一种纤维素降解菌群的宏基因组的提取方法

一种纤维素降解菌群的宏基因组的提取方法
【专利摘要】本发明公开了一种纤维素降解菌群的宏基因组的提取方法。本发明提供了一种纤维素降解菌群宏基因组DNA的提取方法，包括如下步骤：对纤维素分解菌群依次进行菌体破壁、有机溶液抽提DNA、异戊醇沉淀DNA和溶解DNA，得到宏基因组DNA；本发明的实验证明，本发明通过在提取前采用高盐溶液进行洗脱，并通过加入溶菌酶和机械匀浆强化细胞破壁，并通过蛋白酶K破壁，不仅使微生物细胞壁更易破碎，DNA分子更易释放，同时有效保证了过程的可重复性，进而保证了提取的宏基因组DNA片段完整性、纯度和菌群结构完整性。本发明为天然纤维素利用菌群的研究和应用,以及微生物分子生态学研究提供了有效的技术支撑。
【专利说明】
一种纤维素降解菌群的宏基因组的提取方法
技术领域
[0001] 本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种纤维素降解菌群的宏基因组的提取方 法。
【背景技术】
[0002] 木质纤维素是自然界中产量最大的多糖物质，广泛存在于森林、草原和农田中。其 产量丰富，价格低廉，而且多以农业和工业废弃物形式存在，是理想的生物能源类物质的生 产原料。研究表明，以木质纤维素为原料的生物能源生产工艺不仅能够实现农业废弃物的 再利用，而且可有效避免能源生产与粮食资源间的矛盾，成为最具潜力的生物能源工业化 生产途径。
[0003] 然而，由于木质纤维素组成复杂、结构致密，其水解为可利用糖的过程需要多种酶 系的协同作用，导致利用成本居高不下。自然界中纤维素降解细菌菌群由多种细菌长期共 生而成，能够快速高效地降解积累的大量木质纤维素。其中，木质纤维素降解菌能提供极为 丰富的纤维素酶系和半纤维素酶系，而非纤维素降解菌株能提供的辅助因子，帮助纤维素 快速降解。近年来的研究显示，利用菌群发酵纤维素有望实现一步法纤维素生物燃料的生 产，进而较大程度的降低生产成本。因此，揭示天然菌群转化木质纤维素的作用机理，成为 本领域研究的重要内容。
[0004] 目前，已经建立了多种研究菌群作用机理的方法。其中，宏基因组测序是相对成熟 的手段之一，已成功应用在多种菌群样品的结构分析之中，包括土壤、水体等环境样品和肠 道菌群、瘤胃、沼气种泥等功能样品。但是，由于纤维素菌群的自身特点，增加了其基因组 DNA的提取难度，因此，尚未建立完善的纤维素菌群的宏基因分析技术。
[0005] 影响天然纤维素菌群宏基因组提取效果的因素主要包括如下三点：第一，纤维素 菌群中的菌株多通过纤维小体结构与纤维素微丝紧密结合，以"纤维素_酶-菌体"的交联形 式存在于发酵液中，这种交联会显著影响菌体的破壁和基因组提取，导致获得的DNA无法真 实反映菌群组成，影响菌群结构分析的准确性;第二，菌群发酵纤维素过程中会在细胞外积 累大量的代谢产物，包括有机酸、有机醇和表面活性剂在内的多种物质，这些物质会对基因 组提取试剂产生一定的干扰，影响DNA的提取效果;第三，菌群既包含革兰氏阴性菌又包含 革兰氏阳性菌，还存在着大量的孢子，增加了DNA提取的难度。

【发明内容】

[0006] 本发明目的是提供一种纤维素降解菌群宏基因组DNA的提取方法。
[0007] 本发明提供的方法，包括如下步骤:对纤维素分解菌群依次进行菌体破壁、有机溶 液抽提DNA、异戊醇沉淀DNA和溶解DNA，得到宏基因组DNA;
[0008] 所述菌体破壁包括如下步骤：
[0009] (1)将纤维素分解菌群的菌体用高盐溶液进行高盐洗涤，收集高盐洗涤后菌体；
