0032] 实施例2:地衣芽抱杆菌(Bacillus licheniformis)H43的形态和生理生化特征
[0033] 1.试验方法
[0034] 参照《Bergey's Mannual of Syetematic Bacteriology》的实验方法进行，检测 其革兰氏染色，菌体大小和形态、生长溫度、生长pH范围、化Cl耐受性、淀粉水解、脂肪酶活 性、V-P、甲基红、葡萄糖产酸实验。
[0035] 2.试验结果
[0036] 结果表明：该菌革兰氏染色呈阳性，显微镜下呈排列呈杆状，兼性好氧，生长溫度 40-60°C，生长抑范围为6-9，化Cl耐受性为ο %-4%，V-P为阳性、甲基红实验为阴性，可W利 用葡萄糖产酸、水解淀粉、利用橄揽油乳化生产脂肪酶等。
[0037] 实施例3:地衣芽抱杆菌(Bacillus lichenifo;rmis)H43菌株的16sDNA鉴定：
[0038] 1.供试菌株:本发明地衣芽抱杆菌(Bacillus lichenifo;rmis)H43
[0039] 2.试验方法：
[0040] ①获得活性良好的细菌:先将H43的菌株复苏，取lOOuL冻存液注入lOmLLB液体培 养基，55°C，leOrpm摇床培养12-24h。将摇出来的菌液划线培养，55°C恒溫箱培养2地，挑取 平板上的单克隆，接种到LB液体培养基的试管里摇床55°C，160巧m培养12-2地。
[0041 ] ②细菌DNA提取法(Takara试剂盒）
[0042] ③细菌16S rDNA扩增
[0043] 所用引物：Seq forward 5'-GAGCGGATAACAATTTCACACAGG-3'
[0044] Seq reverse 5'-CGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGAC-3'
[0045] 鉴定结果于说明书附图2
[0046] 实施例4:地衣芽抱杆菌(Bacillus lichenifo;rmis)H43菌株对原油的降解试验
[0047] 1.供试菌株:本发明地衣芽抱杆菌(Bacillus lichenifo;rmis)H43 [004引 2.试验方法：
[0049] 将供试菌株在LB平板上活化，挑取单菌落接入50mL LB液体培养基中55Γ培养至 对数生长期。实验组W1%的接种量接种培养好的菌液至装有lOOmLW原油(0.5g)为碳源的 无机盐降解基础培养基(成分与实施例1相同），未接菌的含油培养基为对照组，实验组、对 照组各Ξ瓶。55°C(160rpm)培养7d，取出后用四氯化碳萃取，使用紫外分光光度计测0D282， 原油降解率=(对照组0D28广实验组0D282)/对照组0D282 X 100%。
[0050] 3.结果分析:在55°C培养7天，H43对原油的降解率为46 %，说明地衣芽抱杆菌可高 效降解原油。
[0化1] 实施例5:地衣芽抱杆菌(Bacillus licheniformis)H43的GC-MS试验 [0052] 1.供试菌株:本发明地衣芽抱杆菌(Bacillus lichenifo;rmis)H43菌株
[0053] 2.所用培养基:无机盐培养基，微量元素培养基，LB培养液，原油0.5g
[0054] 3.试验方法（1)将分离到的石油控降解菌株接种于LB培养基中，55°C培养12h，至 对数生长期，按1%接种量加入lOOmLW原油为唯一碳源的无机盐液体培养基中，做3个重 复，同时做Ξ个不接菌对照。未加菌液的作为空白对照组。
[0055] (2)置于55°C恒溫摇床上16化/min培养7、14和21d。培养结束后，整瓶提取残留石 油控，测定石油控含量，并用GC/MS检测石油控成分变化规律。
[0056] 4.试验结果:如下表
[0057] 表2:H43菌株对不同长度石油控的降解效率
[0化引
[0059] 结果分析：地衣芽抱杆菌可降解C14-C27之间的正构烧控，且降解率在43%到 66%。
[0060] 实施例6:地衣芽抱杆菌(Bacillus licheniformis)H43菌株改变原油粘度的试验
[0061 ] 1.供试菌株:本发明地衣芽抱杆菌(Bacillus lichenifo;rmis)H43菌株
[0062] 2.试验方法:将供试菌株在LB平板上活化，挑取单菌落接入50ml LB液体培养基中 55°C过夜培养至对数生长期。W10%接种量接种培养好的菌液至100ml W原油(2%)为碳源 的无机盐降解基础培养(成分与实施例1相同）的Ξ角瓶中。55°C摇床培养（150rpm)培养7 天，将石油原油与发酵液和菌分离并脱水，利用马尔文Kinexus Pro测定原油粘度和剪切速 率随时间的变化。
[0063] 3.试验结果：
[0064] 加入试验菌株地衣芽抱杆菌(Bacillus licheniformis化43之后，降低了原油粘 度，增加了原油的流动性。另外，原油粘度随着剪切速率的增大而减小，且当剪切速率增大 到某个值之后，原油粘度基本保持不变。
【主权项】
1. 本发明从石油烃污染土壤中分离获得一株耐热地衣芽孢杆菌（Bacillus licheniformis)可以高效降解石油烃。本发明还公布了地衣芽孢杆菌菌株处理高温含油污 水的方法。2. 权利要求1利用地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)处理污水的温度范围为45 ~60°C 〇3. 权利要求1利用地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)产耐高温脂肪酶。4. 权利要求1利用地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis) 12h处理高温含油废水的 新技术，其石油烃去除率达89.8%。5. 权利要求1所述地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)的处理高温含油污水的营 养剂包括无机盐、微量元素和LB培养基的复合培养基。6. 权利要求1所述的地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)具有降低石油粘度，改 变原油流动性的能力。
【专利摘要】本发明公开了一株中等嗜热地衣芽孢杆菌及其在处理高温含油污水中的应用。本发明从中石化华东分公司泰州采油厂石油污染土壤中分离获得一株地衣芽孢杆菌属菌株，菌落直径为4-5mm，菌落形态呈圆形，边缘整齐，表面湿润光滑，浅黄色；油镜下菌体呈短杆状，革兰氏阳性菌，中生芽孢，无运动性；生长温度在40-60℃，最适生长温度50℃，V-P试验、番红染色均为阳性，产耐高温脂肪酶，发酵液可水解淀粉，产酸，16sDNA鉴定为地衣芽孢杆菌(Bacillus？licheniformis)。本发明还公布了地衣芽孢杆菌菌株(Bacillus？licheniformis)处理高温含油污水的应用。实验结果表明，本发明地衣芽孢杆菌菌株能高效降解石油烃类，应用于高温(45-60℃)含油污水的处理可降低能源浪费，同时可减少冷却过程中的芳香烃挥发带来的环境污染。
【IPC分类】C12N1/20, C12R1/10, C12N9/20, C02F3/34
【公开号】CN105670956
【申请号】
【发明人】罗明志, 闫筱, 王悦, 邓林红, 陈皓, 程旺林, 姚红生
【申请人】常州大学
【公开日】2016年6月15日
【申请日】2015年10月29日