一种解淀粉芽孢杆菌及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于植物病害生物防治技术领域，特别是涉及一种解淀粉芽孢杆菌及其应 用。
【背景技术】
[0002] 西瓜枯萎病是一种由尖孢镰刀菌西瓜专化型（Fusarium oxysporum f. sp niveum F0N)引起的维管束土传病害，是西瓜产业中最普遍、危害最严重的病害之一，一般发病率为 10 % -30 %，严重的达80 % -90 %，重茬地甚至造成绝产。病原菌从土壤根系侵入，引起维管 束变褐坏死，导致瓜秧枯死，其厚垣孢子在土壤中可存活10年之久，严重影响西瓜的种植。 目前，对该病害尚无有效的防治方法，传统的轮作虽在一定程度上能减轻病害发生，但随着 市场对西瓜需求量的增长，西瓜种植面积逐年扩大，轮作防病措施难以实施。化学防治虽然 具有一定的防治效果，但是病原菌对化学药剂的抗性逐年增强，药剂用量不断提高。化学药 剂的长期大量使用，造成自然生态环境日益严重的污染。研究表明，在植物体内存在大量的 益生菌，已在多种植物体内分离筛选到防病效果明显的内生细菌，有些内生细菌还具有促 生、固氮等生物功能，是植物病害防治的重要资源，尤其对化学药剂难以控制的土传病害、 维管束病害及系统性病害发挥其独特的优势。因此，寻找防治西瓜枯萎病的拮抗微生物具 有重要意义。
[0003] 利用生防菌株防治植物病害在国内外均有报道，至今美国已有4种芽孢杆菌制备 的生防菌剂获得了生产许可证；经检索，申请者在现有的专利和非专利文献中检索到一些 关于解淀粉芽孢杆菌的文献报道和专利。例如，专利申请号为2013100328384公开了"一 种促生抑菌解淀粉芽孢杆菌、调理剂制备方法及应用"，报道多粘类解淀粉芽孢杆菌Pb-4对 番茄等作物有明显的促生和抑菌防病作用。专利申请号为201210342838X公开了"解淀粉 芽孢杆菌Bal68及其发酵培养方法和应用"，利用解淀粉芽孢杆菌Bal68制备菌剂，对尖孢 镰刀菌引起的白术根腐病、西洋参根腐病和三七根腐病等根腐病害具有很好的防治作用。 专利申请号为2014100362727公开了"解淀粉芽孢杆菌噻枯唑复配可湿性杀菌粉剂及其应 用"，利用解淀粉芽孢杆菌和噻枯唑复配可湿性杀菌粉剂，用于防治水稻细菌性条斑病和水 稻白叶枯病。但目前并没有对西瓜枯萎病菌、水稻纹枯病菌、核桃根腐病菌等重要植物病原 菌有拮抗作用的解淀粉芽孢杆菌的报道。
【发明内容】
[0004] 为改进现有防治技术的不足，本发明的目的在于提供一种解淀粉芽孢杆菌及其应 用，该解淀粉芽孢杆菌对西瓜枯萎病菌、水稻纹枯病菌、核桃根腐病菌等多种病原菌具有显 著的拮抗作用。
[0005] 本发明第一方面提供了一种解淀粉芽孢杆菌，其于2015年5月15日保藏于武 汉大学中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC M 2015299,命名为解淀粉芽孢杆菌 (Bacillus amyloliquefaciens)XK_2〇
[0006] 解淀粉芽孢杆菌XK-2的菌学特性：
[0007] a、形态特征：ΧΚ-2为革兰氏阳性菌，呈杆状，芽孢椭圆，在LB平板上形成的菌落成 圆形，边齐，稍隆起，湿润，有光泽，乳白色，半透明。
[0008] b、生理生化特征：水解淀粉，周生鞭毛，氧化酶阴性，接触酶阳性。
[0009] 解淀粉芽孢杆菌XK-2的16S rDNA序列如序列表SEQ ID No. 1所示，与Genbank 上已报道序列进行比对，最终确定菌株Hi-2为解淀粉芽孢杆菌。
[0010] 本发明第二方面提供了解淀粉芽孢杆菌)(Κ-2在抑制西瓜枯萎病菌、水稻纹枯病 菌、核桃根腐病菌中的应用。
