一种双酶检测γ–氨基丁酸含量的方法
【专利摘要】本发明提供了一种双酶检测γ–氨基丁酸含量的方法。该方法包括以下步骤：在液氮中研磨待测样，加入醇；真空干燥，加入卤化镧，混匀离心后，收集上清液；再向上清液加入碱液，混匀离心后，得到γ–氨基丁酸提取液；再向所得提取液中加入NADP+、Tris缓冲液、γ–氨基丁酸转氨酶?琥珀酸半醛脱氢酶双酶液，得到混合液；使用紫外可见分光光度计，测定上述混合液在340nm波长处的初始值；然后向混合液中加入α?酮戊二酸进行反应，测定反应液在340nm波长处的最终值，绘制标准曲线，求得一次回归曲线；根据初始值、最终值和一次回归曲线，计算γ–氨基丁酸的含量。本发明可有效降低干扰，简单快速准确地检测植物和动物材料中γ–氨基丁酸的含量。
【专利说明】
一种双酶检测γ -氨基丁酸含量的方法
技术领域
[0001]本发明涉及γ-氨基丁酸检测技术领域，尤其涉及一种双酶检测γ -氨基丁酸含量的方法。
【背景技术】
[0002]γ -氨基丁酸(GABA)是一种广泛存在的非蛋白氨基酸，是动植物细胞自由氨基酸库中的重要组分。植物组织中GABA的含量低，约0.03?2.0Oymol/gFW，但在响应不同外界刺激，如机械损伤、缺氧、盐分胁迫等后可成倍增加。正确测定动植物组织GABA含量，是进行相关疾病治疗，分析植物对外界刺激的响应和适应能力的一个重要指标。
[0003]为测定动植物组织的GABA含量，人们已研制出多种检测方法。常见的有薄层色谱法、纸层析法、纸电泳法、氨基酸分析仪法、高效液相色谱法等。其中，GABA薄层色谱法以及纸层析法检测法，成本低廉，方法简单，操作方便，然而这两种方法存在误差大、重现性较差的问题。使用氨基酸分析仪和高效液相色谱仪检测GABA，这两种方法的检测灵敏度、稳定性和准确性都较高，但检测仪器昂贵，客观上限制了这两种方法的推广使用。
[0004]因此，开发准确、快速的分光光度法检测GABA技术，成为人们研究的目标。其中，苯酚-次氯酸钠比色测定法和Gabase双酶试剂盒比色法已被国人所熟知。这两种方法操作简单，成本低廉，可直接测定GABA的纯制品。不足的是对于从动植物组织、人体血液提取的GABA粗制品，其测定易受体内谷氨酸脱羧酶活性和细胞色素的干扰，导致检测数据偏高。
【发明内容】
[0005]本发明的目的在于克服上述现有技术中存在的不足，提供一种双酶检测γ-氨基丁酸含量的方法，该方法简单且准确，又少受谷氨酸脱羧酶活性和色素干扰。
[0006]本发明采用以下技术方案，一种双酶检测γ-氨基丁酸含量的方法，包括以下步骤:
[0007](I)在液氮下研磨待测样，加入醇，以钝化待测样中谷氨酸脱羧酶的活性；
[0008](2)进行真空干燥后，加入卤化镧，混匀，以沉淀水溶性酚类色素，离心，收集上清液；
[0009](3)向步骤(2)得到的上清液中加入碱，混匀，离心，收集γ-氨基丁酸提取液；
[0010](4)向步骤(3)所得提取液中加入NADP'Tris缓冲液和Y-氨基丁酸转氨酶-琥珀酸半醛脱氢酶双酶液，得到混合液；
[0011](5)使用紫外可见分光光度计测定步骤(4)得到的混合液在340nm波长处的初始值；
[0012](6)向步骤(4)得到的混合液加入α-酮戊二酸进行反应，测定反应液在340nm波长处的最终值；
[0013](7)绘制标准曲线，求得一次回归曲线，根据初始值、最终值和一次回归曲线，计算γ-氨基丁酸的含量。
[0014]进一步的，在步骤(I)中，待测样为植物组织或动物组织。
[0015]进一步的，在步骤(I)中，醇为甲醇、乙醇、正丙醇和正丁醇中的一种或几种；待测样与醇的质量比为1:4.0?1:8.0。
[0016]进一步的，在步骤(2)中，卤化镧为氟化镧、氯化镧、溴化镧和碘化镧中的一种或几种;待测样与卤化镧的质量比为1:0.2?1:2.0。
