一种奶牛乳房炎疫苗的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种奶牛乳房炎疫苗。本发明提供的一种奶牛乳房炎疫苗，其活性成分为灭活后的菌株EBMO9、灭活后的菌株SACP5-9、灭活后的菌株SACP8-6、灭活后的菌株SACP336-3、灭活后的菌株SAWR-6、灭活后的菌株SDTR-9和灭活后的菌株SURF-5。本发明提供的疫苗具有高效、通用、安全、稳定、剂型多样等优点，将是奶牛乳房炎疫苗发展的新里程碑。
【专利说明】一种奶牛乳房炎疫苗
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种奶牛乳房炎疫苗。
【背景技术】
[0002]奶牛乳房炎(Bovine Mastitis)是危害畜牧业发展、食品安全的重大传染病,特别是近年来，随着环境的改变、抗生素的滥用，产生了多种耐药菌甚至出现了超级细菌，由细菌感染引发的奶牛乳房炎发病率和死亡率逐年攀升，严重危害了畜牧业发展和食品安全，进而危害了人类健康。因奶牛乳房炎造成的经济损失，美国每年达30亿美元、英国4亿美元，我国35亿元以上。奶牛乳房炎分为临床型和隐性型。临床型的症状为:乳区发热、肿痛，泌乳量减少，乳清性状发生改变，细菌数增多、体细胞增加，重者并发多器官衰竭甚至死亡。隐性型没有特异的临床表现，通过体细胞、产奶量及质量检测才能检出，但奶牛罹患率比临床型高得多，造成病原微生物的进一步播散，在一定条件下会转化成临床型，实际损失比临床型闻得多。
[0003]引发奶牛乳房炎的病原菌均达140余种。据临床流行病学资料显示，我国奶牛乳房炎的病原菌以大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和链球菌为主，占细菌感染的91.4%，其中大肠杆菌占30%，金黄色葡萄球菌占46%，链球菌占40%。基于O抗原大肠杆菌可分为多个血清型，奶牛乳房炎可能由一种血清型的大肠杆菌引起的，也可能是由多个血清型的大肠杆菌的混合物引起的。金黄色葡萄球菌以5型金黄色葡萄球菌(又称金黄色葡萄球菌荚膜多糖血清型5型)、8型金黄色葡萄球菌(又称金黄色葡萄球菌荚膜多糖血清型8型)和336型金黄色葡萄球菌(又称金黄色葡萄球菌荚膜多糖血清型336型)为主(三者占金黄色葡萄球菌感染的95%以上)，与当前国际报道感染菌种、血清型及流行趋势一致。链球菌以无乳链球菌、停乳链球菌、乳房链球菌为主(三者占链球菌感染的92%以上)，与当前国际报道感染菌种、血清型及流行趋势一致。
【发明内容】
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[0004]本发明的目的是提供一种奶牛乳房炎疫苗。
[0005]本发明保护菌株EBM09、菌株SACP5-9、菌株SACP8-6、菌株SACP336-3、菌株SAWR-6、菌株SDTR-9和菌株SURF-5在制备奶牛乳房炎疫苗中的应用。所述奶牛乳房炎为大肠杆菌和/或金黄色葡萄球菌和/或链球菌引起的奶牛乳房炎。所述大肠杆菌具体可为所述菌株EBM09、大肠杆菌重组工程菌株X-10、大肠杆菌重组工程菌株X-89、大肠杆菌重组工程菌株X-326、大肠杆菌重组工程菌株X-2138、大肠杆菌重组工程菌株X-2555、大肠杆菌ATCC31617、大肠杆菌ATCC55235、大肠杆菌ATCC43895或大肠杆菌ATCC25922。所述金黄色葡萄球菌具体可为菌株SACP5-9、菌株SACP8-6、菌株SACP336_3、5型金黄色葡萄球菌ATCC4952U8型金黄色葡萄球菌ATCC49525、336型金黄色葡萄球菌ATCC55804、5血清型金葡菌奶牛乳房炎流行优势株、8血清型金葡菌奶牛乳房炎流行优势株或336血清型金葡菌奶牛乳房炎流行优势株。所述链球菌可为无乳链球菌、停乳链球菌或乳房链球菌。所述链球菌具体可为菌株SAWR-6、菌株SDTR-9、菌株SURF-5、无乳链球菌ATCC51487、停乳链球菌ATCC43078、乳房链球菌ATCC19436、奶牛乳房炎无乳链球菌流行优势株、奶牛乳房炎停乳链球菌流行优势株或奶牛乳房炎乳房链球菌流行优势株。