[0010] (2)将所述高盐洗涤后菌体用溶菌酶裂解，得到溶菌酶裂解后产物；
[0011] (3)将所述溶菌酶裂解后产物用蛋白酶K酶解，得到蛋白酶K酶解后产物；
[0012] (4)匀浆所述蛋白酶K酶解后产物，收集匀浆产物的上清液。
[0013] 上述方法中，步骤(1)中，所述高盐洗涤为将所述纤维素分解菌群的菌体与所述高 盐溶液混匀，离心收集沉淀，得到洗涤后菌体；
[0014] 步骤(2)中，所述裂解为将所述洗涤后菌体和溶菌酶溶液混匀后加热反应，得到溶 菌酶裂解后产物；
[0015] 步骤(3)中，所述酶解为将所述溶菌酶裂解后产物和蛋白酶K溶液混匀后再次加热 反应，得到蛋白酶K酶解后产物；
[0016] 步骤(4)中，所述匀浆为将所述蛋白酶K酶解后产物、玻璃珠和交联聚乙烯吡咯烷 酮溶液混合，得到混合产物，用匀浆器匀浆所述混合产物，得到匀浆产物;离心收集所述匀 浆产物，得到匀浆产物的上清。
[0017] 上述方法中，所述高盐洗涤次数大于等于2。
[0018] 上述方法中，步骤（1)中，所述纤维素分解菌群的菌体与所述高盐溶液等体积混 匀；
[0019] 步骤(2)中，所述洗涤后菌体和所述溶菌酶溶液中酶的配比为1 g: 7，000，000U;
[0020] 步骤(3)中，所述溶菌酶裂解后产物和所述蛋白酶K溶液中酶的配比为1 g: 3，900U;
[0021]步骤(4)中，所述蛋白酶K酶解后产物、玻璃珠和交联聚乙烯吡咯烷酮溶液的配比 为lg:0.5g:lmL〇
[0022] 蛋白酶K酶活为39U/mg，Sigma公司，产品号为P6556(粉剂）。
[0023] 溶菌酶酶活为70，000U/mg，Sigma公司，产品号为62971 (粉剂）。
[0024] 上述方法中，所述加热反应的条件为30-40°C反应15-60min;
[0025] 所述再次加热处理为30-65 °C反应15-60min;
[0026] 所述匀浆的条件为4-6m/s线速度匀浆2次，每次20-40s。
[0027] 上述方法中，所述高盐溶液为浓度大于等于75.5g/l的KC1水溶液；
[0028] 所述高盐洗涤后菌体和所述溶菌酶溶液的加料比为lg: 1ml;
[0029] 所述溶菌酶裂解后产物和所述蛋白酶K溶液的加料体积比为1:1;
[0030] 所述溶菌酶溶液由 5-15g/L 的 Na2HP〇4，l-5g/L 的 KH2P〇4,5-10g/L 的 NaCl，50-200g/ L的溶菌酶和水组成；
[0031]所述蛋白酶 K 溶液由 5-15g/L 的 Na2HP〇4，l_5g/L 的 KH2P〇4,5-10g/L 的 NaCl，50-200g/L的蛋白酶K和水组成。
[0032] 所述玻璃珠为直径0.1mm玻璃珠、直径0.5mm玻璃珠和1.0mm玻璃珠按照等体积混 匀得到的玻璃珠；
[0033]所述交联聚乙烯吡咯烷酮溶液由质量比体积为5-15 %的PVPP、质量比体积为1 -5% 的SDS、10-100mMTris、10-100mM EDTA、10-200mMNaCl和水组成。
[0034]上述方法中，所述有机溶液抽提DNA为将所述匀浆产物的上清液与酚-氯仿-异戊 醇溶液混匀，得到混合液，离心收集所述混合液的水相；
[0035]所述异戊醇沉淀DNA为将所述水相与体积百分含量为50 %-70 %异戊醇水溶液混 匀，静置，离心收集沉淀，得到异戊醇沉淀后DNA;
[0036]所述乙醇洗涤DNA为将所述异戊醇沉淀后DNA与体积百分含量为70%乙醇水溶液 混匀，离心收集沉淀，得到洗涤后DNA;
