一株高效阿特拉津降解菌及其筛选方法以及在农田废水中阿特拉津的生物降解的应用
【技术领域】
[0001]本发明属于环境微生物技术领域，涉及菌株Pseudomonas sp.ZXY-1及其在农田废水中阿特拉津的生物降解，可用于农药污染的原位修复。
【背景技术】
[0002]近些年，中国的农业得到了持续快速的发展。随之，农药的使用量逐年增加。在农业生产中，除草剂是一类重要的农药。在不同的除草剂中，阿特拉津因其除草性能好、使用成本低廉等优点得到了广泛的使用。然而，由于缺乏有效的处理技术，绝大部分阿特拉津在使用过后，会随着降雨径流及农田退水等途径直接进入自然水体，从而造成严重的水体污染。因此，为了保证水资源的可持续发展，我们需要开发出可高效降解阿特拉津的处理技术。
[0003]处理阿特拉津的主要技术为生物降解法。其中，利用微生物降解阿特拉津因成本低、无二次污染等优点具有广泛的发展前景。在微生物降解法的发展中，不仅要筛选出能够以阿特拉津为单一底物的细菌，更重要的是所筛选的细菌可直接用于处理含有阿特拉津的实际废水。因此，筛选出高效的阿特拉津降解菌并将其应用于实际废水中，将其转化为无毒无害或低毒低害的物质有着重要的意义。
【发明内容】
[0004]本发明目的在于在从自然界筛选出高效高产量的阿特拉津降解菌，并将其应用于含有阿特拉津的农田废水中，为实际农田废水中阿特拉津的去除奠定理论基础。
[0005]本发明中一株高效的阿特拉津降解菌，其特征在于为Pseudomonas sp.ZXY-1,2015年6月I日保藏于“中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心”，保藏编号为CGMCC N0.10936，北京市朝阳区北辰西路I号院3号。
[0006]该菌株为革兰氏阴性菌，单个细菌呈杆状，无芽孢，菌体长为2.27 μm,宽为799.76nm ;菌株在无机盐固定培养基上生长，菌落呈乳白色略带淡黄色，圆形，不透明，表面光滑略微隆起。该菌株最适生长温度为25-35°C，最适pH为7.0,最适生长摇床转速为150r/min0
[0007]本发明中一株高效的阿特拉津降解菌Pseudomonas sp.ZXY-1是从吉林化工有限公司农药厂受污染土壤中分离得到，设定温度为30°C，pH7.0筛选，具体筛选步骤如下:
(I)取1g农药厂受污染土壤样品加入10ml含有100mg/L阿特拉津的无机盐培养基三角瓶中，设定转速为150r/min，摇床培养7天，获得富集菌液。
[0008](2)取1ml富集菌液加入10ml含有100mg/L阿特拉津的无机盐培养基三角瓶中，重复此步骤3次。将富集后的菌液进行平板涂布，恒温培养箱培养3天后获得单菌落。
[0009](3)挑取步骤(2)中的单菌落进行平板三区划线，重复此步骤3次直至平板上出现形态大小相同的单菌落，即细菌纯化完成。
[0010](4)将纯菌接入斜面培养基培养3天，4°C保存。
[0011]其中，无机盐培养基为:0.9g KH2PO4,6.5g Na2HPO4.12H20，3g 蔗糖，0.2gMgSO4.7H20，0.0lg FeSO4.7H20，以及Iml微量元素液溶于100ml蒸馏水中。无机盐固体培养基是在无机盐的成分中另加入琼脂18g/L。
[0012]斜面培养基为:0.9g KH2PO4,6.5g Na2HPO4.12H20，3g 蔗糖，Ig 蛋白胨，0.5g 酵母粉，Ig NaCL0.2g MgSO4.7H20,0.01g FeSO4.7H20，Iml 微量元素液以及 18g 琼脂溶于 1000ml
蒸馏水中。
[0013]微量元素液为:0.1g CoCl2.6Η20，0.425g MnCl2.4H20，0.05g ZnCl2,0.0lgNiCl2.6Η20，0.015g CuSO4.5Η20，0.0lg Na2MoO4.2Η20，0.0lg Na2SeO4.2Η20 溶于 1000ml 蒸馏水中。
[0014]本发明中一株高效阿特拉津降解菌为假单胞菌属(Pseudomonas sp.)，经过16S rDNA序列测序，其结果通过Blast程序进行同源性比较，该菌株与Pseudomonasalcaliphila 的同源性达 99%。