[0011] 本发明第三方面提供了解淀粉芽孢杆菌)(Κ-2的筛选方法，具体步骤包括：
[0012] (1)从西瓜植株的根部中分离芽孢杆菌；
[0013] (2)用平板对峙法从步骤（1)分离的芽孢杆菌中筛选出对西瓜枯萎病菌有抑菌作 用的菌株。
[0014] 本发明第四方面提供了一种解淀粉芽孢杆菌}(Κ-2菌剂，所述菌剂为解淀粉芽孢 杆菌)(Κ-2经活化、种子培养、发酵后得到的菌剂。
[0015] 本发明的有益效果是：（1)解淀粉芽孢杆菌ΧΚ-2是一株西瓜内生菌株，对人、畜、 农作物安全，对环境友好。
[0016] (2)本发明的解淀粉芽孢杆菌)(Κ-2具有较广的抑菌谱，对常见的土传病原菌，西 瓜枯萎病菌（Fusarium oxysporum)、水稻纹枯病菌（Rhizoctonia solani)、核桃根腐病菌 (Fusarium solani)等菌丝生长均具有较好的抑制效果，其中对西瓜枯萎病菌和水稻纹枯 病菌的抑菌率达80%以上。
[0017] (3)本发明的解淀粉芽孢杆菌)(K-2菌剂对西瓜枯萎病具有显著的防治效果，盆栽 防治效果达75. 8%，对西瓜枯萎病菌菌丝生长有明显抑制作用，使菌丝生长缓慢，出现末端 细小，扭曲，崩溃等畸形症状，且生产周期短，工艺简单，在植物病害的生物防治中具有十分 广阔的应用前景。
【附图说明】
[0018] 图1为解淀粉芽孢杆菌ΧΚ-2在LB固体培养基上生长的菌落形态；
[0019] 图2为解淀粉芽孢杆菌)(Κ-2对西瓜枯萎病菌的拮抗作用示意图；
[0020] 图3为解淀粉芽孢杆菌)(Κ-2对水稻纹枯病菌的拮抗作用示意图；
[0021] 图4为解淀粉芽孢杆菌)(Κ-2对核桃根腐病菌的拮抗作用示意图；
[0022] 图5为解淀粉芽孢杆菌ΧΚ-2对西瓜枯萎病菌菌丝生长的致畸作用示意图，其中， A为未经解淀粉芽孢杆菌ΧΚ-2处理的对照组，B为经解淀粉芽孢杆菌ΧΚ-2处理的实验组。
【具体实施方式】
[0023] 本发明第一方面提供了一种解淀粉芽孢杆菌，其于2015年5月15日保藏于武汉 大学中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC M 2015299,命名为解淀粉芽孢杆菌ΧΚ-2。
[0024] 所述解淀粉芽孢杆菌ΧΚ-2的16S rDNA序列如SEQ ID No. 1所示。
[0025] 本发明第二方面提供了解淀粉芽孢杆菌)(K-2在抑制西瓜枯萎病菌、水稻纹枯病 菌、核桃根腐病菌中的应用。
[0026] 本发明第三方面提供了解淀粉芽孢杆菌)(K-2菌株的筛选方法，具体步骤包括：
[0027] (1)从西瓜植株的根部中分离芽孢杆菌；
[0028] (2)用平板对峙法从步骤（1)分离的芽孢杆菌中筛选出对西瓜枯萎病菌有抑菌作 用的菌株。
[0029] 优选的，步骤（1)所述西瓜植株的根部经过酒精浸泡、升汞浸泡、无菌水漂洗后， 加入无菌水进行研磨，混合均匀制为悬浮液。所述分离芽孢杆菌是将悬浮液稀释后涂布于 LB平板，28-30°C下培养23-26h，挑取芽孢杆菌单菌落；步骤（2)所述筛选为将西瓜枯萎病 菌接种在PDA平板中心，将步骤（1)所得细菌呈三角状对称接入PDA平板，距离中心l-3cm， 28°C下培养，得到有抑菌作用菌株，转入LB平板上培养保存。
[0030] 本发明第四方面提供了一种解淀粉芽孢杆菌)(K-2菌剂，所述菌剂为解淀粉芽孢 杆菌)(Κ-2经活化、种子培养、发酵后得到的菌剂。
[0031] 优选的，所述活化为将解淀粉芽孢杆菌)(Κ-2菌株接种于培养基中，于28-30°C下 培养 20-24h。
[0032] 更加优选的，所述培养基为LB固体培养基，其配置方法为酵母提取物5g，胰化蛋 白胨l〇g，氯化钠 l〇g，琼脂粉20g，用NaOH调pH至7. 0-7. 2,于121°C下高压灭菌20min。
