 [0013]为了达到上述目的，本发明提供如下用于生产L-2-氨基丁酸的转氨酶：
[0014] 0ATA(SEQ ID Ν0:1)的下述突变体：
[0015] 0ATA/S87K/V154A(SEQ ID Ν0:2)，其为SEQ ID Ν0:1 第87位的S替换为Κ、第 154位 的V替换为Α的突变体；
[0016] 〇ATA/S87K/V154G(SEQ ID N0:3)，其为SEQ ID N0:1 第87位的S替换为K、第 154位 的V替换为G的突变体；
[0017] 0ATA/V154G/G229C(SEQ ID N0:4)，其为SEQ ID N0:1 第 154位的V替换为G、第229 位的G替换为C的突变体；
[0018] 〇ATA/S87K/V154G/N166V(SEQ ID N0:5)，其为SEQ ID N0:1 第87位的S替换为K、第 154位的V替换为G、第166位的N替换为V的突变体；
[0019] 或者
[0020] BNTA(SEQIDN0:6)、及其下述突变体：
[0021] BNTA/V154G/Y15N(SEQ ID N0:7)，其为SEQ ID N0:6第 154位的V替换为G、第 15位 的Y替换为N的突变体；
[0022] BNTA/V154G/K79E(SEQ ID N0:8)，其为SEQ ID N0:6第 154位的V替换为G、第79位 的K替换为E的突变体；
[0023] 或者
[0024] 0ITA(SEQ ID N0:9)、及其下述突变体：
[0025] 0ITA/V154G/S7L(SEQIDN0:10)，其为SEQIDN0:9第154位的V替换为G、第7位的 S替换为L的突变体；
[0026] 0ITA/V154G/T21A(SEQIDN0:11)，其为SEQIDN0:9第154位的V替换为G、第21位 的T替换为A的突变体；
[0027] 0ITA/V154G/N166V(SEQIDN0:12)，其为SEQIDN0:9第154位的V替换为G、第166 位的N替换为V的突变体；
[0028] 0ITA/V154G/L254M(SEQIDN0:13)，其为SEQIDN0:9第154位的V替换为G、第254 位的L替换为Μ的突变体；
[0029] 0ITA/V154G/K279N(SEQIDN0:14)，其为SEQIDN0:9第154位的V替换为G、第279 位的K替换为N的突变体；
[0030] 0ITA/V154G/T422A(SEQIDN0:15)，其为SEQIDN0:9第154位的V替换为G、第422 位的T替换为A的突变体；
[0031] 0ITA/V154G/N448D(SEQIDN0:16)，其为SEQIDN0:9第154位的V替换为G、第448 位的N替换为D的突变体。
[0032] 其中，野生型Ochrobactrum anthropi来源ω -转氨酶0ΑΤΑ的氨基酸序列（SEQ ID N0:1)是：
[0033] MTAQPNSLEARDIRYHLHSYTDAVRLEAEGPLVIERGDGIYVEDVSGKRYIEAMSGLWSVGVGFSEPRLAEAAARQM KKLPFYHTFSYRSHGPVIDLAEKLVSMAPVPMSKAYFTNSGSEANDTVVKLIWYRSNALGEPERKKIISRKRGYHGV TIASASLTGLPNNHRSFDLPIDRILHTGCPHFYREGQAGESEEQFATRLADELEQLIIAEGPHTIAAFIGEPVMGAG GVVVPPKTYWEKVQAVLKRYDILLIADEVICGFGRTGNLFGSQTFDMKPDILVMSKQLSSSYLPISAFLINERVYAP IAEESHKIGTLGTGFTASGHPVAAAVALENLAIIEERDLVANARDRGTYMQKRLRELQDHPLVGEVRGVGLIAGVEL VTDKQAKTGLEPTGALGAKANAVLQERGVISRAMGDTLAFCPPLIINDQQVDTMVSALEATLNDVQASLTR 〇
[0034] 野生型Brucellaneotomae来源ω-转氨酶BNTA的氨基酸序列（SEQIDN0:6)是 ： MTAQPNSLEARDIRYHLHSYTDAVRLEAEGPLVIERGDGIYVEDIAGKRYIEAMSGLWSVGVGFSEQRLAEAAARQM KKLPFYHTFSYRSHGPVIDLAEKLVAMAPVPMSKAYFTNSGSEANDTVVKLIWYRSNALGEPERKKIISRKRGYHGV TIASASLTGLPNNHRSFDLPIDRILHTGCPHHYHDALPGESEEQFTTRLANELEQLILAEGPHTIAAFIGEPVMGAG GVVVPPKTYWEKVQAVLGRYNILLVADEVICGFGRTGNLFGCQTFDIKPD