[0015]本发明中一株高效阿特拉津降解菌应用于含有不同浓度阿特拉津农田废水的生物处理。
[0016]
本发明有益效果:本发明提供的菌株具有高效降解阿特拉津的能力，对初始浓度为100mg/L的阿特拉津无机盐培养基，10.5h内该细菌降解能力可达99.9%。
【附图说明】
[0017]图1为菌株Pseudomonassp.ZXY-1原子力显微镜图。
[0018]图2为菌株Pseudomonassp.ZXY-1生长曲线图。
[0019]图3为菌株Pseudomonassp.ZXY-1降解阿特拉津曲线图。
[0020]图4为菌株Pseudomonassp.ZXY-1在不同温度下阿特拉津降解图。
[0021]图5为菌株Pseudomonassp.ZXY-1在不同pH值条件下阿特拉津降解图。
[0022]图6为菌株Pseudomonassp.ZXY-1在不同摇床转速条件下阿特拉津降解图。
[0023]图7为菌株Pseudomonassp.ZXY-1在不同初始阿特拉津浓度条件下降解图。
【具体实施方式】
[0024]实施例1:本发明菌株Pseudomonas sp.ZXY-1筛选方法按照以下步骤实现:设定温度为30°C，pH7.0筛选。
[0025](I)取1g农药厂受污染土壤样品加入10ml含有100mg/L阿特拉津的无机盐培养基三角瓶中，设定转速为150r/min，摇床培养7天，获得富集菌液。
[0026](2)取1ml富集菌液加入10ml含有100mg/L阿特拉津的无机盐培养基三角瓶中，重复此步骤3次。将富集后的菌液进行平板涂布，恒温培养箱培养3天后获得单菌落。
[0027](3)挑取步骤(2)中的单菌落进行平板三区划线，重复此步骤3次直至平板上出现形态大小相同的单菌落，即细菌纯化完成。
[0028](4)将纯菌接入斜面培养基培养3天，4°C保存。
[0029]其中，无机盐培养基为:0.9g KH2PO4,6.5g Na2HPO4.12H20，3g 蔗糖，0.2gMgSO4.7H20，0.0lg FeSO4.7H20，以及Iml微量元素液溶于1000ml蒸馏水中。无机盐固体培养基是在无机盐的成分中另加入琼脂18g/L。
[0030]斜面培养基为:0.9g KH2PO4,6.5g Na2HPO4.12H20，3g 蔗糖，Ig 蛋白胨，0.5g 酵母粉，Ig NaCL0.2g MgSO4.7H20,0.01g FeSO4.7H20，Iml 微量元素液以及 18g 琼脂溶于 1000ml
蒸馏水中。
[0031]微量元素液为:0.1g CoCl2.6Η20，0.425g MnCl2.4H20，0.05g ZnCl2,0.0lgNiCl2.6Η20，0.015g CuSO4.5Η20，0.0lg Na2MoO4.2Η20，0.0lg Na2SeO4.2Η20 溶于 1000ml 蒸馏水中。
[0032]该培养基高压蒸汽灭菌条件为121°C，15min。
[0033]本实施方式筛选所得细菌原子力显微镜图见图1，单个细胞呈杆状，菌体长为
2.27 μ m，宽为 799.76nm。
[0034]本实施方式筛选所得细菌形态学特征为:该菌株为革兰氏阴性菌，单个细菌呈杆状，无芽孢，菌株在无机盐固定培养基上生长，菌落呈乳白色略带淡黄色，圆形，不透明，表面光滑略微隆起。
[0035]分子生物学鉴定:将菌体于50 μ L TaKaRa Lysis Buffer for Microorganismto Direct PCR中变性后离心取上清作为模板，使用TaKaRa 16S rDNA BacterialIdentificat1n PCR Kit进行PCR扩增目的片段。反应条件为:94°C预变性5min，再经30个循环的94°C变性Imin，55°C退火Imin，72°C延伸1.5min，而后再经过72°C延伸5min。使用 TaKaRaMiniBEST Agarose Gel DNA Extract1n Kit 切胶回收目的片段进行 DNA 测序。将本菌株的16S rDNA基因核苷酸序列进行BLAST比对，比对结果显示，本菌株Pseudomonassp.ZXY-1与Pseudomonasalcaliphila亲缘关系最近，达99%。其序列如下:
ACGC