一株具有降解bde-47能力的侧孢芽孢杆菌的制作方法
【专利摘要】一株具有降解BDE-47能力的侧孢芽孢杆菌，本发明涉及一株侧孢芽孢杆菌。本发明提供了一株芽孢杆菌，对BDE-47具有降解能力。本发明的一株具有降解BDE-47能力的侧孢芽孢杆菌为侧孢芽孢杆菌（Bacillus?laterospora）4-1，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址是北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日期为2013年12月20日，保藏号为CGMCC?No.8616。本发明克服了目前含BDE-47污染土壤生物处理中污染物去除效果差及紫外光解法、物理化学法成本高、易造成二次污染的缺陷。
【专利说明】一株具有降解BDE-47能力的侧孢芽孢杆菌
【技术领域】
[0001 ] 本发明涉及一株侧孢芽孢杆菌。
【背景技术】
[0002]含BDE-47 土壤属于极难处理的土壤之一。目前，对此类污染土壤一般采用紫外光解法、物理化法等技术处理，但由于这些方法存在成本高、易造成二次污染等缺点，所以难以在实际中应用。
[0003]极端环境微生物具有独特的基因类型，可以在极端环境下生存、繁衍。降解微生物是能在污染环境下生长、繁衍的一类极端微生物，因其特殊的生理机能，具有巨大的研究价值和实际应用价值。降解微生物在污染环境治理方面显示出巨大的开发潜力。
【发明内容】
[0004]本发明提供了一株芽孢杆菌，对BDE-47具有降解能力。
[0005]本发明的一株具有降解BDE-47能力的侧孢芽孢杆菌，它为侧孢芽孢杆菌(Bacillus laterospora) 4-1,保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址是北京市朝阳区北辰西路I号院3号，保藏日期为2013年12月20日，保藏号为CGMCC N0.8616。
[0006]本发明侧孢芽孢杆菌(Bacillus laterospora) 4-1属于革兰氏阳性好氧杆菌,侧孢芽孢杆菌长短多变，长为19 μ m~22 μ m,宽为6 μ m~9 μ m,有鞭毛；在固体培养基上生长菌落为红褐色，表面湿润，边缘不整齐，最适生长温度为30°C~37°C，最适生长pH为8~10。
[0007]本发明侧孢芽孢杆菌(Bacillus laterospora) 4_1可利用在以葡萄糖、鹿糖、乳糖、果糖为唯一碳源的培养基上均能生长。
[0008]本发明侧孢芽孢杆菌(Bacillus laterospora)4_l接触酶阳性、甲基红实验阳性、尿素反应阳性、吲哚实验阳性、氧化酶阴性性、淀粉水解阴性、苯丙氨酸脱氢酶阴性、伏普实验阴性、柠檬酸盐反应阴性。
[0009]本发明侧抱芽抱杆菌(Bacillus laterospora) 4-1通过16S rRNA基因序列比对分析与其最相近的种属是Bacillus aerius菌,相似性为99%,结合细菌形态特征、生长条件及生理生化鉴定结果，确定侧孢芽孢杆菌为Bacillus sp.属的一个新菌种，命名为侧孢芽抱杆菌(Bacillus laterospora) 4-1,侧抱芽抱杆菌(Bacillus laterospora) 4-1 为侧孢芽孢杆菌模式菌株。
[0010]本发明侧孢芽孢杆菌(Bacillus laterospora) 4-1具有处理BDE-47污染土壤的功能，BDE-47污染土壤中污染物去除率较高、费用低、不造成二次污染，本发明侧孢芽孢杆菌为生物处理BDE-47污染土壤及极端微生物的研究奠定了物质基础。
[0011]本发明侧孢芽孢杆菌(Bacillus laterospora)4_l,它属于芽孢杆菌属(Bacilluslaterospora),保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心,保藏地址是北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日期为2013年12月20日，保藏号为CGMCC N0.8616。[0012]本发明的有益效果:
