专利名称：转芽孢杆菌源α-淀粉酶基因重组乳酸杆菌及制品和应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种基因重组技术，特别是一种转芽孢杆菌源α -淀粉酶基因重组乳酸杆菌及制品和应用。
背景技术：
众所周知，动物的生长是依赖于营养丰富的饲料，而动物的生长速度的快慢是取决于动物对饲料的消化利用率，而饲料的消化利用率又取决于其消化道内的消化酶的多少，因为饲料中的营养物质大多都是以高分子形式存在的，所以必须有相应的酶将其降解后方能被肠道吸收利用，因此肠道消化酶的多少对于动物的生长、料肉比和经济效益至关重要。目前，很多消化酶如淀粉酶、纤维素酶、蛋白酶等已被开发，在饲料中也有广泛的应用。而在饲料成分中，淀粉是其中最主要的营养物质之一，所以淀粉在肠道中的分解率在很大程度上影响着动物的生长速度。因此研究淀粉酶以适当的形式应用于动物生产具有重要的实践意义。淀粉酶是α -淀粉酶、β -淀粉酶及葡糖淀粉酶的总称，由于淀粉酶在工业、农业和畜牧业上应用广泛，因此，在酶家族中它是非常重要的一种酶。淀粉酶的来源很广泛，可以来自于植物、动物以及微生物。大部分的α-淀粉酶存在于微生物中，α-淀粉酶是胞外酶，可以随机的切断线状直链淀粉链中连接相邻的两个葡萄糖单位的1，4-α_糖苷键。 β -淀粉酶主要来源于植物，但也有少部分微生物产生，它是在外面起作用的酶，可以分解直链淀粉、支链淀粉以及糖原分子的非还原性末端链，它可以水解交替的糖苷键，产生麦芽糖。葡糖淀粉酶可以水解单个的葡萄糖。α-淀粉酶已经从多种细菌、真菌和酵母中分离获得。由于细菌淀粉酶具有多种优良的特性，因此，细菌淀粉酶应用比较多，其中曲霉和杆菌， 特别是淀粉液化芽孢杆菌已用于工业化生产。在动物养殖业中，从某种程度上，淀粉酶主要被用作消化助剂，补充面粉的糖化活性，改善一些动物饲料的可消化性。淀粉酶存在于单胃动物的消化道内，由动物的消化道自身分泌。但是幼禽幼畜消化机能尚未发育健全，淀粉酶分泌量往往不足，而且动物年老时消化酶分泌能力降低，另外动物在受到应激或疾病感染后引起消化酶分泌紊乱(McTigue MA et al. The alkaline amylase of the alkalophilic Bacillus sp. IMD 370. Enzyme and Microbial Technology, 1995，20 (17): 45 47)。由于消化酶的分泌不足，大量的饲粮无法被顺利的消化吸收，较多的饲粮进入后肠发生腐败分解，引起大肠杆菌等有害菌群增殖，产生多量的胺类毒性物质，对肠壁组织造成损伤，使肠道蠕动加快和分泌增加， 造成腹泻。在这些情况下，在其日粮中添加外源淀粉酶，不但能补充体内内源酶的不足，而且能激活内源酶的分泌，增强动物对饲料养分的消化吸收能力，明显提高饲料利用率，同时无毒、无副作用、无残留(Yasuji Minoa et al. Developments in the use of Bacillus species for Industrial production. Canadian Journal of Microbiology, 2004， 23(2): 1-17)。20世纪90年代初，我国开始淀粉酶制剂的研究与应用，在短短十几年的时间里，淀粉酶已被逐步应用到畜、禽、水产动物等各个养殖领域，具有显著增强消化功能、提高饲料利用率、促进生长、提高动物的生产性能等功效(刘庆华等，添加淀粉酶与复合酶对蛋种鸡生产性能及养分利用率的影响.西北农林科技大学学报(自然科学版)，2010，8: 23-25)。但是自然分离的菌株往往α -淀粉酶酶活不是很高，很难直接用于工业化生产或作为添加剂使用，所以一般要对野生型菌株进行改造，如通过诱变育种、构建基因工程菌和基因突变，使α-淀粉酶能够在特定的宿主菌中表达，而且产酶量也大大提高。