[0006]本发明还保护一种奶牛乳房炎疫苗，其活性成分为灭活后的菌株；所述灭活后的菌株为灭活后的菌株EBM09、灭活后的菌株SACP5-9、灭活后的菌株SACP8-6、灭活后的菌株SACP336-3、灭活后的菌株SAWR-6、灭活后的菌株SDTR-9和灭活后的菌株SURF-5。具体来说，所述疫苗中，所述灭活后的菌株EBM09、所述灭活后的菌株SACP5-9、所述灭活后的菌株SACP8-6、所述灭活后的菌株SACP336-3、所述灭活后的菌株SAWR-6、所述灭活后的菌株SDTR-9和所述灭活后的菌株SURF-5的浓度均为IX 101°个细菌/mL。所述疫苗还可包括佐剂。所述佐剂为SPOl佐剂、铝佐剂或白花油佐剂。所述疫苗的剂型为乳头管注射剂型、皮下注射剂型或肌肉注射剂型。所述奶牛乳房炎为大肠杆菌和/或金黄色葡萄球菌和/或链球菌引起的奶牛乳房炎。所述大肠杆菌具体可为所述菌株EBM09、大肠杆菌重组工程菌株X-10、大肠杆菌重组工程菌株X-89、大肠杆菌重组工程菌株X-326、大肠杆菌重组工程菌株X-2138、大肠杆菌重组工程菌株X-2555、大肠杆菌ATCC31617、大肠杆菌ATCC55235、大肠杆菌ATCC43895或大肠杆菌ATCC25922。所述金黄色葡萄球菌具体可为菌株SACP5-9、菌株SACP8-6、菌株SACP336-3、5型金黄色葡萄球菌ATCC49521、8型金黄色葡萄球菌ATCC49525、336型金黄色葡萄球菌ATCC55804、5血清型金葡菌奶牛乳房炎流行优势株、8血清型金葡菌奶牛乳房炎流行优势株或336血清型金葡菌奶牛乳房炎流行优势株。所述链球菌可为无乳链球菌、停乳链球菌或乳房链球菌。所述链球菌具体可为菌株SAWR-6、菌株SDTR-9、菌株SURF-5、无乳链球菌ATCC51487、停乳链球菌ATCC43078、乳房链球菌ATCC19436、奶牛乳房炎无乳链球菌流行优势株、奶牛乳房炎停乳链球菌流行优势株或奶牛乳房炎乳房链球菌流行优势株。
[0007]本发明还保护一种奶牛乳房炎疫苗，其活性成分为灭活后的菌株和荚膜多糖；所述灭活后的菌株为灭活后的菌株EBM09、灭活后的菌株SACP5-9、灭活后的菌株SACP8-6、灭活后的菌株SACP336-3、灭活后的菌株SAWR-6、灭活后的菌株SDTR-9和灭活后的菌株SURF-5 ;所述荚膜多糖为所述`菌株SACP5-9的荚膜多糖、所述菌株SACP8-6的荚膜多糖、所述菌株SACP336-3的荚膜多糖、所述菌株SAWR-6的荚膜多糖、所述菌株SDTR-9的荚膜多糖和所述菌株SURF-5的荚膜多糖。具体来说，所述疫苗中，所述灭活后的菌株EBM09、所述灭活后的菌株SACP5-9、所述灭活后的菌株SACP8-6、所述灭活后的菌株SACP336-3、所述灭活后的菌株SAWR-6、所述灭活后的菌株SDTR-9和所述灭活后的菌株SURF-5的浓度均为IXlO10个细菌/mL，所述菌株SACP5-9的荚膜多糖、所述菌株SACP8-6的荚膜多糖、所述菌株SACP336-3的荚膜多糖、所述菌株SAWR-6的荚膜多糖、所述菌株SDTR-9的荚膜多糖和所述菌株SURF-5的荚膜多糖的浓度均为40 μ g/ml。所述疫苗还可包括佐剂。所述佐剂为SPOl佐剂、铝佐剂或白花油佐剂。所述疫苗的剂型为乳头管注射剂型、皮下注射剂型或肌肉注射剂型。所述奶牛乳房炎为大肠杆菌和/或金黄色葡萄球菌和/或链球菌引起的奶牛乳房炎。所述大肠杆菌具体可为所述菌株EBM09、大肠杆菌重组工程菌株X-10、大肠杆菌重组工程菌株X-89、大肠杆菌重组工程菌株X-326、大肠杆菌重组工程菌株X-2138、大肠杆菌重组工程菌株X-2555、大肠杆菌ATCC31617、大肠杆菌ATCC55235、大肠杆菌ATCC43895或大肠杆菌ATCC25922。所述金黄色葡萄球菌具体可为菌株SACP5-9、菌株SACP8-6、菌株SACP336-3、5型金黄色葡萄球菌ATCC49521、8型金黄色葡萄球菌ATCC49525、336型金黄色葡萄球菌ATCC55804、5血清型金葡菌奶牛乳房炎流行优势株、8血清型金葡菌奶牛乳房炎流行优势株或336血清型金葡菌奶牛乳房炎流行优势株。所述链球菌可为无乳链球菌、停乳链球菌或乳房链球菌。所述链球菌具体可为菌株SAWR-6、菌株SDTR-9、菌株SURF-5、无乳链球菌ATCC51487、停乳链球菌ATCC43078、乳房链球菌ATCC19436、奶牛乳房炎无乳链球菌流行优势株、奶牛乳房炎停乳链球菌流行优势株或奶牛乳房炎乳房链球菌流行优势株。