[0017]进一步的，在步骤(3)中，卤化镧与碱的摩尔比为1: 1.5?1: 3。
[0018]进一步的，在步骤(3)中，碱为氢氧化钠、氢氧化钾、碳酸氢钠和氨水中的一种或几种。
[0019]进一步的，在步骤⑷中，待测样与NADP+的质量比为1:0.005?1:0.3。
[0020]进一步的，在步骤⑷中，Tri s缓冲液的pH值为8.6，Tri s缓冲液浓度为0.2M，待测样与Tris缓冲液的质量比为1:0.05?1:2.82ο
[0021]进一步的，在步骤(4)中，γ-氨基丁酸转氨酶-琥珀酸半醛脱氢酶双酶液与待测样的质量比为1:1?1:10。
[0022]进一步的，在步骤(5)中，待测样与α-酮戊二酸的质量比为1:0.0016?1:0.094。
[0023]进一步的，在步骤(5)中，加入α-酮戊二酸后，反应时间为45-80分钟。
[0024]进一步的，标准曲线制作方法如下:
[0025]配制一系列不同浓度的GABA标准溶液，利用紫外可见分光光度计测定不同浓度的GABA标准溶液在波长340nm处的吸收，以光密度为纵坐标，浓度为横坐标建立标准曲线，求得一次回归曲线。
[0026]与现有技术相比，本发明的有益效果在于:本发明提供了一种双酶检测γ-氨基丁酸含量的方法，提供的检测方法快速简单而且准确，少受谷氨酸脱羧酶活性和色素干扰，对天然GABA资源的筛选和利用、人体GABA相关病症的准确诊断和治疗、了解植物代谢间的相互变化，尤其是植物对多种生物和非生物胁迫的响应具有重大的实用价值和指导意义。
【具体实施方式】
[0027]下面结合实施例对本发明技术方案作进一步的阐述。
[0028]首先制作标准曲线，标准曲线的制作方法如下:
[0029]称取一定量的GABA(来自SIGMA)配制200nmol GABA标准溶液。并以此为母液，配制O，40，80，120，160，200nmol 系列GABA标准溶液。吸取2.2ml 的GABA标准液，加入4mM的NADP+
0.6ml,0.2M的pH 8.6Tris缓冲液0.8ml，2U/ml的GABA转氨酶-琥珀酸半醛脱氢酶双酶液
0.2ml和20mM的α-酮戊二酸0.2ml。在加入α-酮戊二酸前后，利用紫外可见分光光度计，分别测定GABA标准溶液340nm波长处的初始值和最终值。并以光密度值为纵坐标，以浓度为横坐标，建立标准曲线，然后求得一次回归曲线方程:
[0030]Y = 0.9481X+0.004,R2 = 0.9956( X代表浓度，Y代表光密度，R2为一次回归曲线的确定系数)。
[0031]根据求得的一次回归曲线，以及待测样在340nm波长处的初始值和最终值，即可计算待测样中γ -氨基丁酸的含量。
[0032]实施例1
[0033](I)仪器
[0034]冷冻高速离心机;真空干燥器;紫外可见分光光度计。
[0035](2)试剂
[0036]pH 7.2磷酸钾缓冲液(0.1Μ);ρΗ 8.6的Tris缓冲液(0.2Μ) ;NADP+(4mM) ;α-酮戊二酸(20mM);丙三醇;β_巯基乙醇;GABA转氨酶-琥珀酸半醛脱氢酶双酶液(2U/ml，用0.1M的pH7.2磷酸钾缓冲液溶解，内含12.5 %丙三醇和5mM的β-巯基乙醇)；甲醇;氯化镧(80mM);KOH(IM)0
[0037](3)具体步骤
[0038]正常番茄植物新鲜叶片材料洗净吸干后，迅速放入液氮中，研磨得粉状固体，取0.4g粉状固体转入Eppendorf管中，加入1.6ml甲醇，以钝化谷氨酸脱羧酶；10分钟后，真空干燥2h。再加入4.01111浓度为8011^的氯化镧，以除去色素干扰。摇匀15分钟后，1300(^离心5分钟，收集上清液。吸取3.2ml上清液，加入到另一个Eppendorf管中，再加入0.64mL浓度为IM的Κ0Η，以沉淀过量的氯化镧，摇匀5分钟后，13000g离心5分钟，上清液即为GABA提取液。