一株有效防治樱花根癌病的蜡样芽孢杆菌H‑B‑1及其应用的制作方法

本发明属于微生物
技术领域：
，具体涉及一株有效防治樱花根癌病的蜡样芽孢杆菌(bacilluscereus)h-b-1及其应用。
背景技术：
：樱花是世界著名的观赏花木，隶属于蔷薇科(rosaceae)樱属(cerasus)，分布于北半球温暖地区，为北温带植物。樱花系浅根性植物，喜微酸疏松肥沃、排水良好的土壤和背风向阳湿润的环境。我国拥有十分丰富的樱花资源，远远超过日本及相邻国家，分布范围非常广泛，从东北到西南都有分布，其中有许多观赏价值极高的种类。近年来樱花因其株型优美、花色艳丽、花期延续期长且具有极高的观赏价值而引起苗木培育者的广泛重视，但是随着种植面积的不断增加，所受病害侵染的面积也不断扩大，其中以樱花根癌病、樱花穿孔病及樱花流胶病最为严重。根癌病也称冠瘿病、根头癌、根肿病，它是由根癌农杆菌引起的且具有严重危害的细菌性病害，该病害在全世界范围均有不同程度的发生。宋玉双等人研究发现，土壤农杆菌的的寄主范围非常广泛，可以侵染93个科331属643余种不同植物，其中以危害双子叶植物为主，在特殊条件下也可侵染裸子植物和单子叶植物。根癌病的侵染途径主要是通过伤口。发病部位主要为根颈、侧根和枝干，典型症状是在病发部位形成形状大小不一的肿瘤。发病部位初期的病状为先形成乳白色、如豆粒般微小的瘤状物，之后随着苗木的生长瘤状物逐渐长大，颜色渐深，表面由光滑变成粗糙，进而由内部木质化而变的质地坚硬，呈现出黑褐色，干枯龟裂后变成不规则形状，该病害发生严重时瘤体可以将根颈或是枝条包围。患病早期，苗木或树体的地上部分无明显症状。随着肿瘤的变大，植株虚根变少，树势由强变弱，进而造成叶片黄化，提早落叶。发病严重时，植株在营养吸收和水分运输方面均会受到影响，植株生长减慢，产量逐年下降，最后直至死亡。樱花根癌病由根癌土壤杆菌引起，在生产上造成了非常大的损失，1996年被列入国内森林检疫对象名单。樱花得病后最明显的症状是在根茎处产生球状或半球状瘤状物，瘤状物随着苗木的生长而慢慢长大，严重影响了樱花苗木生长速度和树势，降低了观赏品质和商品价值。病害发生轻时引起提前落叶，严重时可引起整树枯死，被花农称为樱花的“癌症”。目前针对樱花根癌病的防治手段主要以化学防治和生物防治为主。utkheders等(1993)在苹果田间试验中用氢氧化铜溶液处理发病幼树的根部，结果发现试验组根瘤数目较之对照组减少；王慧敏等(1995)通过测定杀菌剂和抗菌素对3种生物型根癌农杆菌的抑菌作用，研究发现硫酸链霉素对全部根癌菌的抑制作用都很好；福美双对生物ⅲ型根癌农杆菌所有菌株都有较强抑制作用；青霉素钠只对生物ⅲ型有较好的抑制作用；其他药剂均无作用。但是长期的使用化学农药会对环境和生态平衡带来一系列严重问题，而生物防治近些年来因其成本低、污染小、防治效果显著而备受青睐，一些科学工作者在根癌病防治工作期间也筛选出了不同种类且防治效果显著的生防菌株。kerr教授从桃树冠瘿病患病植株根际土壤中分离得到的菌株k84，可以有效抑制致病型根癌土壤杆菌生长；akira(2007)从日本的葡萄苗木上分离得到的葡萄土壤杆菌var03-1，无致病性，且能产生一种细菌素，可以抑制番茄和葡萄上由致病性葡萄土壤杆菌g-ag-27所引起的肿瘤的形成。芽孢杆菌因培养周期短、生产方便而日益成为生防菌的优势菌株。它是一类产芽孢的革兰氏阳性细菌，好氧或者兼性厌氧生活，能够产生耐热、耐旱、抗紫外线和抗有机溶剂的内生孢子，所产芽孢可制成粉剂、可湿性粉剂等各种剂型，且与化学农药混用后不失活，是理想的生防菌筛选对象。苜蓿是一般用于医院呼吸道感染细菌致病性测定的模式植物。2002年laura用一种在cf病人体内常检测到的病原菌psudomnoasaeruginosa对苜蓿和老鼠分别接种，比较研究结果发现，苜蓿可以代替老鼠作为模式植物测定该菌对哺乳动物的毒性，甚至苜蓿模型表现出了比老鼠模型更高的灵敏度(lauraetal.，2002)。随后，steve对bcc做了同样的比较测试，发现bcc在苜蓿上的发病率与在老鼠上的结果呈正相关，可以代替老鼠作为测定bcc对动物毒性的模式植物(steveetal.，2003)。用苜蓿模型可简单快捷的检测出bcc菌株对哺乳动物是否具有致病性，这为我们在农业和环保中安全利用bc奠定了坚实的基础。近些年来，有关芽孢杆菌在樱花根癌病生物防治领域的研究鲜有报道。