一株烟碱高效降解菌及培养方法
【专利摘要】本发明属于微生物应用【技术领域】，公开了一株烟碱高效降解菌及其培养方法。菌株为噬组氨醇节杆菌EA-17（Arthrobacter?histidinolovorans），保藏号为CCTCC?NO：M2013405。在烟碱初始浓度为2g/L的培养基中，噬组氨醇节杆菌EA-17在12小时内对烟碱的降解率达到87.71%；对于烟碱初始浓度为4g/L时，菌株在24小时内对烟碱降解率达95.64%。本发明优化了噬组氨醇节杆菌EA-17的培养方法，在本发明公布的培养方法下培养10h～16h，噬组氨醇节杆菌EA-17的菌量可达9×108CFU/mL～109CFU/mL。
【专利说明】一株烟碱局效降解菌及培养方法
【技术领域】
[0001]本发明属于生物【技术领域】，具体涉及一株烟碱高效降解菌及培养方法。
【背景技术】
[0002]烟碱即尼古丁，是烟草中含量最多的一种生物碱，约占烟草生物碱的95%和烟草干重的0.5%-6%。烟碱对人体和环境都有一定的危害作用。烟碱是香烟中的一种主要有害物质，对人体的危害已得到大量揭示，会引起人体心率加快、血管收缩、血压升高等，长期吸烟会增大人患呼吸道疾病和心血管疾病的几率；我国每年因种植烟草产生烟草废弃物，大量烟草废弃物没有被及时处理而被堆放在田间，在堆放的过程中烟碱会从烟杆中释放溶入土壤中，造成土壤的污染；卷烟厂在生产的过程中，在清洗、蒸煮、制丝等过程中会产生大量废水，这些废水中含有一定浓度的烟碱，直接排放会对水体造成严重的污染。
[0003]降解烟碱的方法有很多，微生物降解烟碱被认为是高效、安全环保，而且低成本的方法。早在上个世纪就有微生物降解烟碱的科研报道，研究者陆续筛选出多种可降解烟碱的真菌、细菌等，主要包括节杆菌属(Arthrobacter)、假单胞菌属(Pseudomonas)、芽孢杆菌属(Bacillus)、纤维单胞菌属(Cellulomonas)、红球菌属(Rhodococcus)、土壤杆菌属(Agrobacterium)等。其中节杆菌属和假单胞菌属是降解烟碱优势菌种。
[0004]但目前筛选出的降解烟碱微生物存在降解效率较低或降解不够充分等问题。丁怀宇等(2012)从白肋烟和烤烟中筛选出几株烟碱降解菌，24h内对4g/L烟碱的最高降解率为50.25% ;彭宇等(2011)报道摩氏摩根氏菌F4 (Morganellamorganii F4)对烟草废弃物浸提液中烟碱的降解率可达84 ~96%，但需要5~IOd的降解周期。
【发明内容】
[0005]本发明的目的是提供一株具有高效降解烟碱能力的降解菌及其培养方法。
[0006]为实现上述目的，本发明所采用的技术方案为:
[0007]一株烟碱高效降解菌，所述降解菌分类命名为噬组氨醇节杆菌(Arthrobacterhistidinolovorans)EA-17，已于2013年9月10日保存于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为 CCTCC N0:M2013405o
[0008]上述烟碱高效降解菌的培养方法，培养基的各组分为:K2HP04lg/L~14g/L，KH2PO41 g/L ~5g/L,烟碱 0.lg/L ~5g/L,葡萄糖 5g/L ~20g/L,蛋白胨 5g/L ~15g/L,玉米衆干粉 lg/L ~10g/L,硫酸铵 lg/L ~15g/L, MgSO40.lg/L ~0.3g/L, FeSO40.lg/L ~0.3g/L ;培养条件为:30°C~37°C，pH6~8，种龄18~24h，接种量0.1~10%。
[0009]本发明的有益效果:
[0010](I)采用本发明所述培养方法对噬组氨醇节杆菌(Arthrobacterhistidinolovorans)EA-17进行培养，培养10~16h后，菌体生物量可以达至Ij 9X108CFU/mL ~109CFU/mL。
[0011](2)本发明所述卩遼组氨醇节杆菌(Arthrobacter histidinolovorans) EA-17具有高效降解烟碱的能力，对于烟碱初始添加浓度为2g/L，所述菌株12h对烟碱的降解率达到87.71% ;对于烟碱初始添加浓度为4g/L，所述菌株24h对烟碱的降解率达95.64%。
【专利附图】
【附图说明】
[0012]图1为本发明所述卩遼组氨醇节杆菌(Arthrobacter histidinolovorans)EA_17在LB培养基上的生长形态。
[0013]图2为本发明所述卩遼组氨醇节杆菌(Arthrobacter histidinolovorans)EA-17的革兰氏染色镜检结果。
