近平滑假丝酵母zjph1305及在手性醇制备中的应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一株新菌种--近平滑假丝酵母(Candida?parapsilosis)ZJPH1305及在微生物催化不对称还原5-(4-氟苯)-5-酮基戊酸制备高光学纯度(5S)-(4-氟苯)-5-羟基戊酸中的应用，本发明通过采用近平滑假丝酵母（Candida?parapsilosis）ZJPH1305细胞为催化剂的手性生物催化，当底物浓度为47.62mmol/L，辅助底物葡萄糖终浓度为100g/L时，目的产物(5S)-(4-氟苯)-5-羟基戊酸的e.e值达到99.9%，产率达到95.37%。
【专利说明】近平滑假丝酵母ZJPH1305及在手性醇制备中的应用
(-)【技术领域】
[0001]本发明涉及一株近平滑假丝酵母及应用，特别涉及一株新菌株-近平滑假丝酵母(Candida parapsilosis) ZJPH1305,以及在微生物催化不对称还原5-(4-氟苯)-5-酮基戍酸制备高光学纯度(5S) - (4-氟苯)-5-羟基戊酸中的应用。
(二)【背景技术】
[0002]式(I)所示的(5S)-(4-氟苯)-5_羟基戍酸是合成药物依替米贝(Ezetimibe,商品名为Zetia?)的重要手性中间体。依替米贝化学名为1-(4-氟苯基)-(31?)-[3-(4-氟苯基)-(3S)-羟基丙基]-(4S) - (4-羟基苯基)-2-氮杂环丁烷酮。2002年美国食品药品监督管理局(FDA)批准依替米贝用于治疗高脂血症。依替米贝是默克和先灵葆雅研发的一类新型的选择性胆固醇吸收抑制剂，其被吸收后在肝脏中与葡萄糖醛酸结合，经肝肠循环，几乎特异地定位于小肠黏膜细胞，然后结合小肠刷状缘膜小囊泡上膜蛋白，抑制胆固醇的吸收，从而降低胆固醇含量。2002年11月在德国首先上市，同期在美国、英国、瑞士、瑞典上市。研究证实，依替米贝是有效的胆固醇吸收抑制剂，与他汀类降脂药物联用效果更好。美国FDA于2004年8月23日正式批准默克和先灵葆雅共同研发的二合一降胆固醇新药依替米
贝/辛伐他汀(Vytorin? )上市。Vytorin?是一种复方药，其可以通过两个途径来降低胆固醇:一种途径是阻止来源于食物的肠内胆固醇的吸收，另一种途径是抑制肝脏胆固醇的合成。2010年依替米贝(Zetia'?)的销售额为16.66亿美元，依替米贝/辛伐他汀复方
药(Vytorin? )的销售额为15.52亿美元。
[0003]
【权利要求】
1.近平滑假丝酵母(Candidaparapsilosis) ZJPH1305,保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏日期为2013年11月8日，地址:中国，武汉，武汉大学，保藏编号=CCTCC NO:M2013559。
2.—种权利要求1所述近平滑假丝酵母ZJPH1305在制备(5S)-(4-氟苯)_5_羟基戊酸中的应用，其特征在于所述的应用为:以5-(4-氟苯)-5-酮基戊酸为底物，以近平滑假丝酵母ZJPH1305经发酵培养获得的湿菌体为酶源，在25°C~35°C条件下，于pH为6.0~8.5的缓冲液构成的反应体系中进行转化反应,反应结束后,将反应液离心,取上清液,加入等体积的乙酸乙酯萃取两次，合并萃取层，得到含(5S) - (4-氟苯)-5-羟基戊酸的乙酸乙酯溶液。
3.如权利要求2所述应用，其特征在于所述反应体系中，底物的初始浓度为4.76~119.05mmol/L，近平滑假丝酵母ZJPH1305湿菌体的添加量以菌体干重计为30.4~91.2g/L0
4.如权利要求2所述应用，其特征在于所述反应是在25°C~35°C条件下反应12~60小时。
5.如权利要求2所述应用，其特征在于所述反应体系中还添加有辅助底物构成转化体系，所述辅助底物为下列之一:①葡萄糖、②蔗糖、③麦芽糖、④异丙醇、⑤甲醇或⑥乙醇。
6.如权利要求5所述应用，其特征在于所述辅助底物为葡萄糖、蔗糖或麦芽糖，辅助底物终浓度为20~200g/L转化体系。
7.如权利要求5所述应用，其特征在于所述辅助底物为异丙醇、甲醇或乙醇，辅助底物体积终浓度为10%~30%。·
8.如权利要求5所述应用，其特征在于所述辅助底物为葡萄糖，所述葡萄糖的终浓度为75~125g/L反应体系。
9.如权利要求2所述应用，其特征在于所述酶源按如下步骤制备: 1)斜面培养:将近平滑假丝酵母ZJPH1305单菌落接种至斜面培养基，30°C培养2~3天，4°C冰箱保存，获得斜面菌体；斜面培养基终浓度组成为:葡萄糖15g/L，蛋白胨7.5g/L，酵母膏 6g/L，(NH4) 2S043g/L，KH2PO4L 5g/L，NaCl0.75g/L，MgSO4.7Η200.75g/L，琼脂 20g/L，溶剂为水，PH6.5 ； 2)种子培养:从培养成熟的斜面挑一环菌体接入装有IOOmL种子培养基的250mL摇瓶中，30°C，200rpm培养24小时，获得种子液；种子培养基终浓度组成为:葡萄糖15g/L，蛋白胨 20g/L，酵母膏 10g/L，(NH4) 2S042g/L，KH2P042g/L，NaCl1.0g/L，MgSO4.7Η200.5g/L，溶剂为水，pH6.5 ； 3)发酵培养:将种子液以体积浓度10%的接种量接种至发酵培养基，30°C、200rpm摇床培养48h，将发酵液离心，所得沉淀用pH6.0的磷酸缓冲液洗涤，弃去洗涤液，收集湿菌体即为酶源；所述发酵培养基终浓度组成同种子培养基。
10.如权利要求9所述应用，其特征在于所述应用为:将近平滑假丝酵母ZJPH1305经发酵培养获得的湿菌体加入至0.2M、pH6.0的磷酸缓冲液中，再加入5-(4-氟苯)_5_酮基戊酸和葡萄糖构成转化体系，30°C，200rpm摇床振荡反应24~48小时，反应结束后将反应液离心，取上清液，加入等体积的乙酸乙酯萃取两次，合并萃取层，得到含(5S) - (4氟苯)-5_羟基戊酸的乙酸乙酯溶液；所述湿菌体加入量以菌体干重计为30.4~60.8g/L，所述底物初始浓度为4.76~47.·62mmol/L，葡萄糖终浓度为100g/L。
【文档编号】C12P7/42GK103849574SQ201410040143
【公开日】2014年6月11日 申请日期:2014年1月27日 优先权日:2014年1月27日
【发明者】王普, 金保军, 黄金, 孙婧, 何军邀 申请人:浙江工业大学