随着分子生物学和基因工程技术的不断完善，通过基因工程技术改造菌株已成为一种广泛应用的手段。目前，世界上一些大的酶制剂公司生产酶制剂的菌种50%是基因工程菌。最大的酶制剂生产商丹麦诺维信公司，生产酶制剂的菌种80%是基因工程菌。在国内，很多企业还处于传统诱变菌种生产酶制剂的落后状态。Richardson等利用高通量筛选方法从构建的a_淀粉酶基因文库中筛选到3株耐酸(低pH值4. 5)耐高温(105°C )的不依赖Ca2+高性能菌株，又利用基因重组技术、鉴定与优化评价构建了一个稳定、高产、耐酸、耐高温的重组酶蛋白。刘逸寒等(刘逸寒等.耐酸性高温淀粉酶突变基因在大肠杆菌中的表达及酶学性质研究.食品与发酵工业，2007，33 O) :36-41)将去信号肽的耐酸性高温a_淀粉酶突变基因克隆到大肠杆菌表达载体pET-30a上并实现高效表达，表达量达到141 mg / L，重组酶比活达到354. 6U / mg蛋白。王磊等(王磊等.耐高温淀粉酶基因在枯草杆菌染色体上的整合、扩增及表达的研究.工业微生物，1998,^(1):7-1 进行了耐高温a_淀粉酶基因在枯草杆菌染色体上的整合、扩增及表达的研究。通过构建一套整合载体，将来自嗜热脂肪芽胞杆菌的耐高温a-淀粉酶基因以及质粒pC194上的一段Cm抗性基因随机整合至枯草杆菌1A289染色体上，通过提高整合菌的抗氯霉素能力和反复进行整合，提高耐高温淀粉酶基因在染色体上的拷贝数，最终a-淀粉酶基因在染色体上的拷贝数由整合初的1个增至 7个以上，在无选择压力情况下，产酶220U / mL。乳酸杆菌是近年发展起来的一种最具发展潜力的细菌表达系统，因为乳酸杆菌具有太多的优点(1)乳酸杆菌在人类已经有上千年的应用历史，是唯一一个没有致病性的菌种，是一种公认的具有GRAS(Generally Regarded As Safe)有益微生物。(2)乳酸杆菌菌体本身就对机体有益生作用，其分泌多种物质更是机体必不可少的，若再在其载体上克隆入外源目的基因，这样就可集菌体、自泌物质和外源蛋白于一体；C3)若选择非抗性标记，则该表达系统中的菌体、选择性标记、诱导物均为食品级，为生产绿色安全的食品提供了可會邑(Maria J G et al. Integrative food-grade expression system based on the lactose regulon of lactobacillus casei. Applied and Environmental Microbiology, 2000,66(11): 4822^4828) ； (4)它在人和动物体内占绝对优势，以它为表达系统作为口服益生菌，较其它菌株更易达到较高的表达量(Sch印pier L, Vogel Μ, Zuercher A W, et al. Recombinant Lactobacillus johnsonii as a mucosal vaccine delivery vehicle. Vaccine. 2002 20 (23-24) : 2913-2920) ; (5)乳酸杆菌不具有内在免疫原性; (6)乳酸杆菌对机体粘膜有极强的粘附作用，因此构建的乳酸杆菌基因工程菌就可在粘膜处不断繁殖，持续向机体释放目的蛋白。因此乳酸杆菌表达系统近年来得到了较快的发展，如使乳酸杆菌携带赖氨酸、蛋氨酸等基因，通过直接饲喂乳酸杆菌可减少向饲料中添加相应的物质，从而可降低饲料成本。Hashiba等(Hashiba H et al. Establishment of a host-vector system in Lactobacillus helveticus with β -galactosedase activityas a selection marker. Biosci Biotechnol Biochem, 1992，50:190 194)将Bacillus. Licheniformis的α -淀粉酶结构基因插入pBGlO的红霉素抗性基因启动子区下游，在 L. helveticus SBT2195 巾Pouwels · (Kaniitiffli K et al. Isolation
