一株抑制水稻纹枯病菌的侧孢短芽孢杆菌及其应用的制作方法

本发明涉及水稻纹枯病的微生物防治
技术领域：
，尤其涉及一株抑制水稻纹枯病菌的侧孢短芽孢杆菌及其应用。
背景技术：
：水稻纹枯病(rhizoctoniasolani)是国内外最严重而且也是最难治理的真菌病害之一，其分布广泛、为害严重，每年都给农业生产造成巨大的经济损失。由于纹枯病菌腐生能力强、寄主范围广，国内外至今尚未发现对该病的高抗品种。目前我国生产上防治水稻纹枯病以井岗霉素和一些化学农药为主，抗生素和化学药剂的长期反复使用已经使病原菌产生了明显的抗药性，导致防效下降甚至丧失，用药量不断增加，而长期大量使用农药造成自然生态环境污染及稻米农药残留量增加的问题也越来越突出。由于水稻纹枯病是一种土传病害，病原菌对寄主的寄生专化性不强，作物品种间特异抗性差异很小或没有(刘薇等，2009)。利用有益微生物进行生物防治不但经济有效，而且无副作用。因此，利用有拮抗作用的微生物进行生物防治是一条有探索价值的新途径。近年来，世界主要稻区普遍开展了采用拮抗微生物来控制水稻纹枯病危害的生物防治研究。对水稻纹枯病的生物防治研究目前已取得比较大的进展，已报道筛选到对水稻纹枯病菌有较强作用的枯草芽孢杆菌bs-916、b5423-r、芽孢杆菌属drt211、nbl2、致黄假单胞菌b34以及青霉属的z88、木霉属、镰孢菌、产农抗120放线菌、伯克霍尔德菌sd7及海洋细菌等菌株对水稻纹枯病菌具有一定的拮抗作用。应用最多当属枯草芽孢杆菌，江苏农科院(陈志谊等，2003)成功筛选枯草芽孢杆菌bs-916，对多种水稻病害具有良好的防效，其商品“纹曲宁”自1991年推广以来，对纹枯病的防效稳定在70％以上。南京农业大学研制的生物农药“麦丰宁”，由枯草芽孢杆菌b3制成，对立枯丝核菌具有显著的抑制作用。云南农业大学与中国农业大学共同研制的“百抗”的主要有效成分是枯草芽孢杆菌b908，已经获得农业部登记注册，对水稻纹枯病的防治效果达70％以上。但目前，开发成产品的主要是枯草芽孢杆菌，其他大部分生防菌株均处于实验室研究阶段，因此，生产上尚缺少用于防治水稻纹枯病的新型微生物农药。侧孢短芽孢杆菌具有杀虫(singer,1996；1997)、杀线(favret,1985)、抗菌(t.foèldes,2000)、抗肿瘤(takeuchi,1984)、溶磷(杜春梅,2005)、降解有机污染物(crawford,1976)、生产赖氨酸(kamiyamat,1994)和多种酶类物质(tadashi,1990)等功能。对侧孢短芽孢杆菌的研究已有近百年的历史，国外的研究一直非常活跃，尤其是俄罗斯、美国、英国、日本、比利时等国更是研究得极为深入。早期的研究主要集中在侧孢短芽孢杆菌的杀虫活性上，它对蚊类、甲虫类昆虫(而非鳞翅类昆虫)的幼虫以及线虫和软体动物等无脊椎生物具有毒性作用(sirnova,1996)。它们的杀虫活性主要是由于其类芽胞内含物或晶体中含有的蛋白质对很多种昆虫具有毒性作用。侧孢短芽孢杆菌产生的小分子细菌毒素能够抑制线虫卵的孵化或幼虫的发育，可以防治动植物寄生线虫(singer,1996)，美国将侧孢短芽孢杆菌制成粉剂用于防治动物的线虫病。我国对该领域也投入了越来越多的关注，云南大学的侧孢短芽孢杆菌杀线虫成果也已得到了应用(张克勤，田宝玉和周薇，2004)。印度己完成了三种侧孢短芽孢杆菌菌株全基因组的测序。世界酶制剂巨头.丹麦诺维信公司生产的诺沃tm微生物菌剂，其中也含有侧孢短芽孢杆菌。而近年来，有关侧孢短芽孢杆菌抑菌活性的研究越来越受到人们的关注，美国、日本等报道侧孢短芽孢杆菌可以产生多种抗菌物质，包括非肽类的芽孢菌胺、聚酮化合物、肽类抗生素以及几丁质酶等。以上这些侧孢短芽孢杆菌产生的抗菌物质主要用于防治临床上已经产生抗药性的革兰氏阳性菌和念珠菌，但对植物病原菌的抑制作用的报道极少。近几年侧孢短芽孢杆菌对植物病原菌的抑制作用越来越受到人们的关注，我国先后报道了侧孢短芽孢杆菌ymf3.100003、b8、1·864、bl-21、2-q-9、s62-9、x10、a60等菌株对植物病原真菌和细菌的抑菌活性。