[0037] 所述溶解DNA为用溶解液溶解所述洗涤后DNA，得到宏基因组DNA。
[0038]上述方法中，所述匀浆产物的上清液和所述酚-氯仿-异戊醇溶液的体积比为1:1; [0039]所述水相和所述体积百分含量为50%_70%异戊醇水溶液的体积比为1:1;
[0040]所述异戊醇沉淀后DNA与所述体积百分含量为70%乙醇水溶液的体积倍为1:3-5。 [0041]上述方法中，所述酚-氯仿-异戊醇溶液为酚、氯仿、异戊醇按照体积比为25:24:1 混匀得到的溶液；
[0042]所述溶解液为水。
[0043] 和/或，所述离心的条件均为14,000g离心10min-30min;
[0044] 所述静置的条件为-4_20°C静置0.5_6h。
[0045] 上述方法中，所述纤维素降解菌群为稳定降解木质纤维素原料的天然纤维素降解 菌群。
[0046] 所述纤维素降解菌群的菌体为将纤维素降解菌群10%接种量接种在菌群富集培 养基，置于50°C静置培养3天后，收集发酵产物中的沉淀即为纤维素降解菌群的菌体。
[0047]稳定降解木质纤维素原料的天然纤维素降解菌群为将木质纤维素原料和菌群在 菌群富集培养基中发酵3天，检测每天木质纤维素原料降解率，若3天木质纤维素原料降解 率基本不变，为稳定降解木质纤维素原料的天然纤维素降解菌群。
[0048]本发明的实验证明，本发明通过在提取前采用高盐溶液进行洗脱，并通过加入溶 菌酶和机械匀浆强化细胞破壁，并通过蛋白酶K破壁，不仅使微生物细胞壁更易破碎，DNA分 子更易释放，同时有效保证了过程的可重复性，进而保证了提取的宏基因组DNA片段完整 性、纯度和菌群结构完整性。本发明为天然纤维素利用菌群的研究和应用，以及微生物分子 生态学研究提供了有效的技术支撑。
【附图说明】
[0049]图1为采用T-RFLP技术比较不同提取方法获得的宏基因组DNA多样性。
【具体实施方式】
[0050] 下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
[0051] 下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
[0052]以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。
[0053] 1L菌群富集培养基为5g蛋白胨，1.5g酵母粉，5g氯化钠，2.5g碳酸f丐溶于1L水中， 加入l〇g的A.vicel?PH-101(Sigma公司，货号为11365)^11采用氢氧化钠调节为8.0，1211€ 灭菌15min〇
[0054] 蛋白酶K:Sigma公司，产品号为P6556(粉剂），酶活为39U/mg。
[0055] 溶菌酶:Sigma公司，产品号为62971(粉剂），酶活为70,000U/mg。
[0056] 玻璃珠：Sigma公司，0.1mm产品号为G8893,0.5mm产品号为G9268，1.0mm产品号为 Z250473,5.0mm 产品号为 18406。
[0057] KC1 溶液为75.5g KC1 溶液 1L水中，121。(：灭菌 15min。
[0058] 溶菌酶溶液的pH值为7 ? 4，由 11 ? 65g/L的Na2HP〇4，1 ? 65g/L的KH2PO4，9g/L的NaCl， lOOg/L的溶菌酶和水组成，采用0.22mi无菌滤膜过滤除菌。
[0059] 蛋白酶1(溶液的？田直为7.4，由11.658/1的恥2册〇4，1.658/1的诎屮〇4,98/1的恥(：1， l〇〇g/L的蛋白酶K和水组成，采用0.22mi无菌滤膜过滤除菌。