[0013]1、本发明提供了一株BDE-47降解菌株，并应用于BDE-47污染土壤的生物强化处理，克服了目前含BDE-47污染土壤生物处理中污染物去除效果差及紫外光解法、物理化学法成本高、易造成二次污染的缺陷；
[0014]2、本发明微生物好氧降解法中，采用微生物在处理BDE-47 (土壤持久性有机污染物)污染土壤时具有很大的优势，污染物浓度在100 μ g/L时，微生物仍然具有较好的降解作用，从而具有较好的BDE-47污染土壤处理效果。
【专利附图】
【附图说明】
[0015]图1是本发明侧孢芽孢杆菌1000倍的革兰氏染色图；
[0016]图2是本发明侧孢芽孢杆菌15000倍的原子力显微镜观察图；
[0017]图3是本发明侧孢芽孢杆菌和相近菌株的16S rRNA基因序列构建的NJ系统发育树图。
【具体实施方式】
[0018]本发明技术方案不局限于以下所列举【具体实施方式】，还包括各【具体实施方式】间的任意组合。
[0019]【具体实施方式】一:本实施方式一株具有降解BDE-47能力的侧孢芽孢杆菌,它为侧孢芽孢杆菌(Bacillus laterospora) 4-1,保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址是北京市朝阳区北辰西路I号院3号，保藏日期为2013年12月20日，保藏号为 CGMCC N0.8616。
[0020]本实施方式侧孢芽孢杆菌(Bacillus laterospora) 4-1属于革兰氏阳性好氧杆菌，侧孢芽孢杆菌长短多变，长为19 μ m~22 μ m,宽为6 μ m~9 μ m,有鞭毛(如图2所示)；在固体培养基上生长菌落为红褐色，表面湿润，边缘不整齐(如图1所示)，最适生长温度为30°C~37°C，最适生长pH为8~10。
[0021]本实施方式侧孢芽孢杆菌(Bacillus laterospora) 4_1在以葡萄糖、鹿糖、乳糖、果糖为唯一碳源的培养基上均能生长。
[0022]参照《伯杰细菌鉴定手册》第八版和《常见细菌系统鉴定手册》对侧孢芽孢杆菌进行生理生化鉴定:侧孢芽孢杆菌接触酶阳性、甲基红实验阳性、尿素反应阳性、吲哚实验阳性、氧化酶阴性性、淀粉水解阴性、苯丙氨酸脱氢酶阴性、伏普实验阴性、柠檬酸盐反应阴性。
[0023]本实施方式侧孢芽孢杆菌(Bacillus laterospora) 4-1能够在BDE-47浓度为100 μ g/L, pH为8~10的环境中生长。
[0024]本实施方式的有益效果:
[0025]1、本实施方式提供了一株BDE-47降解菌株，并应用于BDE-47污染土壤的生物强化处理，克服了目前含BDE-47污染土壤生物处理中污染物去除效果差及紫外光解法、物理化学法成本高、易造成二次污染的缺陷；
[0026]2、本实施方式微生物好氧降解法中，采用微生物在处理BDE-47 (土壤持久性有机污染物)污染土壤时具有很大的优势，污染物浓度在100 μ g/L时，微生物仍然具有较好的降解作用，从而具有较好的BDE-47污染土壤处理效果。
[0027]【具体实施方式】二:本实施方式的侧孢芽孢杆菌是从浙江省台州市路桥区峰江镇白枫岙村电子垃圾拆解处土壤中筛选得到的。筛选按以下步骤进行:一、取电子垃圾拆解处土壤IOg置于90mL灭菌无机盐液体培养基中，于35°C，120r/min震荡培养4h，静置2h，取上清液10mL，置于90mL以BDE-47为唯一碳源的无机盐液体培养基中，整个反应体系的BDE-47终浓度为100 μ g/L ;二、然后在35°C，120r/min条件下震荡培养8~10天；8~10天后，取IOmL菌液置于90mL以BDE-47为唯一碳源的无机盐液体培养基中，整个反应体系的BDE-47终浓度为100μ g/L ;三、重复步骤二的操作过程3次；四、应用稀释涂布平板法、四区划线和一区划线纯化培养，即可得到具有降解BDE-47能力的侧孢芽孢杆菌。
[0028]本实施方式中每升无机盐液体培养基含3.5g Na2HPO4.2H20、Ig KH2PO4,