[0014]图3为本发明所述卩遼组氨醇节杆菌(Arthrobacter histidinolovorans)EA_17基于16S rDNA基因序列的菌株系统进化树。
[0015]图4为本发明所述卩遼组氨醇节杆菌(Arthrobacter hi stidino lovorans )EA-17降解烟碱的特性图。
【具体实施方式】
[0016]为了更好地理解本发明，下面结合实施例、附图和附表进一步阐明本发明的内容，但本发明的内容不仅仅局限于下面的实施例。
[0017]一株烟碱高效降解菌，该菌株分类命名为噬组氨醇节杆菌(Arthrobacterhistidinolovorans) EA-17,已于2013年9月10日保存于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC N0:M2013405o
[0018]实施例1
[0019]1、烟碱降解菌的筛选
[0020]1.1培养基
[0021]富集培养基=K2HPO4.3H2013.3g，KH2P044g, MgSO4.7H200.2g，0.5mL 微量元素溶液，加水至1L。培养基灭菌后，烟碱用0.22 μ m滤膜过滤除菌后按1.5g/L的含量加入。
[0022]分离培养基:富集培养基中添加1.5wt%含量的琼脂粉。
[0023]微量元素溶液:0.05g CaCl2.2H20,0.05g CuCl2.2H20,0.008g MnSO4.H20,0.004gFeSO4.7H20，0.1 g ZnSO4,0.1g Na2MoO4.2H20 用少量 0.lmol/L HCl 溶解，再加水至 IL0
[0024]LB培养基:蛋白胨10g，酵母粉5g，NaCl 10g，加水至1L，调节ρΗ7.2~7.4。
[0025]1.2烟碱降解菌的初筛
[0026]初筛菌株从三条途径得到，它们的具体操作是:
[0027](I)烟草区土样:在常年种植烟草的区域取Ig 土样加入富集培养基中，30°C，180r/min培养三天，转接ImL培养物到另一富集培养基中，30°C，180r/min再培养三天，稀释涂布发酵液到分离培养基中。30°C，培养4-6天，将生长出的单菌落纯化到分离培养基上，30°C，培养4-6天，保藏。
[0028](2)烟杆:将0.5g烟杆加入30mL生理盐水中，30°C，180r/min，震荡30min，取ImL
震荡液加入富集培养基中，30°C，180r/min培养三天，稀释涂布发酵液到分离培养基中，300C，培养4-6天，将生长出的单菌落纯化到分离培养基上，300C，培养4-6天，保藏。
[0029](3)实验室已保藏菌株:LB活化实验室已保藏菌株，挑单菌落到分离培养基上，300C，培养4-6天，得到可以利用烟碱生长的菌株，保藏。[0030]通过以上方法，共得到81株可以降解烟碱的菌株，其中从土样、烟杆、实验室已保
藏菌株中分别筛选到26株、10株和45株。
[0031]1.3烟碱降解菌的复筛
[0032]将初筛到的81株菌株接种到含1.5g/L初始烟碱浓度的培养基中发酵培养10h，
通过检测，烟碱降解率达到50%以上的菌株有6株，其中一株从土样富集筛选获得的菌株
EA-17降解烟碱效率最高，其降解率为72.3%，发酵液呈蓝紫色。实验室保藏菌株、土样、烟
杆中筛选到的降烟碱菌株的降解率分别如表1、表2、表3所示。
[0033]表1实验室已保藏菌株烟碱降解率
【权利要求】
1.一株烟碱高效降解菌，其特征在于，所述菌株分类命名为噬组氨醇节杆菌(Arthrobacter histidinolovorans)EA_17,已于2013年9月10日保存于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO:M2013405。
2.权利要求1所述烟碱高效降解菌的培养方法，其特征在于，培养基的各组分为:K2HPO41g/L ~14g/L, KH2PO41g/L ~5g/L,烟碱 0.lg/L ~5g/L,葡萄糖 5g/L ~20g/L,蛋白胨 5g/L ~15g/L,玉米衆干粉 lg/L ~10g/L,硫酸铵 lg/L ~15g/L, MgSO40.lg/L ~0.3g/L,FeSO40.lg/L~0.3g/L ;培养条件为:30°C~37。。，pH6~8，种龄18~24h，接种量0.1~.10%。
【文档编号】C12N1/20GK103789238SQ201410039634
【公开日】2014年5月14日 申请日期:2014年1月27日 优先权日:2014年1月27日
【发明者】陈守文, 王昌军, 余君, 冀志霞, 伍良伟, 杨亮, 徐迪红, 李进平, 祖秉桥, 杨树 申请人:华中农业大学, 湖北省烟草科学研究院