[0060]玻璃珠的直径为0.1111111、0.5111111、1.〇1111]1和5.〇111111，其中，直径0.11111]1玻璃珠、直径0.5111111 玻璃珠和1.0mm玻璃珠的体积比为1:1:1; 5.0mm每管加3个。
[00611 交联聚乙烯吡咯烷酮(PVPP)溶液的pH为7.4，由10% (质量体积比）的PVPP、2% (质 量体积比）的 SDS、50mMTri s、50mM EDTA、1 OOmMNaCl 和水组成。
[0062]酚-氯仿-异戊醇溶液为酚、氯仿、异戊醇按照体积比为25:24:1混匀。
[0063] 快速组织勾衆机为Master Prep〇
[0064] 实施例1、纤维素降解菌群的宏基因组提取
[0065] 一、天然纤维素降解菌群的筛选
[0066] 1、纤维素降解菌群的选取
[0067] 将10g/L的木质纤维素原料(Sigma公司Avicel?PH-101，货号为11365)与5g在纤 维素富集地区采集的土壤样品共同加入菌群富集培养基中，于30-65°C培养，通过连续传代 培养，选择转化纤维素能力稳定的菌群，即为稳定降解木质纤维素原料的菌群。
[0068] 转化纤维素能力稳定菌群的稳定性衡量指标为将木质纤维素原料和菌群在菌群 富集培养基中发酵3天，检测每天木质纤维素原料降解率，若3天木质纤维素原料降解率基 本不变，为转化纤维素能力稳定菌群。
[0069]木质纤维素降解率计算方法:采用称重的离心管收集菌群发酵液，12,000g离心 5min;弃去上清后用与发酵液等体积3M的柠檬酸溶液重悬浮菌液，12，000g离心5min;弃去 上清后用与发酵液等体积2M的氢氧化钠溶液重悬浮菌液，12,000g离心5min;弃去上清后采 用与发酵液等体积去离子水重复清洗3遍后，65°C烘干称重;离心管增重的体积即为残留木 质纤维素含量，木质纤维素降解率计算公式为：
[0070]木质纤维素降解率=(1-残留木质纤维素含量/发酵液中初始木质纤维素含量)* 100%
[0071 ]木质纤维素原料取自北方农村，土壤样品取自海南省五指山地区。
[0072] 2、纤维素降解菌群发酵液的制备
[0073]将上述1获得的转化纤维素能力稳定菌群作为种子液，采用菌群富集培养基作为 培养基，10%接种量，置于50°C静置培养3天后，收集发酵液体即为纤维素降解菌群发酵液。 [0074] 二、菌群宏基因组DNA提取
[0075] 1、菌群破壁
[0076] (1)取上述一的2获得的转化纤维素能力稳定菌群发酵液5mL，14,000g离心收集菌 体后，加入等体积KC1溶液，漩涡震荡洗脱菌体，1，000g离心后取沉淀，再向沉淀中加入等体 积KC1溶液，用2mL旋盖离心管14,000〖离心1〇111；[11收集菌体；
[0077] (2)收集的菌体称重，按照lg菌体7，000，000U的比例向收集的菌体加入溶菌酶溶 液(菌体和溶菌酶溶液加料体积比为lg: lml)，漩涡震荡混匀，置于30°C水浴锅处理60min， 得到溶菌酶裂解后产物；
[0078] (3)向溶菌酶裂解后产物中加入等体积的蛋白酶K溶液（lg: 3，900U)，漩涡震荡混 匀，置于30 °C水浴锅处理60min，得到蛋白酶K酶解后产物；
[0079] (4)向蛋白酶K酶解后产物中加入0.5g玻璃珠和lmL交联聚乙烯吡咯烷酮(PVPP)溶 液，混合(蛋白酶K酶解后产物、玻璃珠和交联聚乙烯吡咯烷酮溶液的配比为lg: 0.5g: lmL) 后用快速生物样品匀质器6m/s线速度处理两次，每次40s，得到匀浆产物；用14,000g离心 30min，收集上清液，得到破壁处理后产物。
