一种解淀粉芽孢杆菌及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种解淀粉芽孢杆菌及其应用，属于微生物发酵技术领域。 技术背景
[0002] 柚苷酶是一种重要的用于果汁里苦味物质水解的酶，是由d-L-鼠李糖苷 酶（(1-1-1'11&1]111〇81(1&86，￡0 3.2.1.40)与6-0-葡萄糖苷酶（6-0-8111(3〇81(1&86, EC3. 2. 1. 21)组成的一种糖苷水解复合酶系，同时具有a-L-鼠李糖苷酶和0 -D-葡萄糖 苷酶两种酶的活性，柚苷酶可以作用于有苦味的柚皮苷并将其水解产生黄酮类物质，过程 是柚皮苷先在a-L-鼠李糖苷酶作用下生成鼠李糖及普鲁宁（Prunin，又译作樱桃苷)，普 鲁宁的苦味约为柚皮苷的三分之一，因此苦味有所减轻，然后普鲁宁可在3 -D-葡萄糖苷 酶的作用下被分解为无苦味的柚皮黄酮物质(主要为柚皮苷)。柚苷酶的微生物来源方面主 要集中在霉菌(黑曲霉和青霉等)，细菌产柚苷酶的相关报道较少。
[0003] 我国是柑橘生产大国，但是目前在柑橘果汁的加工行业主要问题就是果皮的深加 工利用问题。在被当作垃圾大量处理掉到的柑橘皮含有丰富的柚皮黄酮（主要为柚皮 苷），果胶，膳食纤维等，如能将其充分利用，不仅能够减轻环境压力，还可以造福于人类。 现代药理学研究发现，柚皮黄酮具有多种生理活性：可调节毛细血管的脆性与渗透性，保护 心脏，有抗溃疡、解毒、利尿、抗菌、消炎清热等功效，也是一种高效的天然抗氧化剂，是 一种天然的保健产品。因此柚皮的深加工将大幅提高果农的收入，提高柚子的附加值等。
[0004] 虽然对柚苷酶的研究越来越深入，但目前仅有少数柚苷酶的生产实现了工业化， 目前限制柚苷酶的大规模工业化应用方面存在两个问题：第一个主要问题是我国缺乏适 合工业化生产的高产酶菌株，这就极大限制了应用，高产柚苷酶菌株的培育困难之处在于 如何在大量的诱变后代中将优秀突变株高效率的选出，到目前为止尚无较好的办法，菌株 的选育进展缓慢，发展出新的高效的筛选方法很有必要，因此对高产菌株的培育是目前的 当务之急。第二个问题是柚苷酶的固定化技术在国内还存在着很多的缺陷，在固定化中使 用的试剂或载体存在成本偏高、固定化效率低下、稳定性较差、连续操作使用的设备较复杂 等，这就需要我们国家进一步开发出更简便同时更适用的固定化方法，柚苷酶应用于柑桔 及其他制品的脱苦与加工国外已有相关报道，但在我国柚苷酶并没有大规模的在生产中应 用，主要原因是国内尚无规模制备的商品柚苷酶出售，今后我们应加强关于选育高产柚苷 酶菌株的方法，并制备出低成本的柚苷酶纯酶，具有重要的实际意义。
[0005] 与霉菌(黑曲霉和青霉等）液体发酵产柚苷酶相比，细菌液体发酵生产柚苷酶具有 生长周期短、生产成本低、易于控制生长条件等诸多优点，近几年得到研究者更多的关注。 但是，细菌生产的柚苷酶活性和霉菌相比，还具有一定的差距；目前所报道细菌发酵产酶水 平不超过1000U单位每毫升发酵液；细菌发酵产柚苷酶最适作用温度偏中性环境可能限 制其在酸性环境中的部分应用。
[0006] 现有技术（本发明之前）所报道的解淀粉芽孢杆菌在植物病原真菌的生物防治方 面应用较多，但是未见解淀粉芽孢杆菌产柚苷酶的报道。
【发明内容】
[0007] 本发明通过创造性劳动，培养出了一种能够产柚苷酶的解淀粉芽孢杆菌。本发明 的解淀粉芽孢杆菌的液体发酵液中柚苷酶活力达到201. 12U/mL，纯化后柚苷酶总酶活力 可以达到10556U，比酶活力达15609U/mg;远高于本发明之前、由细菌和霉菌生产的柚苷酶 的酶活。另外，本发明的解淀粉芽孢杆菌的液体发酵液还含有柚皮苷和柚皮素；其中柚皮素 是黄酮类物质，具有降血压、解毒、利尿、抗菌等保健功效。本发明的解淀粉芽孢杆菌产的柚 苷酶，分子量为32. 5kDa，最适宜作用温度、pH分别为45°C、7. 5。本发明的解淀粉芽孢杆 菌产的柚苷酶与本发明之前的由细菌和霉菌生产的柚苷酶相比，存在以下特殊之处：从解 淀粉芽孢杆菌11568中产柚苷酶的部分酶学性质(最适pH和pH值稳定性、最适温度和温度 稳定性）等研究，表明其在产业化应用前景的果汁脱苦等领域有极大应用前景，在提高葡萄 酒的风味、改善饮料的香气成分和生产食品添加剂中也起到重要作用，对柚苷酶的分离纯 化及性质的研究为制备出更好的在工业上应用的商品酶提供重要依据。
[0008] 本发明的技术方案 本发明提供了一种新的解淀粉芽孢杆菌菌株。
[0009] 一 种解淀粉芽孢杆菌（Bacillusamyloliquefacines) 11568,其保藏号为 CGMCCNo. 9928,保藏日期为2014年11月4日，保藏单位是中国微生物菌种保藏管理委员会 普通微生物中心（CGMCC)。 本发明的解淀粉芽孢杆菌11568,其能够产柚苷酶。
[0010] 本发明还提供了解淀粉芽孢杆菌11568的一种新的应用。
