一株中等嗜热地衣芽孢杆菌及其在高温含油污水处理中的应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于高溫采油污水处理领域的微生物新技术，设及一株产耐高溫脂肪酶中 等嗜热地衣芽抱杆菌及其在高溫含油污水处理中的应用。
【背景技术】
[0002] 石油是我国最重要的能源之一，2014年我国石油产量高达2.1亿吨，在生产、生活 中都发挥着十分重要的作用。然而石油开采过程中产生大量含石油控的高溫（约50°C)污 水，如不能得到有效处理，将会对环境和人类健康造成巨大危害。
[0003] 微生物法具有处理成本低、操作简便、石油类污染物降解效果好、不易引起二次污 染等特点而在采油污水处理领域得到广泛应用。浙江海洋学院选取油污处理厂长期受油污 污染的±壤进行富集化培养，筛选得到对柴油石油控具有分解作用的石油降解菌；中国海 洋大学开展高效石油降解菌的筛选及其在油田废水深度处理中的应用，从石油污染的±壤 和水体中富集、分离到12株高效石油降解菌，各单菌株的降油率为40.3%~57.6%，其中Ξ 种菌可耐受40°C的溫度。沈阳大学从迂河油田和大庆油田污染±壤中分离出两株高效石油 降解菌，分别为枯草芽抱杆菌（Bacillus subtilis)和地衣芽抱杆菌（Bacillus licheniformis)。除油率分别为39%和48%。生长溫度分别为25~35°C和28~40°C。但传统 方法中用到的微生物多为嗜中溫微生物，因此在处理高溫采油污水时需要采用冷却塔先降 溫，然后再采用微生物处理。该方法存在能耗大、产生挥发性气体污染的问题。
[0004] 近年来，嗜热细菌引起了越来越多科学家的重视和兴趣。国内北京大学郝瑞霞教 授早在2003年就开始降解石油控嗜热细菌筛选。南开大学分子微生物学与技术教育部重点 实验室也长期从事石油控降解菌包括嗜热细菌的筛选及应用研究。南京农业大学沈标教授 长期从事烧控代谢和嗜热细菌的相关研究，分离获得MH-1等具有石油控降解能力的嗜热细 菌，并对其alkB基因的相关特性进行了研究，运些前期研究为嗜热细菌的驱油和污水处理 应用奠定了良好基础。
[0005] 中国石油大学公开了嗜热菌在处理稠油污水方法中的应用，（a)将嗜热菌剂负载 于填料上；（b)将稠油污水W及负载于所述填料上的嗜热菌剂共同置于反应单元中。查阅大 量文献和专利书，发现未见耐热地衣芽抱杆菌在高溫(45~60°C)含油废水处理中的应用。
【发明内容】
[0006] (1)本发明提供一株能应用于处理采油污水和石油污染的中等嗜热微生物菌株地 衣芽抱杆菌(Bacillus licheniformis) 〇
[0007] (2)本发明将所述的微生物菌株可高效处理高溫采油污水和石油污染，并具有产 生耐高溫脂肪酶的能力。
[000引本发明上述目的通过W下技术方案来实现：
[0009]本发明提供了一株中等嗜热地衣芽抱杆菌，该菌是从中国石油化工集团公司华东 分公司泰州采油厂石油污染的±壤中W原油为唯一碳源的情况下55°C反复驯化获得，命名 为 H43。
[0010] H43的细胞形态特征如下：在LB上培养2地的菌落直径为4-5mm，菌落形态呈圆形， 边缘整齐，表面湿润光滑，浅黄色；油镜下菌体呈短杆状;生长溫度在40-60°C，最适生长溫 度50°C dpH为6~9，盐度0~4%。菌体大小为(0.7~0.9皿）X (2.0~3.0皿），单个或短链排 列，端生鞭毛，中生芽抱，革兰氏阳性菌。
[0011] 表1:地衣芽抱杆菌的生化特性
[0012]
[0013] 注：V'表示反应阳性表示反应阴性
[0014] 参照《Bergey's Mannual of Syetematic Bacteriology》的内容，根据形态特征、 生理生化特征和16sDNA分子鉴定，H43为地衣芽抱杆菌属(Bacillus licheniformis)。
[001引本发明H43菌株对55°C含1 %原油的污水处理7d后石油控的降解率达到46% ;对泰 州油田^相分离器出水口取得的高溫含油污水（156mg/L石油控含量）处理效率高达 89.9%，同时产生脂肪酶。W上试验表明地衣芽抱杆菌属(Bacillus lichenifo;rmis)H43在 运用于高溫含油废水的处理上效果明显，且在处理污水的同时产多种具有重要应用价值的 生物工程产品。
【附图说明】
[0016] 图1为本发明地衣芽抱杆菌(Bacillus licheniformis化43的原子力显微镜图片 化43菌株原子力显微镜视图）；
[0017] 图2为本发明地衣芽抱杆菌的16s rDNA鉴定序列化43菌株经宝生物工程(大连)有 限公司测序获得16s rDNA基因序列）；
[001引图3为本发明地衣芽抱杆菌经NCBI BLAST之后得到的序列进化树化43菌株经NCBI BLAST之后的系统进化树）；
[0019] 图4为本发明地衣芽抱杆菌(Bacillus licheniformis化43的抑、溫度、盐度的生 长曲线化43菌株在不同溫度、pH和盐浓度的生长变化）；
[0020] 图5为本发明地衣芽抱杆菌(Bacillus licheniformis化43作用前后原油气相色 谱图，a为作用前，b为作用后化43菌株作用前后原油气相色谱图）；
[0021 ] 图6为本发明地衣芽抱杆菌(Bacillus licheniformis化43作用前后原油中正烧 控碳数的分布情况化43菌株作用前后正构烧控组分含）；
[0022] 图7为本发明地衣芽抱杆菌(Bacillus licheniformis化43对各正构烧控的降解 率化43菌株作用后不同正构烧控的降解率）；
[0023] 图8为本发明地衣芽抱杆菌(Bacillus licheniformis化43作用前后原油表面粘 度与剪切速率的变化情况化43菌株作用前后，原油粘度随剪切速率的变化）；
【具体实施方式】
[0024] 实施例1:地衣芽抱杆菌(Bacillus lichenifo;rmis)H43菌株的筛选；
[0025] 1.取样:采用无菌容器从台南油田联合处理站采集原油(Ξ相分离器出口管道，先 流Imin后再取样)和±壤(去除表层覆±0.5cm后取样），随后放置在4°C保存备用。
[0026] 2.富集:分别取油污±壤样品，按5%比例接入装有lOOmL培养基（ImL微量元素溶 液加 lOmL矿物盐溶液，加无菌水至lOOmL)的250mLS角锥形瓶中，摇床培养7d(55°C， 16化pm)。取富集液5mL转接至相同新鲜培养基内，与相同条件下培养7d，如此连续富集培养 7次。
[0027] 3.分离:配置LB固体培养基，经高压灭菌（12rC，20min)，取出放置超净台冷却到 45°C~50°C时倒入灭菌后的90mm培养皿内（15mL)，待培养基冷却凝固后将培养基倒置搁 放，24h后检查无菌污染方可使用。用接种环在LB固体培养基上划线，55Γ培养(培养皿用封 口膜密封，倒置培养）。24h后，选取不同的形态的菌，挑取单克隆于装有1 OmL的LB液体培养 基中培养，摇床培养(55°C，160巧m)。
[0028] 4.所用培养基成分 ①无机盐培养基： （g/L)
[0029] KH2PO4 0.5 g
[0031] W上培养基经高压灭菌（12rc，20min)后置4Γ保存备用。
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