[0008]所述“灭活后的菌株”可通过将所述菌株进行甲醛灭活得到。所述“灭活后的菌株”具体通过如下方法得到:取菌株，用PBS缓冲液重悬，然后加入37-40%甲醛溶液并使甲醛浓度为0.4%(体积比)，37°C、150rpm振荡孵育36_48h，离心(离心参数具体可为:5000r/min, 20min)收集菌体，用灭菌后的PBS缓冲液洗涤菌体，然后用灭菌后的PBS缓冲液悬浮菌体，得到“灭活后的菌株”(含I X IOltl个细菌/mL)。
[0009]所述荚膜多糖的制备方法具体如下:
[0010](1)取菌株，接种于BHI培养基，37°C、150rpm振荡培养18h。
[0011](2)取步骤(1)得到的菌液，接种至BHI培养基，在发酵罐中37°C发酵(发酵初始时刻，菌株的菌浓度为2X IO8个/ml，发酵罐温度为37°C，发酵罐的初始转速为198r/min，罐压保持在0.05MPa,用8%Na0H水溶液或5%盐酸水溶液调节发酵体系的pH为7.0-7.2，通过增加发酵罐转速和/或增加通气量维持发酵体系的溶氧量为25-35%，发酵体系的溶氧量高于35%时停止发酵)；
[0012](3)取步骤(2)得到的发酵体系，加入37-40%甲醛溶液并使甲醛浓度为0.4% (体积比)，25°C、150rpm振荡孵育24h，然后4°C、3000rpm离心15min，收集上清液；
[0013](4)取步骤(3)得到的上清液，加入十六烷基三甲基溴化铵并使其浓度为lg/100ml，室温、120rpm振荡孵育I小时，然后4°C静置16小时，然后1000Orpm离心30min，
收集沉淀(复合多糖)；
[0014](5)取步骤(4)得到的沉淀，溶于2M氯化钙水溶液(沉淀与氯化钙水溶液的配比为0.2-0.5g:ml),研磨,然后加入与2M氯化|丐水溶液等体积的水,室温、120rpm振荡孵育Ih,然后加入乙醇并使其浓度为25%(体积比)，41:静置3h，然后4°C、5000rpm离心30min，收集
上清液；
[0015](6)取步骤(5)得到的上清液，加入乙醇并使其浓度为80%(体积比)，4°C静置3h，然后4°C、1000Orpm离心15min，收集沉淀，依次用乙醇和丙酮洗涤，干燥，得到干物质(粗糖)；
[0016](7)取步骤(6)得到的干物质，溶于10g/100mL乙酸钠水溶液(干物质与乙酸钠水溶液的配比为10-20mg:ml)，加入2倍于乙酸钠水溶液体积的酚溶液(100g结晶酚溶于 40mlIOg/IOOmL 乙酸钠水溶液)，4 °C、120rpm 振荡 20_30min，然后 4 °C、lOOOOrpm、离心20min,取最上层液相；
[0017](8)取步骤(7)得到的液相，加入2倍体积的酚溶液(100g结晶酚溶于40mll0g/100mL 乙酸钠水溶液)，4 °C、120rpm 振荡 20_30min,然后 4 °C、lOOOOrpm、离心20min,取最上层液相；
[0018](9)取步骤(8)得到的液相，在0.1M氯化钙水溶液中透析；
[0019](10)取步骤(9)得到的溶液，加入乙醇并使其浓度为75% (体积比)，4°C静置3h，然后4°C、lOOOOrpm离心20min，收集沉淀，依次用乙醇和丙酮洗涤，干燥，得到干物质(荚膜
多糖)。[0020]所述SPOl佐剂具体如下:溶剂为水，含2g/100mL角鲨烯、0.lg/100mL聚氧乙烯蓖麻油和0.1g/1OOmL聚醚多元醇。
[0021 ] 所述铝佐剂具体可为氢氧化铝。
[0022]所述疫苗具体可为实施例3中制备的疫苗-1、疫苗-11、疫苗-1I1、疫苗-1V、疫苗-V、疫苗-V1、疫苗Vn或疫苗珊。
[0023]以上任一所述奶牛具体可为中国荷斯坦奶牛。
[0024]本发明还保护菌株ΕΒΜ09、菌株SACP5-9、菌株SACP8-6、菌株SACP336-3、菌株SAWR-6、菌株SDTR-9和菌株SURF-5。当以上三种菌株之间为“和”的关系时，七个菌株的数量比具体可为1:1:1:1:1:1:1。
[0025]大肠埃希氏菌(Escherichiacoli)EBM09，简称菌株 EBM09，已于 2013 年 12 月 09日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址为:北京市朝阳区北辰西路I号院3号)，保藏号为CGMCC N0.8532。