[0011] 本发明的解淀粉芽孢杆菌11568在生产柚苷酶中的应用。
[0012] 具体的一种应用方法为： (1) 将本发明的解淀粉芽孢杆菌11568进行斜面培养，得斜面菌种； (2) 取斜面菌种接种到已灭菌的种子培养基中，在40. 9°C、180rpm的条件下发酵培养 48h，得液体发酵液； (3) 离心分离液体发酵液，取上清液； (4) 上清液经过硫酸铵分级沉淀、离子交换层析、SephacrylS-200凝胶过滤层析，得到 柚苷酶。
[0013] 所得柚苷酶为纯化倍数为38. 27的电泳纯柚苷酶；总酶活力可以达到10556U，t匕 酶活力达15609U/mg。所获得的柚苷酶的分子量为32. 5kDa，最适作用温度、pH分别为 45。。、7. 5。
[0014] 上述步骤（1)中，所述斜面培养基，每1L中含有以下成分：MgS04 0. 5g、KH2P04 1.5g、CaCl2 0.1g、（NH4)2S04 1.5g、KCl0.5g、KN03 1.5g、酵母膏 2g、桔皮粉 15g、琼脂 20g， pH为 6. 0,1X105Pa灭菌 20min。
[0015] 上述步骤（2)中，所述种子培养基，每1L中含有以下成分： 麦芽糖15.1§、胰蛋白胨1(^、（順4)2册0 4 2(^、恥(：11(^、酵母提取物5§411为7.51; 或者，柚皮苷l〇g、胰蛋白胨l〇g、（NH4)2HP04 20g、NaCl10g、酵母提取物5g，pH为 7. 51 ； 或者，MgS04 0.5g、KH2P04 1.5g、CaCl2 0.1g、（NH4)2S04 1.5g、KC1 0.5g、KN03 1.5g、 酵母膏2、桔皮粉7. 5g，pH为6. 0。
[0016] 上述步骤（3)中，液体发酵液经超声波破壁后离心分离；超声波频率为25-30Hz， 超声时间为l〇min，超声2. 5s，停2. 5s;离心的转速为5000 - 6000rpm，离心时间为10 - 15min〇
[0017] 上述步骤（4)中，在离子交换层析之后、凝胶过滤层析之前，用0.01-0. 5mol/L NaCl进行洗脱。
[0018] 所述步骤（4)中硫酸铵分级沉淀的具体步骤为：向上清液中加入硫酸铵，使其质 量体积浓度为〇. 01 % - 40%，过滤除去产生的沉淀，然后继续加入硫酸铵，至其质量体积 浓度为40% -80%为止，过滤得到含柚苷酶沉淀。所述的质量体积浓度是指：每mL上清液 中含有硫酸铵的质量（g)。
[0019] 所述步骤（4)中离子交换层析，是指QSepharoseFastFlow离子交换层析；其 具体步骤为：首先利用缓冲体系为20mmol/L，pH8. 5的Tris-HCl缓冲液平衡柱料；基线平 衡后加入目的蛋白液体量500微升，吸附时间为30min;吸附过后用0. 01-0. 5mol/L的NaCl 溶液进行梯度洗脱，流速设置为lmL/min，检测每管洗脱液中柚苷酶活力和蛋白质含量。其 中，梯度洗脱的具体操作为：设置洗脱程序用〇. 01-0. 5mol/L的NaCl溶液进行梯度洗脱，流 速设置为lmL/min，收集液体。
[0020] 所述步骤（4)中凝胶过滤层析的具体操作为：填好SephacrylS-200柱料；用 50mmol/LNaCl溶液（50mmol/L，pH7. 2磷酸缓冲液为溶剂)，流速0.lmL/min，平衡柱料；平 衡后以相同缓冲液洗脱，流速保持在〇.lmL/min，设置每管收集lmL;检测每管中柚苷酶活 力和蛋白质含量。其中，SephacrylS-200是层析柱的型号，不可用其他型号的层析柱代替。
[0021] 可采用盐酸、硫酸或磷酸中的一种或一种以上调节斜面培养基和种子培养基的 pH〇
[0022] 斜面培养和发酵培养的接种量可以通过现有技术得到，不需付出创造性的劳动。 斜面培养的接种量能够达到发酵培养所需接种量的种子液即可，发酵培养的接种量一般为 0? 2% (v/V)即可。
[0023] 本发明中，对于某个成分的含量的百分比，如果没有特别说明，均指重量百分比 (w/w)〇
[0024] 其中，对上述具体应用方法中的步骤（2)所获得的液体发酵液进行检测，检测结 果为：柚苷酶活力达到201. 12U/mL，纯化后柚苷酶总酶活力可以达到10556U，比酶活力达 15609U/mg。该液体发酵液中还含有柚皮苷、柚皮苷水解底物柚皮素。柚皮素是黄酮类物质， 具有降血压、解毒、利尿、抗菌等保健功效。
[0025] 所以，本发明还提供了一种解淀粉芽孢杆菌11568的液体发酵液。
[0026] 本发明所用专业术语说明： 1U是指每分钟分解1Ug柚皮苷底物所需要的柚苷酶量称为一个柚苷酶酶活。
[0027] 有益效果 首次分离培养出了能够产柚苷酶的解淀粉酶芽孢杆菌11568。
[0028] 本发明的解淀粉酶芽孢杆菌11568的液体发酵液中柚苷酶活力可以高达201. 12 U/mL〇
[0029] 本发明的柚苷酶，与本发明之前的柚苷酶相比，具备以下优势：最适pH