[0080] 2、有机溶液抽提
[0081] 向上述1的(4)获得的破壁处理后产物中加入等体积的酚-氯仿-异戊醇抽提液，漩 涡震荡混匀，14，000g离心30min，收集上清液，即为水相。
[0082] 3、DNA沉淀、洗涤和溶解
[0083] (1)向上述2得到的水相中加入等体积的体积百分含量为70%异戊醇水溶液混 勾，-4 °C沉淀6h，14，000g离心15min收集沉淀；
[0084] (2)向（1)获得的沉淀加入5倍体积百分含量为70 %的乙醇水溶液洗涤2次，14， 000g离心15min收集沉淀；
[0085] (3)晾干上述(2)沉淀用无菌水溶解，即实验组宏基因组DNA。
[0086]实施例2、采用现有试剂盒提取唾液样品宏基因组DNA (对比例）
[0087] 对比例1、取消KC1溶液洗脱和溶菌酶强化破壁步骤提取宏基因组DNA [0088] 一、天然纤维素降解菌群的筛选 [0089] 1、纤维素降解菌群的选取
[0090] 将10g/L的木质纤维素原料(Sigma公司Avicel?PH-101，货号为11365)与5g在纤 维素富集地区采集的土壤样品共同加入菌群富集培养基中，于30_65°C培养，通过连续传代 培养，选择转化纤维素能力稳定的菌群，即为稳定降解木质纤维素原料的菌群。
[0091] 转化纤维素能力稳定菌群的稳定性衡量指标为将木质纤维素原料和菌群在菌群 富集培养基中发酵3天，检测每天木质纤维素原料降解率，若3天木质纤维素原料降解率基 本不变，为转化纤维素能力稳定菌群。
[0092]木质纤维素降解率计算方法:采用称重的离心管收集菌群发酵液，12,000g离心 5min;弃去上清后用与发酵液等体积3M的柠檬酸溶液重悬浮菌液，12，000g离心5min;弃去 上清后用与发酵液等体积2M的氢氧化钠溶液重悬浮菌液，12,000g离心5min;弃去上清后采 用与发酵液等体积去离子水重复清洗3遍后，65°C烘干称重;离心管增重的体积即为残留木 质纤维素含量，木质纤维素降解率计算公式为：
[0093]木质纤维素降解率=(1_残留木质纤维素含量/发酵液中初始木质纤维素含量)* 100%
[0094]木质纤维素原料取自北方农村，土壤样品取自海南省五指山地区。
[0095] 2、纤维素降解菌群发酵液的制备
[0096]将上述1获得的转化纤维素能力稳定菌群作为种子液，采用菌群富集培养基作为 培养基，10%接种量，置于50°C静置培养3天后，收集发酵液体即为纤维素降解菌群发酵液。 [0097] 二、菌群宏基因组DNA提取 [0098] 1、菌群破壁
[0099] (1)取上述一的2获得的转化纤维素能力稳定菌群发酵液5mL，14,000g离心收集菌 体后，按照1 g菌体3，900U的比例向收集的菌体加入蛋白酶K溶液，漩涡震荡混匀，置于30 °C 水浴锅处理60min，得到蛋白酶K酶解后产物；
[0100] (2)向蛋白酶K酶解后产物中加入0.5g玻璃珠和lmL交联聚乙烯吡咯烷酮(PVPP)溶 液，混合(蛋白酶K酶解后产物、玻璃珠和交联聚乙烯吡咯烷酮溶液的配比为lg: 0.5g: lmL) 后用快速生物样品匀质器6m/s线速度处理两次，每次40s，得到匀浆产物；用14,000g离心 30min，收集上清液，得到破壁处理后产物。
[0101] 2、有机溶液抽提