[0026]金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus) SACP5-9,简称菌株 SACP5-9,已于2013年12月09日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCCJi址为:北京市朝阳区北辰西路I号院3号)，保藏号为CGMCC N0.8529。
[0027]金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus) SACP8-6,简称菌株 SACP8-6,已于2013年12月09日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCCJi址为:北京市朝阳区北辰西路I号院3号)，保藏号为CGMCC N0.8530。
[0028]金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus) SACP336-3,简称菌株SACP336-3,已于2013年12月09日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCCJi址为:北京市朝阳区北辰西路I号院3号)，保藏号为CGMCC N0.8531。
[0029]无乳链球菌(Streptococcusagalactiae) SAWR-6,简称菌株 SAWR-6,已于 2013 年12月09日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址为:北京市朝阳区北辰西路I号院3号)，保藏号为CGMCC N0.8533。
[0030]停乳链球菌(Streptococcusdysgalactiae) SDTR-9,简称菌株 SDTR-9,已于 2013年12月09日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址为:北京市朝阳区北辰西路I号院3号)，保藏号为CGMCC N0.8534。
[0031]乳房链球菌(Streptococcusuberis) SURF-5,简称菌株 SURF-5,已于 2013 年 12月09日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址为:北京市朝阳区北辰西路I号院3号)，保藏号为CGMCC N0.8535。
[0032]对于奶牛乳房炎来说，最理想的防控手段为通过接种疫苗，其目的就是增强机体免疫应答反应，特别是乳腺组织的免疫应答反应来阻止、中和、杀灭外界进入的病原微生物，但由于乳房本身的生理特点给有效免疫力的产生带来了了一系列特殊的挑战。第一，乳腺中的牛奶会稀释抗感染的嗜中性粒细胞的浓度，而且牛奶中的一些成分，像脂肪和酪蛋白能降低抗感染嗜中性粒细胞的杀菌能力。第二，奶牛饲养有大量可引起乳房炎的微生物的环境中，而且奶汁本身给病原菌生长提供了温床。因此，使奶牛乳腺产生有效的免疫力，降低乳房炎的发生率，需要攻克的难题较多，给奶牛乳房炎疫苗研发提出比其它传染病疫苗更高的要求。
[0033]疫苗是通过增强机体免疫系统的功能从而使机体获得天然的抗病能力，并且疫苗具有安全、稳定、有效等特点，因此研制安全、有效的奶牛乳房炎疫苗成为防控乳房炎的必由选择。研发适宜本国流行代表菌株和环境的疫苗势在必行。
[0034]本发明提供的疫苗具有高效、通用、安全、稳定、剂型多样等优点，本发明为安全、高效、全面有效预防细菌感染性奶牛乳房炎提供了有力保证，将是奶牛乳房炎疫苗发展的新里程碑。
【具体实施方式】
[0035]以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。实施例中的PBS缓冲液，如无特殊说明均为pH7.2,0.01M的无热源PBS缓冲液。
[0036]大肠杆菌重组工程菌株X-10、大肠杆菌重组工程菌株X-89、大肠杆菌重组工程菌株X-326、大肠杆菌重组工程菌株X-2138和大肠杆菌重组工程菌株X-2555均记载于如下文献:奶牛大肠杆菌乳房炎灭活疫苗及其制备方法(申请号:201010550056.6 ;申请
【发明者】杨鹏辉, 王林叶, 孙治华, 王欢, 孙科, 孙艺萍, 段跃强, 李敏 申请人:内蒙古华希生物科技有限公司