淡紫紫孢菌及其协同生物质修复污染水体重金属的方法与流程

本发明属于环境微生物
技术领域：
，尤其涉及一株淡紫紫孢菌及其协同生物质修复污染水体重金属的方法。
背景技术：
：随着人类社会工业经济的发展和农业生化用品的增加，重金属污染的问题日渐尖锐，已经成为全球关注的重大环境问题之一。重金属污染会造成农田土壤肥力退化，农产品品质降低，而且加快环境水质恶化，并通过食物链，最终影响到人类健康。镉是一种毒性很大的重金属，其化合物也大都属于毒性物质。镉用途很广，颜料、合金、电镀、电池、冶金等都要用到镉。随着现代工农业生产的发展，“三废”的排放、污水灌溉及农药、除草剂和化肥的使用越来越多，土壤和水体中镉的含量显著增加，植物和环境系统中的cd污染问题日趋严峻，从而使农产品的安全性受到严重威胁。正是由于这样一些原因，国际和国内对于重金属污染及其防治的研究已经成为环境、化学、生命科学等相交叉的重点和热点研究领域，相关应用性研究侧重于分析重金属污染的来源、防治措施和环境修复等方面。目前国内外治理重金属污染，主要采用离子交换、化学沉淀、溶剂提取等传统的物理化学方法。由于需要复杂的设施设备以及破坏土层结构，物理化学修复法的投资成本较高，并且它们还会影响土壤或水体本生的母质性质甚至会破坏土壤或水体生物的多样性，所以对于大面积受污染的土壤或水体不宜使用。生物修复技术因其独有的优势逐渐被推到人们的关注范围之内。生物修复是指一切以生物为主体来治理环境污染的技术。它包括利用动物、植物和微生物吸收、转化、降解土壤和水体中的污染物，使环境中污染物的浓度降低，或将污染物转化为其他无污染物质，以及使污染物稳定化，避免其向环境中扩散。在环境保护研究方面，微生物修复也成为很多研究者的兴趣所在。针对微生物对重金属抗性和富集的研究是利用微生物修复重金属污染的一个很好的途径。cn103409346a公开了一种重金属抗性果胶杆菌np22，其活化后可制备重金属吸附剂，对重金属镉的最大吸附量可达到113mg/g；cn103952333b公开了一种具有镉耐性的假单胞菌tcd-1，其对包括镉、铅和镍的多种重金属均具有耐性，在重金属镉污染的湿润土壤中添加该菌液，其能修复镉对水稻生长的抑制作用。目前为止，大多数文献公开的微生物修复重金属污染对象为土壤，对于重金属污染的水体环境的微生物修复研究较少；另外，对于利用淡紫紫胞菌在重金属污染水体中的修复作用至今未见报道。技术实现要素：鉴于现有技术中存在的问题，本发明的目的在于提供一种淡紫紫孢菌及其协同生物质修复污染水体重金属的方法。为达此目的，本发明采用以下技术方案：本发明提供了一株淡紫紫孢菌(purpureocilliumlilacinum)，其保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为cgmccno.13169，保藏日期为2016年10月27日，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮政编码为100101。本发明还提供了一种重金属污染水体修复剂，其包括如上所述的淡紫紫孢菌(purpureocilliumlilacinum)。本发明提供的重金属污染水体修复剂中，除了包括所述的淡紫紫孢菌(purpureocilliumlilacinum)外，还可以包括生物质。本发明中，将生物质与所述的淡紫紫孢菌(purpureocilliumlilacinum)共同培养于污染水体中时，二者具有协同增效作用，其能够由单独使用淡紫紫孢菌实现接近35％的镉去除效率提升到62％以上的镉去除效率。本发明中对生物质不做特殊限定，本领域技术人员公知的生物质材料均可用于本发明，不过，优选的生物质是玉米秸秆与苜蓿干草的混合物，二者的质量比优选为1:1，此配比下能使镉的去除效率至少达到62％以上。本发明提供的重金属污染水体修复剂，其用于修复重金属镉。本发明还提供了如上所述的淡紫紫孢菌(purpureocilliumlilacinum)在修复污染水体重金属中的用途。本发明还提供了如上所述的淡紫紫孢菌(purpureocilliumlilacinum)协同生物质在修复污染水体重金属中的用途。本发明中，所述生物质优选秸秆粉，进一步优选玉米秸秆和苜蓿干草的混合物，所述玉米秸秆和苜蓿干草的质量比优选为1:1。