[0102] 向上述1的(4)获得的破壁处理后产物中加入等体积的酚-氯仿-异戊醇抽提液，漩 涡震荡混匀，14，000g离心30min，收集上清液，即为水相。
[0103] 3、DNA沉淀、洗涤和溶解
[0104] (1)向上述2得到的水相中加入等体积的体积百分含量为70%异戊醇水溶液混 勾，-4 °C沉淀6h，14，000g离心15min收集沉淀；
[0105] (2)向（1)获得的沉淀加入5倍体积百分含量为70 %的乙醇水溶液洗涤2次，14， 000g离心15min收集沉淀；
[0106] (3)晾干上述(2)沉淀用无菌水溶解，即实验组宏基因组DNA。
[0107] 对比例2、取消KC1溶液洗脱步骤提取宏基因组DNA
[0108] -、天然纤维素降解菌群的筛选
[0109] 1、纤维素降解菌群的选取
[0110] 将l〇g/L的木质纤维素原料(Sigma公司Avicel?PH-101，货号为11365)与5g在纤 维素富集地区采集的土壤样品共同加入菌群富集培养基中，于30_65°C培养，通过连续传代 培养，选择转化纤维素能力稳定的菌群，即为稳定降解木质纤维素原料的菌群。
[0111] 转化纤维素能力稳定菌群的稳定性衡量指标为将木质纤维素原料和菌群在菌群 富集培养基中发酵3天，检测每天木质纤维素原料降解率，若3天木质纤维素原料降解率基 本不变，为转化纤维素能力稳定菌群。
[0112] 木质纤维素降解率计算方法:采用称重的离心管收集菌群发酵液，12,000g离心 5min;弃去上清后用与发酵液等体积3M的柠檬酸溶液重悬浮菌液，12，000g离心5min;弃去 上清后用与发酵液等体积2M的氢氧化钠溶液重悬浮菌液，12,000g离心5min;弃去上清后采 用与发酵液等体积去离子水重复清洗3遍后，65°C烘干称重;离心管增重的体积即为残留木 质纤维素含量，木质纤维素降解率计算公式为：
[0113] 木质纤维素降解率=(1-残留木质纤维素含量/发酵液中初始木质纤维素含量)* 100%
[0114]木质纤维素原料取自北方农村，土壤样品取自海南省五指山地区。
[0115] 2、纤维素降解菌群发酵液的制备
[0116] 将上述1获得的转化纤维素能力稳定菌群作为种子液，采用菌群富集培养基作为 培养基，10%接种量，置于50°C静置培养3天后，收集发酵液体即为纤维素降解菌群发酵液。
[0117] 二、菌群宏基因组DNA提取
[0118] 1、菌群破壁
[0119] (1)取上述一的2获得的转化纤维素能力稳定菌群发酵液5mL，14,000g离心收集菌 体后，按照lg菌体7，000，000U的比例向收集的菌体加入溶菌酶溶液，漩涡震荡混匀，置于30 °C水浴锅处理60min，得到溶菌酶裂解后产物；
[0120] (2)向溶菌酶裂解后产物中加入等体积的蛋白酶K溶液，漩涡震荡混匀，置于30°C 水浴锅处理60min，得到蛋白酶K酶解后产物；
[0121] (3)向蛋白酶K酶解后产物中加入0.5g玻璃珠和lmL交联聚乙烯吡咯烷酮(PVPP)溶 液，混合(蛋白酶K酶解后产物、玻璃珠和交联聚乙烯吡咯烷酮溶液的配比为lg: 0.5g: lmL) 后用快速生物样品匀质器6m/s线速度处理两次，每次40s，得到匀浆产物；用14,000g离心 30min，收集上清液，得到破壁处理后产物。
[0122] 2、有机溶液抽提
[0123] 向上述1的(4)获得的破壁处理后产物中加入等体积的酚-氯仿-异戊醇抽提液，漩 涡震荡混匀，14，000g离心30min，收集上清液，即为水相。
[0124] 3、DNA沉淀、洗涤和溶解