and characterization of acidocin A and cloning of the bacteriocin gene from Lactobacillus acidophilus. Appl Environ Microbiol, 1995, 61:1061 1067)也成功地构建了携带乳酸杆菌L-1 dh基因强启动子和Lactoamy 1 οvorus淀粉酶基因的调节启动子的表达和分泌载体。另外如胰岛素酶、蛋白酶、葡聚糖酶、脂酶和细菌素等外源基因都已在乳酸杆菌中得到了表达。另外一个重要的用途就是作为抗原呈递载体，从而实现疫苗的□月艮免疫。Zegers 等(Zegers N D et al. Expression of the protective antigen of bacillus antracis by Lactobacillus Casei: towards the development of an oral vaccine against anthrax. J Appl Microbiol, 1999，87:309 314)禾口 Maassen 等(Maassen C B M et al. Instruments for oral disease-intervention strategies: recombinant Lactobacillus Casei expressing tetanus toxin fragment C for vaccination or myelin proteins for oral tolerance induction in multiple sclerosis. Vaccine, 1999, 17(25) : 2117 2128)利用乳酸杆菌作为疫苗载体，携带表达外源抗原，通过粘膜免疫动物，可诱发抗感染免疫。Pouwels等(Pouwels P H et al. Lactic acid bacteria as antigen delivery vehicles for oral immunization purposes. Int J food Microbiol, 1998,41 ) :155 167)则构建了乳杆菌的一系列表达载体，用于表达破伤风毒素C片段、幽门螺杆菌脲酶A和B亚单位等抗原。他还用pLPCR2载体表达两个并列重复口蹄疫病毒和大肠杆菌β-半糖苷酶基因的融合蛋白，在干酪乳杆菌中融合蛋白的表达大约为细胞总蛋白的0. 1%。实验发现，外源抗原基因表达于细胞内或细胞表面，均能诱发针对该抗原的全身和局部粘膜免疫反应；通过口服、鼻粘膜或腹腔注射等途径接种，也均可引起有效的免疫应答。更有意义的是，法国和巴西已于2000年联手开展在乳酸杆菌中表达rotavirus的抗原基因，然后用重组的乳酸杆菌发酵生产酸奶，来预防儿童轮状病毒性腹泻。近年来国内也相继开展了这方面的工作，何召庆等(何召庆，秦泽荣，徐镔蕊， 等.降钙素基因在乳酸杆菌中的克隆.中国兽药杂志，2002，36 (6) :20-22)将鲑降钙素基因克隆并表达在乳酸杆菌质粒pW425t中，然后转化到ThyA基因缺陷的乳酸杆菌中表达。王春凤等(王春凤等.柔嫩艾美尔球虫S07基因在乳酸杆菌中的表达.自然科学进展.王春凤等.饲喂转球虫基因功能乳酸杆菌后对雏鸡体重的影响.畜牧兽医学报，2002，33(6) 591-593)在质粒pW425t中成功地表达了鸡球虫S07基因，将该重组的乳酸杆菌给刚出壳的雏鸡饲喂，一周后攻球虫卵囊5 X 105个/只，通过测定试验雏鸡的体重未发生变化，表明了基因工程乳酸杆菌的有效性。这些结果都证明重组乳酸杆菌是一种良好的口服载体，无论是让其携带促生长的酶蛋白还是抗原蛋白都能在体内显示其具有诱人的应用前景。