通过将所述的淡紫紫孢菌(purpureocilliumlilacinum)协同生物质用于镉污染水体中，培养第5天时，镉离子的去除率可达到62％以上。与现有技术方案相比，本发明至少具有以下有益效果：本发明提供的淡紫紫孢菌(purpureocilliumlilacinum)能够降解重金属污染水体中的镉离子，其协同生物质在溶液体系中培养5天时可使镉离子的去除率达到62％以上。附图说明图1是本发明的淡紫紫孢菌(purpureocilliumlilacinum)对镉离子模拟体系中可溶性镉离子的去除效率；图2是本发明的淡紫紫孢菌(purpureocilliumlilacinum)协同生物质对镉离子模拟体系中可溶性镉离子的去除效率。下面对本发明进一步详细说明。但下述的实例仅仅是本发明的简易例子，并不代表或限制本发明的权利保护范围，本发明的保护范围以权利要求书为准。具体实施方式为便于理解本发明，本发明列举实施例如下。本领域技术人员应该明了，所述实施例仅仅是帮助理解本发明，不应视为对本发明的具体限制。实施例1淡紫紫孢菌(purpureocilliumlilacinum)的获得和鉴定1、土样来源土样采自湖南省桂阳县某废弃矿。2、试剂与仪器2.1试剂氯化镉(cdcl2·2.5h2o)、氯化钠，分析纯，购自国药集团化学试剂有限公司；马铃薯浸粉、葡萄糖、蛋白胨，分析纯，购自北京奥博星(aobox)生物技术有限责任公司。2.2仪器台式冷冻恒温摇床thz-c-1，苏州培英实验设备有限公司；台式高速微量(冷冻型)离心机d3024r，美国赛洛捷克(scilogex)公司；石墨炉原子吸收仪aa-6800，日本shimadzu公司。3、方法3.1菌种的筛选3.1.1真菌培养基配方马铃薯葡萄糖液体培养基(pdb)：马铃薯浸粉5g，葡萄糖15g，蛋白胨10g，氯化钠5g；将各组分溶于1升蒸馏水中灭菌备用；马铃薯葡萄糖固体培养基(pda)：马铃薯浸粉5g，葡萄糖15g，蛋白胨10g，氯化钠5g，琼脂粉6克；将各组分溶于1升蒸馏水中灭菌倒平板；3.1.2筛选方法(1)取10g土样至90ml无菌水中，加入适量玻璃珠，30℃，180r/min振荡培养20min，制成土壤悬液，取出后静置；(2)取5ml土壤悬液上清加入到含2mmol/lcdcl2的pdb培养基中，同样条件下分别振荡培养24h和72h；(3)取3ml步骤(2)所得菌悬液于新鲜灭菌的含4mmol/lcdcl2的pdb培养基中，同样条件下分别振荡培养24h和72h；(4)取3ml步骤(3)所得菌悬液于新鲜灭菌的含10mmol/lcdcl2pdb培养基中，同样条件下分别振荡培养24h和72h；(5)将步骤(4)所得菌悬液梯度稀释10倍、100倍和1000倍，分别涂布于含不同浓度cdcl2(4mmol/l、6mmol/l、8mmol/l、10mmol/l)的pda固体平板培养基上，并置于28℃的恒温箱中倒置培养；(6)观察平板上真菌菌落生长状况，纯化单菌落，转接pda斜面培养基保藏。3.2菌种分子生物学鉴定(1)取出3.1.2保藏的真菌斜面，用接种环取0.5cm×0.5cm左右大小菌丝块接入新鲜灭菌的pdb培养基(250ml锥形瓶盛装50ml培养液)，于28℃、200r/min振荡培养48h；(3)按照全式金dna提取试剂盒中的说明书操作，提取真菌总dna；(4)真菌dna按照表1-2的反应条件(引物见表1-1)扩增后送上海生物工程有限公司测序；(5)完成序列在ncbi数据库比对鉴定，并通过mega6分析软件建立菌种发育进化树，最终确定菌种的分类地位。表1-1表1-2筛选目标真菌的its序列如下：tcccttgcagcagctgttctgccgctcgagcggtgcacaatgtgctctgattgcggcgattacccctccttgcacagtcaaaattttctgtgacttgtcgccagctttgtgtggggctcattaccccgccacgctgcacaggtgtctcatttgcccctcaacaccaaaaattcgcacggagcaccaacagcatgctgacgcgtgagataacaggaagccgccgagctcggcaagggttccttcaagtacgcgtgggtccttgacaagctcaaggccgagcgtgagcgtggtatcaccatcgacattgccctctggaagttcgagactcccaagtactatgtcaccgtcattggtacgtcgactcgcgcgagactggtcgcaatttccacgtcgctaacgtgcttgaacagacgctcccggccaccgtgacttcatcaagaacatgatcactggtacctcccaggctgactgcgctatcctcattatcgctgccggcactggtgagttcgaggctggtatctccaaggatggccagacccgtgagcacgctctgctcgcctacaccctcggtgttaagcagctcatcgtcgctatcaacaagatggacaccaccaagtggtctgaggcccgtttccaggagatcatcaaggagacctccaacttcatcaagaaggtcggctacaaccccaagaccgtcgctttcgtccccatctctggtttccacggcgacaacatgctttccccctccaccaactgcccctggtacaagggctgggagaaggagaccaaggctggcaagtccaccggcaagaccctccttgaggccatcgactccatcgagccccccaagcgccccagcgacaagcccctccgccttccccttcaggatgtgtacaagatcggcggtatcggcacagtccctgtcggccgtatcgagactggtgtcatcaagcccggcatggtcgtgaccttcgctccttccaacgtcaccaccgaagtcaagtccgttgagatgcaccacgagcagctctccgagggtgtccccggtgacaacgtcggcttcaacgtcaagaacgtctccgtcaaggagatccgtcgtggcaacgtcgccggtgactccaagaacgacccccctctgggtgccgcttctttcgatgcccaggtcatcgtcctcaaccaccccggccagg将测得的菌株序列通过blast程序与genbank(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)中的its序列进行同源性比对分析，查找相同或相似的核苷酸序列，然后利用序列比对和系统发育分析软件mega6.0构建系统进化树。在mega软件中，构建系统进化树的方法使用neighbor-joining法，碱基替代模型选择kimura双参数模型，进化树可靠性检验选用自展检验(bootstrap)1000次重复检测，dna序列变异中的转换和颠换赋于相同的加权值。目标真菌经分析鉴定为淡紫紫胞菌(purpureocilliumlilacinum)。实施例2淡紫紫孢菌(purpureocilliumlilacinum)对镉的去除效率1.1试验方法(1)菌种制备：取出保藏的菌种斜面，用接种环取0.5cm×0.5cm大小菌丝块接入到含10mmol/lcd2+的50ml灭菌pdb液体培养基中，培养24小时；(2)4mmol/lcd2+溶液制备：称取182.8mg的cdcl2·2.5h2o于250ml三角瓶中，加入100ml无菌水中，超声中充分溶解；(3)含镉废水生物去除模拟体系构建：将培养24h的菌液按照千分之一的浓度加入4mmol/lcd2+水体中，于28℃、200r/min恒温培养箱中振荡培养。分别检测1d、2d、3d、4d、5d时cd2+含量，每个时间点做三个重复，并设置不加菌液的空白对照；(4)水体中镉离子待测样制备：观察水体中菌株生长状态，于每个时间点取出对应的三个重复转移至100ml离心管(离心管提前称重)，10000r/min离心10min，上清液收集用于镉离子的检测。1.2去除效率的测定利用上述步骤1.1-(3)中制备的待测样，测量五个时间点所对应水体的cd2+含量。测量仪器为石墨炉原子吸收仪aa-6800，结果取三个重复的平均值，分别以时间点和cd2+浓度为横纵坐标绘制镉离子浓度变化曲线，评价该菌株对cd2+的去除效果，其结果具体如表2和图1所示。