因此，将芽孢杆菌用于樱花根癌病的生物防治工作，有利于对该病害更好的防治。技术实现要素：发明目的：针对现有技术中存在的不足，本发明的目的是提供一种有效防治樱花根癌病的蜡样芽孢杆菌h-b-1。本发明的另一目的是提供上述蜡样芽孢杆菌的用途。技术方案：为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案如下：一株有效防治樱花根癌病的细菌菌株，分类命名为蜡样芽孢杆菌(bacilluscereus)h-b-1，已保藏于中国典型培养物保藏中心cctcc，保藏编号cctccno：m2017214，保藏日为2017年4月27日，保藏地址：中国武汉武汉大学。该有效防治樱花根癌病的蜡样芽孢杆菌(bacilluscereus)h-b-1，是一株从患根癌病桃树根际土壤筛选获得的对根癌病菌具有拮抗作用的生防细菌菌株。蜡样芽孢杆菌(bacilluscereus)h-b-1在牛肉膏蛋白胨培养基平板上菌落较小，淡黄色，直径一般2-3mm，圆形，边缘不整齐，表面光滑湿润，菌体直杆状，大小为0.7×(1～2)μm。革兰氏染色表现为阴性；测得16srdna大部分序列1444bp，具体如seqidno.1所示。将所测16srdna序列通过blast比对，能在genbank中找到同源性非常高的相近菌株序列。与h-b-1菌株相似性最高的是bacillusthuringiensis和bacilluscereus，同源性都达到99％。构建进化树发现，h-b-1与bacilluscereus同属一个遗传分枝，亲缘关系十分接近。通过生理生化试验发现该菌吲哚反应为阴性；接触酶反应结果为阳性；甲基红反应结果为阳性；淀粉水解试验为阳性；v-p试验、硝酸盐还原反应和柠檬酸盐反应结果也都呈现阳性；伴孢晶体染色发现该菌不具有伴孢晶体；因此判定该菌为蜡样芽孢杆菌(bacilluscereus)，命名为蜡样芽孢杆菌(bacilluscereus)h-b-1。上述蜡样芽孢杆菌菌株h-b-1及其代谢产物对樱花根癌病病原菌根癌农杆菌(agrobacteriumtumefaciens)具有一定的抑菌作用，因此能够高效防治樱花根癌病。上述蜡样芽孢杆菌菌株h-b-1对樱花还具有促生长的作用。上述蜡样芽孢杆菌菌株h-b-1防治效果较好的发酵条件如下：培养基：每1000ml蒸馏水，含牛肉膏3g，蛋白胨10g，氯化钠5g，ph7.2。工艺条件为：ph6～7，通气量1：1，28℃～30℃，摇床转速180～200转/分，24小时。通过上述发酵工艺得到的发酵液即为一种微生物杀菌剂。该发酵液与水按照1:5比例稀释并加入适量土壤打成泥浆对植物裸根进行蘸浆处理即可发挥其杀菌作用。有益效果：与现有技术相比，本发明提供的蜡样芽孢杆菌菌株h-b-1，为植物根际生防促生细菌，对樱花根癌病有较好的防治效果，同时对樱花的生长具有促生作用。该蜡样芽孢杆菌菌株h-b-1培养条件简单、容易保存，易于工业化生产，具有良好的开发应用前景。附图说明图1是蜡样芽孢杆菌菌株h-b-1的抑菌结果图；图2是蜡样芽孢杆菌菌株h-b-1的发酵滤液对根癌土壤杆菌的拮抗作用结果图；图3是蜡样芽孢杆菌菌株h-b-1对温室指示植物根癌病的抗病作用结果图。具体实施方式下面结合具体实施例对本发明做进一步的说明。根据下述实施例，可以更好地理解本发明。然而，本领域的技术人员容易理解，实施例所描述的具体的物料配比、工艺条件及其结果仅用于说明本发明，而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本发明。实施例1：蜡样芽孢杆菌菌株h-b-1通过琼脂扩散法测定它们对根癌病菌菌株生长的抑制作用。将纯化培养的致瘤土壤杆菌与土壤中分离的细菌制成107～108cfu/ml菌悬液，将致瘤农杆菌a-4菌悬液按5％的接种量与改良523培养基混合，摇匀。每皿加入25ml混有致瘤农杆菌的改良523培养基，凝固后在培养基上用打孔器打2～3个孔，在每孔中加入130μl的土壤细菌菌悬液，置于28℃培养24h～48h，测其抑菌圈直径。结果表明如图1所示，左图为抑菌图，右图为ck对照，可见蜡样芽孢杆菌菌株h-b-1的抑菌效果好，抑菌直径为7.67cm，其抑菌活性明显优于其它菌株抑菌能力。实施例2：蜡样芽孢杆菌菌株h-b-1发酵液与根癌病菌菌株进行平板抑菌能力的测定。将蜡样芽孢杆菌菌株h-b-1菌株的甘油保藏液按2％的接种量接种到牛肉膏蛋白胨液体培养基中，摇培24h。