由此可见，虽然国内近几年对侧孢短芽孢杆菌用于植物病害的生防作用展开了初步探索，但相关研究均处于初期阶段，尚没有以侧孢短芽孢杆菌为主要成分的微生物杀菌剂，也没有关于侧孢短芽孢杆菌对水稻纹枯病菌抑制作用的相关报道。技术实现要素：为了解决上述问题，本发明开展了水稻纹枯病菌生防细菌的筛选，于2015年从沈阳天柱山植物根际土壤中分离到对水稻纹枯病菌具有较强的抑制作用的生防菌株snb10，经形态学特征、生理生化及16srdna分析将该菌株鉴定为侧孢短芽孢杆菌(brevibacilluslaterosporus)，该菌株对水稻纹枯病菌具有较强的抑制作用，抗逆性强，抑菌活性稳定、抑菌谱广，具有明显的生防潜能，是一株很有开发前途的生防菌，本发明提供了一种对人、畜无毒，对生态环境友好，对水稻纹枯病有良好防效的微生物菌种及其农药产品，特此将该菌株申请发明专利。本发明的技术方案如下：一株对水稻纹枯病菌具有抑制作用侧孢短芽孢杆菌(brevibacilluslaterosporus)，代号snb10，其已经于2017年5月17日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为：14171。保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所。本发明公开的侧孢短芽孢杆菌(brevibacilluslaterosporus)，代号snb10，所具有的形态特征：菌株培养特征是：菌株在牛肉膏蛋白胨琼脂平板上28℃培养2d后菌落呈圆形，乳白色，扁平、边缘较整齐，中央略微凸起，呈轮纹生长、湿润光滑、不产生色素。菌株形态特征为：菌体呈杆状，大小为(0.5～0.6)×(2.0～2.5)μm，有周生多鞭毛，能运动。革兰氏染色阴性。芽孢椭圆形，侧生、孢囊膨大，呈独木舟状，无伴孢晶体(图1)。生理生化特征为：厌氧，接触酶阳性，氧化酶阴性，不产生淀粉酶、硝酸盐还原酶和l-苯丙氨酸脱氨酶，不能利用柠檬酸盐。该菌株最适宜生长温度为26～28℃。试验证明，本发明的侧孢短芽孢杆菌snb10对水稻纹枯病菌具有很强的抑制作用，无菌发酵滤液对水稻纹枯病菌的抑制率达75.56％，可使水稻纹枯病菌菌丝畸形、断裂，细胞膜改变，原生质体外渗，菌丝消融等。菌株snb10可产几丁质酶，其无菌发酵滤液对水稻纹枯病菌菌核产生的抑制率达到100％；对菌核萌发的抑制率达42％，并能延迟菌核萌发，且处理组的菌核萌发后菌丝生长量明显少于对照组，菌丝生长速度缓慢。盆栽试验结果表明在接种水稻纹枯病菌前喷施snb10水剂对水稻纹枯病的防效为75.09％；在接种水稻纹枯病菌之后喷洒snb10水剂，对水稻纹枯病的防效为70.53％。此外，菌株snb10无菌发酵滤液抑菌谱较广，对黄瓜枯萎病菌(fusariumoxysporumf.sp.cucumerinum)、茄子黄萎病菌(verticilliumdahliae)、番茄灰霉病菌(botrytiscinerea)、番茄叶霉病菌(fulviafulva)、烟草靶斑病菌(rhizoctoniasolani)、辣椒疫霉菌(phytophthoracapsici)、水稻白叶枯病菌(xanthomonasoryzaepv.oryzae)和烟草角斑病菌(pseudomonassyringaepv.angulata)等植物病原菌具有一定的抑制作用。本发明的抑制水稻纹枯病菌的侧孢短芽孢杆菌，具有如下优点：1.提供对人畜无毒，对生态环境友好，对水稻纹枯病有良好防效地微生物菌种及其农药产品。2.提供一株水稻纹枯病菌的多功能生防菌株。3.增加防治水稻纹枯病微生物杀菌剂的种类。附图说明图1：菌株snb10的芽孢形态图。图2：菌株snb10与水稻纹枯病菌对峙培养图。图3：菌株snb10发酵液对水稻纹枯病菌的抑制作用图。图4：菌株snb10无菌发酵滤液在几丁质琼脂平板上培养图。具体实施方式下面以具体的实施例对本发明作详细的描述。实施例1：菌株的筛选、分离与鉴定菌株的分离培养：培养基为牛肉膏蛋白胨琼脂培养基(na)：牛肉浸膏3g，蛋白胨5g，氯化钠5g，琼脂20g，蒸馏水1000ml，ph7.0～7.2。采用稀释涂布法分离。称取新采集的土壤(或阴干后的土壤)10g，倒入盛有90ml无菌水的三角瓶中，振荡10min，即成1/10浓度的悬液，80℃水浴20min，取1ml上清液，制备成10-7或10-8浓度的稀释度备用。将熔化好的na倒入灭菌的培养皿中，待凝固后，吸取稀释液50μl滴在凝固的培养基表面，用无菌涂布棒涂匀，将培养皿倒置于28℃恒温箱中培养1～2d。长出菌落后，挑菌落呈圆形，乳白色，扁平、边缘较整齐，中央略微凸起，湿润光滑、不产生色素的单菌落在牛肉膏蛋白胨琼脂培养基划线培养，重复分离纯化3次，最后得到的单菌落，命名为snb10，进行生理生化鉴定和16srdna测序，菌株snb10的16srdna的序列长度为1455bp。将16srdna测序结果与genbank中的序列进行比对分析，结果表明菌株snb10与侧孢短芽孢杆菌(brevibacilluslaterosporus)bl-2(id:dq371289.2)的基因序列同源性为99％上。根据《伯杰细菌鉴定手册》(第八版)对菌落形态特征和生理生化鉴定，确定snb10为侧孢短芽孢杆菌(brevibacilluslaterosporus)保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为14171。为确定本发明菌株及其产品对水稻纹枯病(rhizoctoniasolani)的防治效果，特进行如下体外抑菌试验和室内生测。实施例2：对峙培养测定菌株snb10对水稻纹枯病原菌的抑制作用取一直径为8mm的水稻纹枯病菌菌碟放入盛有pda的培养皿中央，在距离该菌碟上下2cm处，用沾有菌株snb10的接种环划两条平行直线，28℃培养3d，测量抑菌带宽度，显微观察抑菌带内水稻纹枯病菌菌丝生长情况(图2)；继续培养30d至水稻纹枯病菌产菌核，观察抑制作用的持久性。试验结果表明：菌株snb10能对强烈抑制水稻纹枯病菌的生长，显微观察到抑菌带内水稻纹枯病菌菌丝畸形、断裂，细胞膜改变，原生质体外渗，菌丝消融等现象。培养30d至水稻纹枯病菌产菌核时，抑菌带内菌丝也不再生长，说明菌株snb10抑菌效果持久、稳定。实施例3：菌株snb10发酵液抑菌活性的测定无菌发酵滤液的制备：将菌株snb10转接至新鲜斜面培养基上，28℃条件下培养1d后，接种至装液量50ml的250ml三角瓶内，在28℃，转速为150r/min的旋转式摇床上振荡培养40h，得发酵原液，将发酵原液10000r/min离心20min，在的细菌过滤器中过滤，得到无菌发酵滤液后测定其抑菌活性。发酵培养基：牛肉浸膏3g，蛋白胨5g，氯化钠5g，蒸馏水1000ml，ph7.0～7.2。采用杯碟法测定菌株snb10无菌发酵滤液对水稻纹枯病菌的抑菌活性：将直径为8mm的水稻纹枯病菌菌碟倒置于pda平板中央，四周放置灭菌的牛津杯，在牛津杯中加入200μl无菌发酵滤液，28℃培养箱中培养菌丝长满皿，测量牛津杯周围抑菌圈直径，以无菌水为对照。抑菌率(％)＝菌落直径(ck)-菌落直径(处理组)/菌落直径(ck)。试验结果表明：菌株snb10无菌发酵滤液对水稻纹枯病原菌具有很强的抑制作用，抑制率达75.56％。实施例4：盆栽试验测定snb10制备的水剂对水稻纹枯病的防治效果snb10水剂的制备：将菌株snb10转接至新鲜斜面培养基上，28℃条件下培养1d后，接种至装液量50ml的250ml三角瓶内，在28℃，转速为150r/min的旋转式摇床上振荡培养20h制备种子液，以1％体积比接入液体发酵培养基中，28℃，转速为150r/min，培养40～72h，待发酵液中95％菌体形成芽孢，其活芽孢数为1×108～1×109cfu/ml，即获得生防水剂备用。在直径30cm的塑料桶中装入泥土并栽种水稻纹枯病感病品种，每桶栽种3穴。在水稻分蘖末期以牙签嵌入法接种水稻纹枯病菌。试验设置以下处理：在接种前喷洒snb10水剂，一周后再喷洒1次；接种后喷洒snb10水剂，一周后再喷洒。每个处理重复三次，以接种水稻纹枯病菌并喷洒na液体培养基的水稻植株为空白对照，以生防菌剂“百抗”为阳性对照。30d后测量病斑长度与水稻植株株高，每个处理调查30株水稻，计算防效。