表2时间(day)对照(ppm)处理(ppm)去除率(％)14.05353.424315.5224.08553.076524.7034.07252.757532.2944.07052.743532.6054.08252.654234.99通过表2可以看出，利用镉离子模拟体系，实施例1中得到的淡紫紫孢菌菌株在处理1天后，镉离子浓度由原来的4.0535ppm变为3.4243ppm，去除率为15.52％，处理3天后，镉离子浓度由4.0725ppm变为2.7575ppm，去除率为32.29％，处理5天后，镉离子浓度由4.0825变为2.6542ppm，去除率达到34.99％，证明该淡紫紫孢菌菌株可以用于含镉离子的废水处理，并在5天内具有近35％以上的去除率。实施例3淡紫紫孢菌(purpureocilliumlilacinum)与生物质的镉协同去除效率1.1试验方法(1)菌种制备：取出保藏的菌种斜面，用接种环取0.5cm×0.5cm大小菌丝块接入到含10mmol/lcd2+的50ml灭菌pdb液体培养基中，培养24小时；(2)4mmol/lcd2+溶液制备：称取182.8mg的cdcl2·2.5h2o于250ml三角瓶中，加入100ml无菌水中，超声中充分溶解；(3)含镉废水生物去除模拟体系构建：以cdcl2·2.5h2o配制4mmol/lcd2+溶液(无菌水)，将培养24小时的菌液按照千分之一的浓度加入4mmol/lcd2+水体中，同时按照反应体系质量比的5％加入秸秆粉(由玉米秸秆和苜蓿干草按质量比1:1混合)，于28℃，200r/min振荡培养。分别检测1d、2d、3d、4d、5d时cd2+含量，每个时间点做三个重复，并设置不加菌液的空白对照；(4)水体中镉离子待测样制备：观察水体中菌株生长状态，于每个时间点取出对应的三个重复转移至100ml离心管(离心管提前称重)，10000r/min离心10min，上清液收集用于镉离子的检测。1.2去除效率的测定利用上述步骤1.1-(3)中制备的待测样，测量五个时间点所对应水体的cd2+含量。测量仪器为石墨炉原子吸收仪aa-6800，结果取三个重复的平均值，分别以时间点和cd2+浓度为横纵坐标绘制镉离子浓度变化曲线，评价该菌株对cd2+的去除效果，其结果具体如表3和图2所示。表3时间(day)对照(ppm)处理(ppm)去除率(％)14.05353.092423.7124.08552.968127.3534.07252.749332.4944.07051.861854.2654.08251.517162.84通过表3可以看出，利用重金属模拟体系，实施例1中得到的淡紫紫孢菌菌株协同秸秆粉在处理1天后，镉离子浓度由原来的4.0535ppm变为3.0924ppm，去除率为23.71％，处理3天后，镉离子浓度由原来的4.0855ppm变为2.7493ppm，去除率为32.49％，处理5天后，镉离子浓度由原来的4.0825ppm变为1.5171ppm，去除率达到62.84％。由上述结果还可以看出，对比实施例2单独采用淡紫紫孢菌菌株的情况，该淡紫紫孢菌菌株与生物质协同作用可将镉去除率提高至62％以上，说明其与生物质二者之间具有协同增效作用，可以获得更好的镉去除效果。申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的详细结构特征，但本发明并不局限于上述详细结构特征，即不意味着本发明必须依赖上述详细结构特征才能实施。所属
技术领域：
的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明所选用部件的等效替换以及辅助部件的增加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于上述实施方式中的具体细节，在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本发明的保护范围。另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合，为了避免不必要的重复，本发明对各种可能的组合方式不再另行说明。此外，本发明的各种不同的实施方式之间也可以进行任意组合，只要其不违背本发明的思想，其同样应当视为本发明所公开的内容。当前第1页12