取5ml试管，分别加入2.2ml的GABA提取液，0.6ml浓度为4mM的NADP+，0.8ml浓度为0.2M的pH8.6Tris缓冲液，0.2ml浓度为2U/ml的GABA转氨酶-琥珀酸半醛脱氢酶双酶液和0.2ml浓度为20mM的α-酮戊二酸。在加入α-酮戊二酸之前测定340nm波长处的初始值，反应60分钟后，测定340nm波长处的最终值。根据初始值和最终值之差，求得一次回归曲线中的Y值，代入一次回归曲线(Y = 0.9481X+0.004，R2 = 0.9956)中，即可计算出X值，得到正常番茄植物新鲜叶片的GABA含量为1.50ymol/gFW。
[0039]实施例2
[0040](I)仪器
[0041 ]冷冻高速离心机;真空干燥器;紫外可见分光光度计。
[0042](2)试剂
[0043]pH 7.2磷酸钾缓冲液(0.1Μ);ρΗ 8.6Tris缓冲液(0.2Μ) ;NADP+(6mM) ;α-酮戊二酸(40mM);丙三醇;β_巯基乙醇;GABA转氨酶-琥珀酸半醛脱氢酶双酶液(4U/ml，用0.1M pH7.2磷酸钾缓冲液溶解，内含12.5 %丙三醇和5πιΜβ-巯基乙醇)；正丁醇；溴化镧(0.1Μ) ；NaOH(IM)0
[0044](3)具体步骤
[0045]受厌氧胁迫的水稻幼苗叶片洗净吸干后，迅速放入液氮中，研磨得粉状固体，取0.4g粉状固体转入Eppendorf管中，加入2.4ml正丁醇，以钝化谷氨酸脱羧酶；10分钟后，进行真空干燥。再加入4.0ml浓度为0.1M的溴化镧，除去色素干扰。摇匀15分钟后，13000g离心5分钟，收集上清液。吸取3.2ml上清液，加入到另一个Eppendorf管中，再加入浓度为IM的NaOH 0.76mL，以沉淀过量的溴化镧，摇匀5分钟后，13000g离心5分钟，上清液即为GABA提取液。取1ml试管，分别加入2.2ml的GABA提取液，0.6ml浓度为6mM的NADP+，0.8ml浓度为0.2M的pH8.6Tris缓冲液，0.2ml浓度为4U/ml的GABA转氨酶-琥珀酸半醛脱氢酶双酶液和0.2ml浓度为40mM的α-酮戊二酸。在加入α-酮戊二酸之前测定340nm处的初始值，反应45分钟后，测定340nm处的最终值。根据初始值和最终值之差，求得一次回归曲线中的Y值，代入一次回归曲线(Y = 0.9481X+0.004,R2 = 0.9956)中，即可计算出X值，得到受厌氧胁迫的水稻幼苗叶中 GABA 含量为 8.0Oymol/gFW。
[0046]实施例3
[0047](I)仪器
[0048]冷冻高速离心机;真空干燥器;紫外可见分光光度计。
[0049](2)试剂
[0050]pH 7.2磷酸钾缓冲液(0.1M);pH 8.6Tris缓冲液(0.2M) ;NADP+(8mM) ;α-酮戊二酸(60mM);丙三醇;β_巯基乙醇;GABA转氨酶-琥珀酸半醛脱氢酶双酶液(lU/ml，用0.1M pH7.2磷酸钾缓冲液溶解，内含12.5 %丙三醇和5πιΜβ-巯基乙醇)；乙醇；氯化镧(0.1Μ);NaHCO3(5Μ)0
[0051](3)具体步骤
[0052]白鼠大脑洗净吸干后，迅速放入液氮中，研磨得到粉状固体。取粉状固体0.4g转入Eppendorf管，加入3.2ml正丙醇。15分钟后，真空干燥;再加入4.0ml浓度为0.1M的氯化镧。摇勾20分钟后，13000g离心5分钟，收集上清液。在另一个Eppendorf管中加入3.2ml上清液和ImL浓度为5M的NaHCO3,沉淀过量的氯化镧，摇匀10分钟后，13000g离心5分钟，上清液即为GABA提取液。取15ml试管，分别加入2.2ml的GABA提取液，0.6ml的浓度为8mM的NADP+，
