一种新的融合蛋白及用其制备的嗜肺军团菌疫苗的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种新的融合蛋白，它的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，还公开前述融合蛋白的制备方法和用途，以及采用前述融合蛋白制备的疫苗。本发明融合蛋白可以有效抑制嗜肺军团菌感染，具有良好的应用前景。
【专利说明】一种新的融合蛋白及用其制备的嗜肺军团菌疫苗
【技术领域】
[0001] 本发明涉及基因工程领域，具体涉及一种新的融合蛋白及用其制备的嗜肺军团菌 疫苗。
【背景技术】
[0002] 嗜肺军团菌（Legionella pneumonia)广泛存在于自然界各种水体环境中，属于 革兰氏阴性兼性胞内致病菌，可寄生于原虫中，作为一种病原体，它可侵入哺乳动物巨噬细 胞，逃避吞噬体和溶酶体的杀伤作用，并在其中繁殖。
[0003] 嗜肺军团菌可以感染人体或动物体，引起一种以非典型肺炎或pantiac热为 主要表现常伴有多系统损害的急性细菌性传染病--军团病，病程进展快，免疫功能低 下者易感染，由于其症状不典型，常备误诊误治，病死率高，易爆发流行，国外监测结果 显示，嗜肺军团菌病例数逐年升高，且致死率较高，其引起的常见并发症如脓毒血症、多 器官衰竭、间歇性肺炎、肺纤维化致死率均较高（Huang SW, Hsu BM, et al. Water Sci Technol, 60 (5) : 1303-1310, 2009)，必须引起重视。
[0004] 目前，军团病的治疗主要采用大环内酯类和喹诺酮类抗生素，但其临床有效率较 低，还会导致机体产生耐药性。接种疫苗是一种比较好的防治方式，然而，尽管嗜肺军团菌 疫苗的研制已有近20年的历史，也出现了灭活全菌疫苗、蛋白亚单位疫苗、基因疫苗等疫 苗，但都引起各自的不足难以在临床推广应用，如，全菌体灭活疫苗在人类群体中普遍存在 多种较严重的不良反应，DNA疫苗的研究虽然具有良好的实验前景，但其作用机制尚不明 确，应用于人体后其安全性有待进一步评价，目前制备的亚单位疫苗对胞内菌清除效果不 佳，免疫保护性低。
[0005] 因此，研发安全有效的嗜肺军团菌疫苗成为迫切需要解决的问题。
【发明内容】
[0006] 为了解决上述问题，本发明提供了一种新的融合蛋白及其用其制备的嗜肺军团菌 疫苗。
[0007] 本发明融合蛋白，它的氨基酸序列如SEQ ID NO. 2所示。
[0008] 编码权利要求1所述融合蛋白的核苷酸序列，其序列如SEQ ID NO. 1所示的。
[0009] 本发明重组载体，它包括SEQ ID NO. 1核苷酸序列。优选地，它是pET30a重组载 体。
[0010] 本发明重组菌，它包括前述的重组载体。优选地，它为重组大肠杆菌。
[0011] 本发明制备前述融合蛋白的方法，它包括如下步骤：
[0012] (1)取前述重组菌，接种到大肠杆菌培养基中，34?40°C培养至OD6tltl=O. 6?0? 8 ;
[0013] (2)加入IPTG至终浓度为0. 4?0. 6mmol/L，在15?25°C的条件下，诱导培养8? 16小时；
[0014] (3)收集菌体，超声破菌，离心，取沉淀分离纯化，即得。
[0015] 步骤（I)中，大肠杆菌培养基为LB液体培养基，培养温度为37°C。
[0016] 步骤（2)中，IPTG的终浓度为0. 5mmol/L，温度为21°C，培养时间为12h。
[0017] 步骤（3)中，所述超声破菌的步骤是：将菌体置于lOmmol/LTris-HCl溶液中，在功 率500W的条件下处理30次，每次10s，间隔15s。
[0018] 步骤（3)中，所述分离纯化方法的步骤如下：
[0019] a、蛋白变性：将沉淀用lOmmol/L的Tris-HCl溶液重悬沉淀，静置lOmin，离心，弃 上清；重复一次；用含有尿素的浓度为lOmmol/LTris-HCl溶液溶解沉淀,其中,尿素浓度为 8mol/L，在12000rpm的条件下离心IOmin,收集上清；
[0020] b、蛋白复性：将上清用尿素浓度为6mol/L、4mol/L和2mol/L的缓冲液依次透析， 前两个浓度分别透析3h，最后一个浓度透析12h，所述缓冲液中还含有1% (w/v)甘氨酸、 0.1% (w/w)SDS、5% (v/v)甘油、lOmmol/L Tris-HCl;再用含有 1% (w/v)甘氨酸的浓度为 IOmM Tris-HCl溶液透析2次,每次3h ;12000rpm离心IOmin,取上清，即可。
[0021] 本发明还提供了前述融合蛋白在制备治疗和/或预防嗜肺军团菌感染性疾病的 药物中的用途。优选地，所述嗜肺军团菌感染性疾病为军团病。
[0022] 本发明还提供了一种嗜肺军团菌疫苗，它包括致免疫有效量的权利要求1所述的 融合蛋白，以及药学上可接受的辅料或者载体。优选地，所述融合蛋白的免疫有效量以每人 一次使用量计不低于〇. 11 y g/g。
[0023] 所述辅料或载体为水或缓冲液。优选地，所述水为生理盐水或蒸馏水。