本发明是利用PCR技术从淀粉液化芽孢杆菌基因组中扩增出淀粉酶amy基因和从短小乳杆菌基因组中扩增出信号肽sp基因，构建了含有sp基因和_y基因的重组表达质粒pllac-sp-amy，通过电转化整合到了乳酸杆菌的基因组上，并实现了稳定表达，从而获得了能够分泌表达淀粉酶的重组乳酸杆菌。该重组乳酸杆菌可以应用于饲料中富含淀粉的动物生产中，尤其是对初生仔猪和雏鸡，对于提高生长速度、降低料肉比、增加经济效益等具有重要的意义。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种转芽孢杆菌源a_淀粉酶基因重组乳酸杆菌，以及该重组乳酸杆菌的制品及应用。通过提供一种能够分泌表达淀粉酶的基因工程乳酸杆菌，巧妙设计将乳酸杆菌的信号肽基因与芽孢杆菌的淀粉酶基因重组到乳酸杆菌的表达载体上，再电转化整合到乳酸杆菌，研制成能特异表达淀粉酶的重组乳酸杆菌，作为益生菌活菌饲料添加剂用于动物的生产。为了实现解决上述技术问题的目的，本发明采用了如下技术方案
一种转芽孢杆菌源a-淀粉酶基因重组乳酸杆菌，其特征是该转芽孢杆菌源淀粉酶基因重组乳酸杆菌是将a-淀粉酶基因和信号肽基因连接后插入到乳酸杆菌表达载体 Pllac的多克隆位点，然后再将其整合到干酪乳杆菌L. CECT5276的核糖体结合位点中获得的产品；所述的α —淀粉酶基因来源于GenBank上的登陆号为⑶591658的淀粉液化芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens, ATCC 23842)，所用于扩增的序列是 l_1545bp 位碱基；信号肽基因来源于在GenBank上的登陆号为Z14250的短小乳酸杆菌Z. brevisl. 2028, 所用于扩增的序列是260-349bp位的碱基。本发明的一种转芽孢杆菌源a-淀粉酶基因重组乳酸杆菌，所述的α —淀粉酶的 DNA序列，其包含如下序列或经修饰的序列，所述修饰不改变所编码的氨基酸序列
ATGATTCAAAAACGAAAGCGGACAGTTTCGTTCAGACTTGTGCTTATGTGCACGCTCTTA60TTTGTCAGTTTGCCGATTACAAAAACATCAGCTGTAAATGGCACGCTGATGCAGTATTTT120GAATGGTATACGCCGAACGGCGGCCAGCATTGGAAACGATTGCAGAATGATGCGGAACAT180TTATCGGATATCGGAGTCACTGCCGTCTGGATTCCTCCCGCATACCAAGGATTGAGCCAA240TCCGATCACGGATACGGACCTTATGATTTGTATGATTTAGGAGAATTCCAGCAAAAAGGG300ACGGTCAGAACGAAATACGGCACAAAATCAGACCTTCAAGATGCGATCGGCTCACTGCAT360TCCCGGAACGTCCAAGTATACGGAGATGTGGTTTTGAATCATAAGGCTGGTGCTGATGCA420GCAGAAGATGTAACTGCCGTCGAAGTCAATCCGGCCAATAGAAATCAGGAAACTTCGGAG480GAATATCAAATCAAAGCGTGGACGGATTTTCGTTTTCCGCGCCGTGGAAACACGTACAGT540GATTTTAAATGGCATTGGTATCATTTCGACGGAGCGGACTGGGATGAATCCCGGAAGATC600AGCCGCATCTTTAAGTTTCGTGGGGAAGGAAAAGCGTGGGATTGGGAAGTATCAAGTGAA660AACGGCAACTATGACTATTTAATGTATGCTGATGTTGACTACGACCACCCTGATGTCGTG720GTAGAGACAAAAAAATGGGGTATCTGGTATGCGAATGAACTGTCATTAGACGGCTTCCGT780ATTGATGCCGCCAAACATATTAAATTTTCATTTCTGCGTGATTGGGTTCAGGCGGTCAGA840CAGGCGACGGGAAAAGAAATGTTTACGGTTGCGGAGTATTGGCAGAATAATGCCGGGAAA900CTCGAAAACTACTTGAATAAAACAAGCTTTAATCAATCCGTGTTTGGTGTTCCGCTTCAT960TTCAATTTACAGGCGGCTTCCTCACAAGGAGGCGGATATGATATGAGGCGTTTGCTGGAC1020GGTACCGTTGTGTCCAGGCATCCGGAAAAGGCGGTTACATTTGTTGAAAATCATGACACA1080CAGCCGGGACAGTCATTGGAATCGACAGTCCAAACTTGGTTTAAACCGCTTGCATACGCC1140TTTATTTTGACAAGAGAATCCGGTTATCCTCAGGTGTTCTATGGGGATATGTACGGGACA1200AAGGGGACATCGCCAAAGGAAATTCCCTCACTGAAAGATAATATAGAGCCGATTTTAAAA1260GCGCGTAAGGAGTACGCATACGGGCCCCAGCACGATTATATTGAGCACCCGGATGTGATC1320GGATGGACGA GGGAAGGTGA CAGCTCCGCC GCCAAATCAG GTTTGGCCGC TTTAATCACG 1380 GACGGACCCG GCGGATCAAA GCGGATGTAT GCAGGCCTGA AAAATGCCGG CGAGACATGG 1440 TATGACATAA CGGGCAACCG TTCAGATACT GTAAAAATCG GATCTGACGG CTGGGGAGAC 1500 TTTCATGTAA ACGATGGGTC CGTCTCCATT TATGTTCAGA AATAA1545
乳酸杆菌(LactcAacillus brevis 1.2028)信号肽基因，序列如下 ATGCAATCAA GTTTAAAGAA ATCTCTTTAC TTGGGCCTTG CCGCATTGAG CTTTGCTGGT 60 GTTGCTGCCG TTTCAACGAC TGCTTCAGCT90
将α —淀粉酶基因和信号肽基因插入到乳酸杆菌的表达载体Pllac的NdeI和SmaI 位点，然后将其整合到干酪乳杆菌L. CECT5276中，得到转芽孢杆菌源a-淀粉酶基因重组乳酸杆菌。进一步的，所述的重组乳酸杆菌含有表达质粒pllac-sp-amy，重组表达质粒pilac-sp -amy含有乳酸杆菌复制子ori、核糖体结合位点RBS、操纵子Iac、 乳酸杆菌信号肽基因(signal peptide, sp)、淀粉酶基因(amylase，amy)、核糖体结合位点RBS和抗性筛选基因红霉素Ery (erythromycin, Ery)基因，其表达式为-ori-RBS-lac-sp-amy-RBS-Ery-o利用本专利所述的转芽孢杆菌源a_淀粉酶基因重组乳酸杆菌，可以制备含上述转芽孢杆菌源a-淀粉酶基因重组乳酸杆菌菌种发酵形成的液态、固态产品。所述转芽孢杆菌源a_淀粉酶基因重组乳酸杆菌可以在制备仔猪饲料中的得到应用。重组乳酸杆菌可以作为一种口服饲料添加剂应用于养猪业，可以补充猪尤其是仔猪肠道淀粉酶不足，具有促进饲料的消化，提高料重比，增加经济效益的作用。此外，宿主菌乳酸杆菌是一种干酪乳杆菌，其本身对动物机体也有益生功能，因此本发明是提供了一种人工产淀粉酶益生基因工程乳酸杆菌，在仔猪生产中具有重要的应用价值。本专利的一种转芽孢杆菌源a_淀粉酶基因重组乳酸杆菌的构建方法，包括使用一种淀粉液化芽孢杆菌基因组和一种来自乳酸杆菌的信号肽，将淀粉液化芽孢杆菌基因和来自乳酸杆菌的信号肽基因插入到乳酸杆菌的表达载体Pllac的NdeI和SmaI位点，然后将其整合到干酪乳杆菌L. CECT5276中，得到转芽孢杆菌源a-淀粉酶基因重组乳酸杆菌；其详细的工艺如下