0.6ml浓度为0.2M的pH8.6Tris缓冲液，0.4ml浓度为lU/ml的GABA转氨酶-琥珀酸半醛脱氢酶双酶液和0.2ml浓度为60mM的α-酮戊二酸。在加入α-酮戊二酸之前测定340nm处的初始值，反应80分钟后，测定340nm处的最终值。根据初始值和最终值之差，求得一次回归曲线中的Y值，代入一次回归曲线(Y = 0.9481X+0.004，R2 = 0.9956)中，即可计算出X值，得到GABA的含量。白鼠大脑组织GABA含量为0.45mg/gFW。
[0053]由以上实施例可知，本发明的一种双酶检测γ-氨基丁酸含量的方法，方法简单、快速;避免了动植物组织中谷氨酸脱羧酶的活性和色素干扰;且分光光度法仪器成本低廉，操作方便，使得该方法有很大的应用前景。该检测法对天然GABA资源的筛选和利用、人体GABA相关病症的准确诊断和治疗、了解植物代谢间的相互变化，尤其是植物对多种生物和非生物胁迫的响应具有重大的实用价值和指导意义。
[0054]以上所述仅是本发明的优选实施方式，并不用于限制本发明，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和变型，这些改进和变型也应视为本发明的保护范围。
【主权项】
1.一种双酶检测γ -氨基丁酸含量的方法，其特征在于，包括以下步骤: (1)在液氮下研磨待测样，加入醇，以钝化所述待测样中谷氨酸脱羧酶的活性； (2)进行真空干燥后，加入卤化镧，混匀，以沉淀水溶性酚类色素，离心，收集上清液； (3)向步骤(2)得到的上清液中加入碱，混匀，离心，收集γ-氨基丁酸提取液； (4)向步骤(3)所得提取液中加入NADP+、Tris缓冲液和γ-氨基丁酸转氨酶-琥珀酸半醛脱氢酶双酶液，得到混合液； (5)使用紫外可见分光光度计测定步骤(4)得到的混合液在340nm波长处的初始值； (6)向步骤(4)得到的混合液加入α-酮戊二酸进行反应，测定反应液在所述340nm波长处的最终值； (7)绘制标准曲线，求得一次回归曲线，根据所述初始值、最终值和一次回归曲线，计算γ-氨基丁酸的含量。2.根据权利要求1所述的双酶检测γ-氨基丁酸含量的方法，其特征在于:在步骤(I)中，所述待测样为植物组织或动物组织。3.根据权利要求1所述的双酶检测γ-氨基丁酸含量的方法，其特征在于:在步骤(I)中，所述醇为甲醇、乙醇、正丙醇和正丁醇中的一种或几种;待测样与醇的质量比为1:4.0?1:8.0ο4.根据权利要求1所述的双酶检测γ-氨基丁酸含量的方法，其特征在于:在步骤(2)中，所述卤化镧为氟化镧、氯化镧、溴化镧和碘化镧中的一种或几种;所述待测样与卤化镧的质量比为1:0.2?1:2.0。5.根据权利要求1所述的双酶检测γ-氨基丁酸含量的方法，其特征在于:在步骤(3)中，所述卤化镧与碱的摩尔比为1: 1.5?1: 3。6.根据权利要求1所述的双酶检测γ-氨基丁酸含量的方法，其特征在于:在步骤(3)中，所述碱为氢氧化钠、氢氧化钾、碳酸氢钠和氨水中的一种或几种。7.根据权利要求1所述的双酶检测γ-氨基丁酸含量的方法，其特征在于:在步骤(4)中，所述待测样与NADP+的质量比为1: 0.005?1: 0.3;所述Tris缓冲液的pH值为8.6，Tris缓冲液浓度为0.2M，待测样与Tris缓冲液的质量比为1: 0.05?1: 2.82;所述γ _氨基丁酸转氨酶-琥珀酸半醛脱氢酶双酶液与待测样的质量比为1:1?1:10。8.根据权利要求1所述的双酶检测γ-氨基丁酸含量的方法，其特征在于:在步骤(5)中，所述待测样与α_酮戊二酸的质量比为1: 0.0016?1: 0.094。9.根据权利要求1所述的双酶检测γ-氨基丁酸含量的方法，其特征在于:在步骤(5)中，加入α_酮戊二酸后，反应时间为45-80分钟。
【文档编号】G01N21/33GK105866053SQ201610221748
【公开日】2016年8月17日
【申请日】2016年4月11日
【发明人】苏国兴
【申请人】苏州大学