[0024] 本发明氨基酸序列如SEQ ID NO. 2所示的融合蛋白FlaA N/C，包括嗜肺军团 菌鞭毛蛋白的部分N端蛋白与部分C端蛋白，二者之间通过柔性肽段(氨基酸序列为 SPGISGGGGGILDSMG)连接。
[0025] 发明人在前期研究过程中，分别用嗜肺军团菌的鞭毛蛋白、鞭毛蛋白的N端蛋白、 鞭毛蛋白的C端蛋白进行嗜肺军团菌的感染保护试验，结果发现，它们具有一定的保护效 果，但效果不佳。发明人进一步将鞭毛蛋白N端和C端特定部分的蛋白通过柔性肽段(氨基 酸序列为SPGISGGGGGILDSMG)连接后，其保护作用大大增加。
[0026] 本发明从嗜肺军团菌鞭毛蛋白出发，用基因工程的方式制备得到了融合蛋白FlaA N/C，免疫保护作用优良，可有效预防嗜肺军团菌引起的感染性疾病，应用前景良好。
[0027] 显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离 本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。
[0028] 以下通过实施例形式的【具体实施方式】，对本发明的上述内容再作进一步的详细说 明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容 所实现的技术均属于本发明的范围。
【专利附图】
【附图说明】
[0029] 图1融合蛋白表达图谱
[0030] 图2FlaA N/C大量表达胶图谱
[0031] 图3FlaA N/C纯化蛋白电泳图谱
[0032] 图4FlaA N、FlaA C和FlaA N/C蛋白注射后IL-6水平图谱
[0033] 图5小鼠存活天数
[0034] 图6小鼠感染情况
[0035] 图 7 肺部组织 NF- K B、S0D2、C0X2 表达（Western-blot)
[0036] 图8注射FlaAN/C后不同剂量嗜肺军团菌感染A/J小鼠存活天数
【具体实施方式】
[0037] 实验材料：
[0038] 实施例1本发明融合蛋白的制备
[0039] 1)合成目的基因 FlaA N/C :
[0040] 序列（SEQ ID NO. 1所示序列）如下：
【权利要求】
1. 一种融合蛋白，其特征在于：它的氨基酸序列如SEQ ID NO. 2所示。
2. 编码权利要求1所述融合蛋白的核苷酸序列，其特征在于：其序列如SEQ ID NO. 1所 /_J、1 ο
3. -种重组载体，其特征在于：它包括SEQ ID NO. 1所示的核苷酸序列； 优选地，所述重组载体是pET30a重组载体。
4. 一种重组菌，其特征在于：它包括权利要求3所述的重组载体； 优选的，所述重组载体为重组大肠杆菌。
5. -种制备权利要求1所述融合蛋白的方法，其特征在于：它包括如下步骤： (1) 取权利要求4所述的重组菌，接种到大肠杆菌培养基中，34?40°C培养至 0D_=0. 6 ?0. 8 ; (2) 加入IPTG至终浓度为0. 4?0. 6mmol/L，在15?25°C的条件下，诱导培养8?16 小时； (3) 收集菌体，超声破菌，离心，取沉淀分离纯化，即得； 优选地，步骤（1)中，大肠杆菌培养基为LB液体培养基，培养温度为37°C ; 优选地，步骤（2)中，IPTG的终浓度为0. 5mmol/L，温度为21°C，培养时间为12h。
6. 根据权利要求5所述的方法，其特征在于： 步骤（3)中，所述超声破菌的步骤是：将菌体置于lOmmol/LTris-HCl溶液中，在功率 500W的条件下处理30次，每次10s，间隔15s ; 所述分离纯化方法的步骤如下： a、 蛋白变性：将沉淀用10mm〇l/L的Tris-HCl溶液重悬沉淀，静置10min，离心，弃上 清；重复一次；用含有尿素的浓度为10mm〇l/LTris-HCl溶液溶解沉淀，其中，尿素浓度为 8mol/L,在12000rpm的条件下离心lOmin,收集上清； b、 蛋白复性：将上清用尿素浓度为6m〇l/L、4m〇l/L和2mol/L的缓冲液依次透析，前两 个浓度分别透析3h，最后一个浓度透析12h，所述缓冲液中还含有1% (w/v)甘氨酸、0. 1% (w/w)SDS、5% (v/v)甘油、10mmol/L Tris-HCl ;再用含有 1% (w/v)甘氨酸的浓度为 10mM Tris-HCl溶液透析2次，每次3h ;12000rpm离心10min，取上清，即可。
7. 权利要求1所述融合蛋白在制备治疗和/或预防嗜肺军团菌感染性疾病的药物中的 用途； 优选地，所述嗜肺军团菌感染性疾病为军团病。
8. -种嗜肺军团菌疫苗，其特征在于：它包括致免疫有效量的权利要求1所述的融合 蛋白，以及药学上可接受的辅料或者载体。
9. 根据权利要求8所述的疫苗，其特征在于：所述融合蛋白的免疫有效量以每人一次 使用量计不低于〇. 11 μ g/g。
10. 根据权利要求8所述的疫苗，其特征在于：所述辅料或载体为水或缓冲液； 优选地，所述水为生理盐水或蒸馏水。
【文档编号】C12R1/19GK104277114SQ201410039880
【公开日】2015年1月14日 申请日期:2014年1月27日 优先权日:2013年7月9日
【发明者】许颖 申请人:许颖