防效＝(对照组病斑长度/水稻株高—处理组病斑长度/水稻株高)/对照病斑长度/水稻株高×100％盆栽试验结果(表1)表明接种水稻纹枯病菌前喷洒snb10水剂对水稻纹枯病的防效为75.09％；接种水稻纹枯病菌后喷洒snb10水剂对水稻纹枯病的防效为70.53％。表1snb10水剂对水稻纹枯病的防效处理平均病斑长/株高防效(％)接种前施用snb10水剂0.07175.09接种后施用snb10水剂0.08470.53对照0.285——实施例5：菌株snb10无菌发酵滤液对水稻纹枯病菌菌核产生和萌发的影响试验处理方法：采用含毒介质法在50℃的pda培养基中按9：l的用量加入侧孢短芽孢杆菌snb10无菌发酵滤液，充分混均，制平板，冷凝后，向平板中央分别移入直径为8mm的水稻纹枯病菌菌饼，重复5次，并以不加入无菌发酵滤液的等量pda培养基作为对照，25℃培养3d后观察结果，用抑制菌丝生长速率法计算抑制率。待对照在pda培养基上25℃培养水稻纹枯病菌25d至产生大量菌核，再用菌株snb10无菌发酵滤液50倍液浸泡处理菌核30min，用无菌水冲洗5次。用灭菌的滤纸吸干，然后将菌核接入pda平板，每皿放置10个菌核，以未处理的菌核作为对照，25℃下培养，观察记录菌核萌发情况。结果表明：未用snb10无菌发酵滤液处理的水稻纹枯病菌在25℃恒温培养20d后开始形成菌核，30d时菌核大量产生，而用snb10无菌发酵滤液处理的水稻纹枯病菌一直不产生菌核，继续观察1个月之后仍然不产生菌核，可见菌株snb10无菌发酵滤液对水稻纹枯病菌菌核产生的抑制率达到100％(图3)。菌核萌发试验结果发现，使用无菌水浸泡处理的水稻纹枯病菌菌核25℃下培养1d后开始萌发，7d内全部萌发，且产生大量菌丝体。而使用snb10无菌发酵滤液浸泡处理的菌核萌发延迟或不萌发，前两天菌核极少萌发，持续培养7d后才有个别菌核萌发，对菌核萌发的抑制率达42％，并能延迟菌核萌发，且处理组的菌核萌发后菌丝生长量明显少于对照组，菌丝生长速度缓慢。实施例6：侧孢短芽孢杆菌snb10产几丁质酶测定几丁质琼脂培养基：0.5gk2hpo4，0.5gkh2po4，0.5gmgso4·7h2o0.1gfeso4·7h2o，0.1gznso4·7h2o，500ml1％胶体几丁质，500ml蒸馏水，17g琼脂，ph7.2，121℃灭菌20min，冷至50℃左右倒平板。平板上置牛津杯，将侧孢短芽孢杆菌snb10的无菌发酵滤液加入牛津杯中，28℃培养5d后观察。结果表明侧孢短芽孢杆菌snb10无菌发酵滤液在几丁质琼脂平板上培养5d后在牛津杯周围产生明显的透明圈，表明该菌株可产生几丁质酶(图4)。实施例7：侧孢短芽孢杆菌snb10的无菌发酵滤液广谱抑菌试验将水稻纹枯病菌、黄瓜枯萎病菌、茄子黄萎病菌、番茄灰霉病菌、番茄叶霉病菌、烟草靶斑病菌、辣椒疫霉菌、水稻白叶枯病菌和烟草角斑病菌混于pda平板中，上置牛津杯，每杯中加入200μl侧孢短芽孢杆菌snb10无菌发酵滤液，28℃培养箱中培养至平板菌落长满时测量抑菌圈直径，每处理3次重复，取其平均值。如表2所示：侧孢短芽孢杆菌snb10无菌发酵滤液对多种植物病原真菌和细菌均具有一定的抑制作用，其中对水稻纹枯病菌抑制作用最强，其次是烟草靶斑病菌和辣椒疫霉菌。表2侧孢短芽孢杆菌snb10对植物病原菌的抑制效果植物病原真菌抑菌圈直径(cm)水稻纹枯病菌rhizoctoniasolani50.3黄瓜枯萎病菌fusariumoxysporumf.sp.cucumerinum32.6茄子黄萎病菌verticilliumdahliae30.8番茄灰霉病菌botrytiscinerea36.9番茄叶霉病菌fulviafulva28.6烟草靶斑病菌rhizoctoniasolani48.7辣椒疫霉菌phytophthoracapsici45.8水稻白叶枯病菌xanthomonasoryzaepv.oryzae22.3烟草角斑病菌pseudomonassyringaepv.angulata14.2以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本
技术领域：
的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。当前第1页12