0.5g (NH4)2SO4'0.1g MgCl2.6Η20、0.05g Ca (NO3) 2.4Η20 和余量的去离子水。本实施方式中每升固体培养基含IOg蛋白胨、5g酵母浸膏、lOgNaCl、15~20g琼脂和余量的去离子水，并调节培养基pH至7~7.5，均在121°C下灭菌20min。[0029]参照《伯杰细菌鉴定手册》第八版和《常见细菌系统鉴定手册》对筛选得到的BDE-47降解菌株进行生理生化鉴定，通过16S rRNA的扩增、测序及同源性比较鉴定筛选得到的降解菌株，按以下步骤进行:用细菌基因组DNA提取试剂盒提取筛选得到的降解菌株的总DNA，并用通用引物进行PCR扩增，16S rRNA序列的上游引物BlOlF:5 ' -TGGCGGACGGGTGAGTAA-3 '、下游引物 BA534R:5 ' -ATTACCGCGGCTGCTGG-3 '。PCR 反应体系为25 μ L:上游引物和下游引物各0.5μ L, DNA提取液lyL，2XMasterMixl2.5yL和剩余的双蒸水。PCR反应程序为:95°C下预变性5min，94°C下变性40s，57°C下退火40s，72°C下延伸40s。30个循环，最后在72°C下延伸8min。将所得PCR产物进行1.0%琼脂糖凝胶电泳，委托北京博迈德科技发展有限公司进行PCR产物的纯化及16S rRNA测序。
[0030]本实施方式筛选得到的侧孢芽孢杆菌的16S rRNA序列长度为1000bp (如序列表Seq ID No:1所示),其序列提交至GenBank,以确定菌株的种属关系。同源性分析结果表明，该序列与空气芽孢杆菌(Bacillus aerius)菌的16SrRNA序列的同源性最高，保守区相似性为99%，结合细菌形态特征、生长条件和生理生化鉴定结果，发现两者间存在明显区别，与本属其它菌种的区别更为明显，确定侧孢芽孢杆菌属于一个新菌种，命名为侧孢芽孢杆菌(Bacillus laterospora)4-1。根据侧孢芽孢杆菌和相近菌株的16S rRNA基因序列，采用MEGA4软件邻接法(Neighbor-Joining，NJ)构建的NJ系统发育树，侧孢芽孢杆菌和相近菌株的16S rRNA基因序列构建的NJ系统发育树图如图3所示。
[0031]PCR引物购买自北京博迈德科技发展有限公司，细菌基因组DNA提取试剂盒购自于北京博迈德科技发展有限公司，其他试剂购自于北京生工生物工程有限公司。
[0032]对本实施方式的侧孢芽孢杆菌(Bacillus laterospora) 4-1进行功能验证:
[0033]侧孢芽孢杆菌(Bacillus laterospora) 4-1处理污染物BDE-47,具体如下:反应体系中BDE-47浓度为50 μ g/L,处理8天，BDE-47的去除率为95%。实验证明侧孢芽孢杆菌(Bacillus laterospora) 4-1具有强化处理污染物BDE-47的功能,可以明显去除污染物，而且无需添加其它化学制剂，大幅度降低了处理成本，避免了二次污染。
[0034]另外，在反应体系中BDE-47浓度为100 μ g/L，处理8天，BDE-47的去除率为47.5%。表明侧孢芽孢杆菌(Bacillus laterospora) 4-1在高浓度的BDE-47下，仍然具较好的降解作用，从而具有较好的BDE-47处理 效果。
【权利要求】
1.一株具有降解BDE-47能力的侧孢芽孢杆菌，其特征在于它为侧孢芽孢杆菌(Bacillus laterospora) 4-1,保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址是北京市朝阳区北辰西路I号院3号，保藏日期为2013年12月20日，保藏号为CGMCC N0 .8616。
【文档编号】C12R1/07GK103740626SQ201410040222
【公开日】2014年4月23日 申请日期:2014年1月27日 优先权日:2014年1月27日
【发明者】王继华, 关健飞, 刘翔, 杨雪辰, 龚雪, 张珊珊, 朱丹 申请人:哈尔滨师范大学