将细菌发酵液用0.22μm的细菌过滤器过滤即得细菌发酵滤液。按20％的接种量将每株菌的细菌发酵滤液与培养基(改良的523培养25ml)混匀，取直径0.6cm的滤纸片沾取根癌土壤杆菌的菌悬液，适度风干后置于混有细菌发酵滤液的平板上，每平皿2～3个滤纸片，于培养箱中培养48h后测量菌落直径。结果发现菌株h-b-1表现出一定的拮抗活性。菌株的发酵滤液对根癌病菌菌株的抑菌活性用24h～48h所测得的病原菌菌落直径大小为1.05cm，低于对照空白处理的2.37cm(图2，左图为结果图，右图为ck对照)。实施例3：蜡样芽孢杆菌菌株h-b-1对温室指示植物根癌病的抗病作用购买番茄幼苗，将其置于混合培养土中培养。待幼苗伸出土面15cm左右时接种(选取长势相似的健壮幼苗)，在接种前半小时取出待接菌(分离的6株土壤细菌)，使培养菌的温度恢复至室温，然后开始接种。先将解剖针在酒精灯上烧灼灭菌，待解剖针冷却至室温后，挑取分离纯化后的细菌刺至幼苗的茎部，用脱脂药棉蘸取无菌水在接种处用封口膜绑缚，保湿5～7d；接种樱花根癌病菌前半小时取出待接菌，使培养菌的温度恢复至室温，然后开始接种。先将解剖针在酒精灯上烧灼灭菌，待解剖针冷却至室温后，挑取分离纯化后的细菌刺至幼苗根茎处，用脱脂药棉蘸取无菌水在接种处用封口膜绑缚，保湿5～7d。接种菌株h-b-1和病原菌菌株；单独接种病原菌菌株作为对照、不接菌作为空白对照，共三个处理，每个处理做5个重复，在室温为23士5℃的温室里培养生长。3周后观察是否发病。结果发现仅接种桃根癌病病菌的植株茎部明显肿大，同时接种菌株h-b-1和病原菌菌株的植株茎部略微肿大，表明h-b-1有一定的抗病作用(图3，左棵为仅接种病原菌，右棵为同时接种h-b-1和病原菌)。实施例4：蜡样芽孢杆菌菌株h-b-1野外防治樱花根癌病的抗病效果将蜡样芽孢杆菌菌株h-b-1施用于根癌病严重发生的野外田间地块，取母菌液2l，加水定容10l桶中，稀释5倍，搅拌混匀，加适当土搅拌至呈粘稠状，做成浆液。将裸根樱花苗逐一放入桶中浸没根部，待表面包裹一层泥浆后取出，放入事先挖好的土穴栽植。试验结果显示该菌株对一年生新造林地健康樱花具有良好的防治根癌病效果。根部沾浆法施用该菌株的100棵樱花苗木，其发病率为13.3％，远低于空白处理的53.3％。根瘤直径平均18.8mm，低于空白处理的28.58mm(表1)。因此判定该菌株能够有效防治樱花根癌病。除此之外h-b-1菌株对一年生樱花苗还具有优良的促生作用(表2)。表1、一年生樱花实验苗发病统计菌株发病率(％)根瘤直径(mm)成活率(％)ck53.328.5851h-b-113.318.891表2、一年生樱花苗生长量统计菌株苗高(cm)地径(mm)ck4.1±2.3b4.4±2.1bh-b-137.2±19.2a7.71±2.7a实施例5：蜡样芽孢杆菌菌株h-b-1对洋葱致病性测定。致病性测定参照sijam等(2005)的方法，用注射器取蜡样芽孢杆菌菌株h-b-1菌悬液(1×107～108cfu/ml)在洋葱鳞茎上两点对称注射(深度为1～2cm)，每点注射量为1ml。以灭菌水处理为对照。所有处理均重复3次，置于26℃培养，4～5天后检查结果。洋葱鳞茎接种试验表明，注射接种蜡样芽孢杆菌菌株h-b-1不引起洋葱鳞茎的腐烂，只是在接种处稍有干瘪凹陷。以上说明蜡样芽孢杆菌菌株h-b-1不是植物病原细菌，对植物具有安全性。实施例6：蜡样芽孢杆菌菌株h-b-1对苜蓿的接种试验。将h-b-1接种到nb培养基中，30℃下震荡(150mrp)培养24h，用无菌水调节菌悬液浓度到109左右用于接种。用laura的方法来准备要接种的苜蓿种子(lauraetal.，2002)。将紫花苜蓿种子用98％浓硫酸浸泡20分钟(约10ml浸300颗种子)，用500ml灭菌水清洗4次，然后泡在60ml灭菌水中，32℃下震荡(150prm)浸种6～8小时，再清洗2次，换水后同样条件培养过夜。次日再用灭菌水清洗2次后(每次60ml水)，用无菌镊子摆放到1％的水琼脂平板上等待接种，每皿摆放20颗种子。将水琼脂平板上的苜蓿种子用接种针在子叶上刺一个小孔，取20ml准备好的菌悬液点在伤口处，每菌株接种3个重复，每重复20颗种子，设2种ck处理，其中1个不作任何处理，另l个针刺接种无菌水。