[0125] (1)向上述2得到的水相中加入等体积的体积百分含量为70%异戊醇水溶液混 勾，-4 °C沉淀6h，14，000g离心15min收集沉淀；
[0126] (2)向（1)获得的沉淀加入5倍体积百分含量为70 %的乙醇水溶液洗涤2次，14， 000g离心15min收集沉淀；
[0127] (3)晾干上述(2)沉淀用无菌水溶解，即实验组宏基因组DNA。
[0128] 对比例3、现有方法提取
[0129] 将实施例1的一获得的纤维素降解菌群发酵液采用购自M P公司的 Fas tDNASo i lDNAKi t试剂盒进行宏基因组DNA提取，得到对照组宏基因组DNA。
[0130] 操作参照试剂盒说明书。
[0131] 实施例4、实施例1与实施例2提取的宏基因组DNA比较
[0132] 1、浓度与纯度检测
[0133] 米用Nanodrop(赛默飞世尔科技，型号Nanodrop 2000c)分别测定实施例1与实施 例2提取的宏基因组DNA浓度与纯度（以0D 260/280表示），如表1所示，并采用琼脂糖电泳检 测DNA浓度和完整度。
[0134]表1为提取DNA浓度与纯度比较
[0136] 由表1可知，本发明提供的方法提取天然纤维素利用菌群宏基因组DNA相较于试剂 盒方法获得的宏基因组DNA在浓度和纯度方面均有显著地提升。
[0137] 2、电泳检测
[0138] 分别取实施例1与实施例2提取的宏基因组DNA为模板，采用Hot-start ExTaq(购 自 Takara，宝生物工程(大连)有限公司）以6-FAM-8F(5 ' -AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3 '）作为 正向引物，926R(5 ' -CCGTCAAITCCTTTRAGTIT-3 '）作为反向引物，进行Touchdown PCR〇
[0139] PCR程序:94°C首先预变性3分钟；之后为20个梯度降温循环，94°C变性30秒后，退 火温度从65°C每循环下降0.5°C至56°C，持续30秒，72°C延伸30秒;再94°C变性30秒，55°C退 火30秒，72°C延伸30秒，10个循环;最后72°C延伸10分钟。
[0140] 将PCR产物稀释为相同浓度，采用Hha I和Hae III限制性内切酶(购自Takara，宝 生物工程(大连)有限公司）按照酶操作说明书对样品避光进行酶切，酶切后产物分别采用 琼脂糖电泳和ABI-3730测序仪进行荧光信号和长度分析。
[0141]结果如图1所示，A为琼脂糖电泳结果;B为ABI-3730测序仪检测结果，1为实施例2 对照方法提取的宏基因组DNA(条带1为实施例1方法提取的DNA，2-4为实施例2中的对比例 1-3提取方法提取的DNA)，2为实施例1本发明方法提取的宏基因组DNA(序号1为实施例1方 法提取DNA的检测结果，2-4为实施例2中的三种对比例提取方法提取DNA的检测结果）；可以 看出，本发明提供的方法提取获得的天然纤维素利用菌群宏基因组DNA相较于试剂盒方法、 以及未采用本方法组合破壁强化处理方法，一方面提取的DNA浓度更高且碎片更少，另一方 面在保留菌群组成多样性方面有着显著地提升，能够更真实的反映菌群的结构信息。因此， 本发明提供的方法更适用于天然纤维素降解菌群的宏基因组DNA提取。
【主权项】