一、α 一淀粉酶基因引物获得和淀粉液化芽孢杆菌基因组的提取，包括步骤1-4:
1、α一淀粉酶基因引物由中美泰和生物技术(北京)有限公司合成，引物序列如下 上游引物 P1 5，- GCTCTAGATATATGTTACAATTGAAGTGCA-3，(XbaI 位点为 “ TCTAGA”)； 下游引物 Ρ2: 5’ - AACCCGGGGTTTATTTTCCGCTTCT-3’(SmaI 位点为 “CCCGGG”)；
2、淀粉液化芽孢杆菌基因的提取
将活化的淀粉液化芽孢杆菌培养1 后，取3ml菌液，然后参照北京艾德莱生物科技有限公司的细菌基因组DNA快速提取试剂盒(离心柱型)提取其基因组DNA，方法按使用说明书步骤进行；
3、α一淀粉酶amy基因的PCR扩增
以步骤2提取的基因组DNA为模板，扩增淀粉液化芽孢杆菌的α —淀粉酶基因，反应体系如下
表1 α —淀粉酶基因PCR扩增体系
权利要求
1.一种转芽孢杆菌源a-淀粉酶基因重组乳酸杆菌，其特征是该转芽孢杆菌源a-淀粉酶基因重组乳酸杆菌是将a-淀粉酶基因和信号肽基因连接后插入到乳酸杆菌表达载体 Pllac的多克隆位点，然后再将其整合到干酪乳杆菌L. CECT5276的核糖体结合位点中获得的产品；所述的α —淀粉酶基因来源于GenBank上的登陆号为⑶591658的淀粉液化芽孢杆菌，所用于扩增的序列是l_1545bp位碱基；信号肽基因来源于在GenBank上的登陆号为 Z14250的短小乳酸杆菌Z. brevisl. 2028，所用于扩增的序列是^0_349bp位的碱基。
2.根据权利要求1所述转芽孢杆菌源淀粉酶基因重组乳酸杆菌，其特征是所述的重组乳酸杆菌含有表达质粒pilac-sp-amy，重组表达质粒pilac-sp -amy含有乳酸杆菌复制子ori、核糖体结合位点RBS、操纵子lac、乳酸杆菌信号肽基因(signal peptide, sp)、淀粉酶基因(amylase，amy)、核糖体结合位点RBS和抗性筛选基因红霉素 Ery (erythromycin, Ery)基因，其表达式为-ori-RBS-lac-sp-amy-RBS-Ery-o
3.权利要求1所述转芽孢杆菌源淀粉酶基因重组乳酸杆菌菌种发酵形成的液态、固态广品。
4.权利要求1所述转芽孢杆菌源淀粉酶基因重组乳酸杆菌在制备仔猪饲料中的应用。
全文摘要
本发明介绍了一种转芽孢杆菌源a-淀粉酶基因重组乳酸杆菌及其制品及应用，将a-淀粉酶基因和信号肽基因连接后插入到乳酸杆菌表达载体pIlac的多克隆位点，再将其整合到干酪乳杆菌L.CECT5276的核糖体结合位点中；α－淀粉酶基因为GU591658的淀粉液化芽孢杆菌，所用于扩增的序列是1-1545bp碱基；信号肽基因为Z14250的短小乳酸杆菌L.brevis1.2028，所用于扩增的序列是260-349bp碱基。该重组乳酸杆菌可以应用于饲料中富含淀粉的动物生产中，尤其是对初生仔猪和雏鸡，对于提高生长速度、降低料肉比、增加经济效益等具有重要的意义。
文档编号C12R1/245GK102363762SQ20111028338
公开日2012年2月29日 申请日期2011年12月5日 优先权日2011年12月5日
发明者丁轲, 余祖华, 周变华, 孔涛, 王国永, 白东英, 赵振升, 钟社普 申请人:河南科技大学