接种后的种子在37℃、70％相对湿度、定时光照(12h光照，12h黑暗)条件的人工气候箱中培养，7天后检查发病率。苜蓿接种结果显示，无论是ck还是接种处理，均无发病症状(接种点附近坏死、黄化和根畸)出现。苜蓿是代替老鼠作为测定bcc对动物毒性的模式植物(steveetal.，2003)，用苜蓿模型可简单快捷的检测出bcc菌株对哺乳动物是否具有致病性。上述试验结果说明蜡样芽孢杆菌菌株h-b-1对哺乳动物没有毒害性。sequencelisting<110>南京林业大学<120>一株有效防治樱花根癌病的蜡样芽孢杆菌h-b-1及其应用<130>100<160>1<170>patentinversion3.3<210>1<211>1444<212>dna<213>bacilluscereus<400>1gcggcgtgcctatacatgcaagtcgagcgaatggattaagagcttgctcttatgaagtta60gcggcggacgggtgagtaacacgtgggtaacctgcccataagactgggataactccggga120aaccggggctaataccggataacattttgaaccgcatggttcgaaattgaaaggcggctt180cggctgtcacttatggatggacccgcgtcgcattagctagttggtgaggtaacggctcac240caaggcaacgatgcgtagccgacctgagagggtgatcggccacactgggactgagacacg300gcccagactcctacgggaggcagcagtagggaatcttccgcaatggacgaaagtctgacg360gagcaacgccgcgtgagtgatgaaggctttcgggtcgtaaaactctgttgttagggaaga420acaagtgctagttgaataagctggcaccttgacggtacctaaccagaaagccacggctaa480ctacgtgccagcagccgcggtaatacgtaggtggcaagcgttatccggaattattgggcg540taaagcgcgcgcaggtggtttcttaagtctgatgtgaaagcccacggctcaaccgtggag600ggtcattggaaactgggagacttgagtgcagaagaggaaagtggaattccatgtgtagcg660gtgaaatgcgtagagatatggaggaacaccagtggcgaaggcgactttctggtctgtaac720tgacactgaggcgcgaaagcgtggggagcaaacaggattagataccctggtagtccacgc780cgtaaacgatgagtgctaagtgttagagggtttccgccctttagtgctgaagttaacgca840ttaagcactccgcctggggagtacggccgcaaggctgaaactcaaaggaattgacggggg900cccgcacaagcggtggagcatgtggtttaattcgaagcaacgcgaagaaccttaccaggt960cttgacatcctctgaaaaccctagagatagggcttctccttcgggagcagagtgacaggt1020ggtgcatggttgtcgtcagctcgtgtcgtgagatgttgggttaagtcccgcaacgagcgc1080aacccttgatcttagttgccatcattaagttgggcactctaaggtgactgccggtgacaa1140accggaggaaggtggggatgacgtcaaatcatcatgccccttatgacctgggctacacac1200gtgctacaatggacggtacaaagagctgcaagaccgcgaggtggagctaatctcataaaa1260ccgttctcagttcggattgtaggctgcaactcgcctacatgaagctggaatcgctagtaa1320tcgcggatcagcatgccgcggtgaatacgttcccgggccttgtacacaccgcccgtcaca1380ccacgagagtttgtaacacccgaagtcggtggggtaacctttttggagccagccgcctaa1440ggtg1444当前第1页12