[0033] 优选的，所述种子培养为将经活化后的解淀粉芽孢杆菌)(K-2菌株接种于培养基 中，于 28-30°C、115-125r/min 下振荡培养 20-24h。
[0034] 优选的，所述发酵为将经种子培养后的解淀粉芽孢杆菌)(K-2菌株以5%的接种比 例接种于培养基中，于28-30°C、115-125r/min下振荡培养40-44h。
[0035] 更加优选的，所述培养基为LB液体培养基，其配置方法为酵母提取物5g，胰化蛋 白胨10g，氯化钠10g，用NaOH调pH至7. 0-7. 2,于121°C下高压灭菌20min。
[0036] 优选的，所述解淀粉芽孢杆菌XK-2菌剂稀释至有效成分含量 1.0 X IO6-L OX 10scfu/mL后使用，用于抑制西瓜枯萎病菌、水稻纹枯病菌、核桃根腐病菌。
[0037] 下面将结合实施例对本发明提供的一种解淀粉芽孢杆菌及其应用予以进一步说 明。
[0038] 实施例1
[0039] -、解淀粉芽孢杆菌)(K-2的获得与鉴定，及其对西瓜枯萎病菌、水稻纹枯病菌、核 桃根腐病菌拮抗作用的测试。
[0040] 本实施例所述西瓜枯萎病菌、水稻纹枯病菌、核桃根腐病菌由长江大学农学院植 物病理学研究室提供，其它方式获得的西瓜枯萎病菌、水稻纹枯病菌、核桃根腐病菌也适用 于本发明。
[0041] 分离：从湖北荆州周边西瓜种植田块中采集长势旺盛的西瓜植株，取其幼嫩的根 部，用清水洗净，剪成Icm左右的小段，置于灭菌的培养皿中，用75 %酒精浸泡50s，再用 0. 1%升萊浸泡30s，然后无菌水漂洗4次。置于灭菌的研钵中，加入少许无菌水，研磨，取研 磨后的菌液lmL，加到盛有9mL无菌水的试管中，振荡混勾，制成样品悬浮液。取ImL样品悬 浮液加入盛有9mL无菌水的试管中依次进行10倍系列稀释，分别取10 6、10 7、10 8的稀释液 50 μ L涂布于LB平板，置于28 °C培养24h。根据形态、大小、色泽等特点，共挑取单菌落236 株，转接于LB平板上培养，保存备用。
[0042] 筛选：将西瓜枯萎病菌接种在PDA平板中心，用灭菌的牙签将上述分离纯化的细 菌呈三角状对称接入PDA平板，距离中心约2cm，28°C培养观察对峙培养抑菌情况。将抑菌 作用明显的菌株)《-2转入LB平板上培养，保存备用，解淀粉芽孢杆菌)(K-2在LB固体培养 基上生长的菌落形态见附图1，解淀粉芽孢杆菌ΧΚ-2在LB平板上形成的菌落成圆形，边齐， 稍隆起，湿润，有光泽，乳白色，半透明。所述PDA培养基的配制方法为：马铃薯200g，葡萄 糖20g，琼脂18g，补足蒸馏水至lOOOmL，121°C湿热灭菌20min。
[0043] 鉴定：对筛选的菌株XK-2进行生理生化鉴定，确定为芽孢杆菌属，然 后提取菌株的总基因组DNA为模板扩增其16S rDNA序列。所用正向和反向引 物分别为 27F:5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'，即序列表 SEQ ID No.2;1429R: 5' -GGTTACCTTGTTACGACTT-3'，即序列表 SEQ ID No. 3。PCR 反应体系为 15 μ L 反应体系， 包括：DNA 模板 0· 6 μ L ;Η20 8. 57 μ L !buffer 1. 65 μ L ;Mg2+2. 75 μ L ;dNTP 0· 66 μ L ;27F : 0.33yL;1429R 0.33yL;Tsg O.llyL。PCR 反应程序为：94Γ3π?η;94Γ3〇8,5〇Γ458， 72°C 100s，35个循环；72°C 7min。回收并纯化PCR产物，测序，根据测序结果将菌株XK-2鉴 定为解淀粉芽孢杆菌。
[0044] 进一步的，