1. 一种纤维素降解菌群宏基因组DNA的提取方法，包括如下步骤:对纤维素分解菌群依 次进行菌体破壁、有机溶液抽提DNA、异戊醇沉淀DNA和溶解DNA，得到宏基因组DNA; 所述菌体破壁包括如下步骤： (1) 将所述纤维素分解菌群的菌体用高盐溶液进行高盐洗涤，收集高盐洗涤后菌体； (2) 将所述高盐洗涤后菌体用溶菌酶裂解，得到溶菌酶裂解后产物； (3) 将所述溶菌酶裂解后产物用蛋白酶K酶解，得到蛋白酶K酶解后产物； (4) 匀浆所述蛋白酶K酶解后产物，收集匀浆产物的上清液。2. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于： 步骤（1)中，所述高盐洗涤为将所述纤维素分解菌群的菌体与所述高盐溶液混匀，离心 收集沉淀，得到洗涤后菌体； 步骤(2)中，所述裂解为将所述高盐洗涤后菌体和溶菌酶溶液混匀，加热反应，得到溶 菌酶裂解后产物； 步骤(3)中，所述酶解为将所述溶菌酶裂解后产物和蛋白酶K溶液混匀，再次加热反应， 得到蛋白酶K酶解后产物； 步骤(4)中，所述匀浆为先将所述蛋白酶K酶解后产物、玻璃珠和交联聚乙烯吡咯烷酮 溶液混合，得到混合产物，再用匀浆器匀浆所述混合产物，得到匀浆产物;离心收集所述匀 浆产物，得到匀浆产物的上清。3. 根据权利要求2所述的方法，其特征在于： 所述高盐洗涤次数大于等于2。4. 根据权利要求2或3所述的方法，其特征在于： 步骤(1)中，所述纤维素分解菌群的菌体与所述高盐溶液等体积混匀； 步骤(2)中，所述高盐洗涤后菌体和所述溶菌酶溶液中酶的配比为lg: 7000，000U; 步骤(3)中，所述溶菌酶裂解后产物和所述蛋白酶K溶液中酶的配比为lg: 3900U; 步骤(4)中，所述蛋白酶K酶解后产物、所述玻璃珠和所述交联聚乙烯吡咯烷酮溶液的 加料配比为lg:〇. 5g: lmL。5. 根据权利要求2-4中任一所述的方法，其特征在于： 所述加热反应的条件为30-40°C反应15-60min; 所述再次加热处理为30_65°C反应15-60min; 所述匀浆的条件为4-6m/s线速度匀浆2次，每次20-40s。6. 根据权利要求2-5中任一所述的方法，其特征在于： 所述高盐溶液为浓度大于等于75.5g/l的KC1水溶液； 所述高盐洗涤后菌体和所述溶菌酶溶液的加料比为lg: lml; 所述溶菌酶裂解后产物和所述蛋白酶K溶液的加料体积比为1:1; 所述溶菌酶溶液由 5-15g/L 的 Na2HP〇4、l_5g/L 的 KH2P〇4、5-10g/L 的 NaCl、50-200g/L 的溶 菌酶和水组成； 所述蛋白酶 K 溶液由 5-15g/L 的 Na2HP〇4、l_5g/L 的 KH2P〇4、5-10g/L 的 NaCl、50-200g/L 的 蛋白酶K和水组成； 所述玻璃珠由直径〇 . 1mm玻璃珠、直径0.5mm玻璃珠和1.0mm玻璃珠按照等体积混匀得 到； 所述交联聚乙烯吡咯烷酮溶液由质量比体积为5-15%的PVPP、质量比体积为1-5%的 SDS、10-100mMTris、10-100mM EDTA、10-200mMNaCl和水组成。7. 根据权利要求1-6中任一所述的方法，其特征在于： 所述有机溶液抽提DNA为将所述匀浆产物的上清液与酚-氯仿-异戊醇溶液混匀，得到 混合液，离心收集所述混合液的水相； 所述异戊醇沉淀DNA为将所述水相与体积百分含量为50%-70%异戊醇水溶液混匀，静 置，离心收集沉淀，得到异戊醇沉淀后DNA; 所述乙醇洗涤DNA为将所述异戊醇沉淀后DNA与体积百分含量为70%乙醇水溶液混匀， 离心收集沉淀，得到洗涤后DNA; 所述溶解DNA为用溶解液溶解所述洗涤后DNA，得到宏基因组DNA。8. 根据权利要求7所述的方法，其特征在于： 所述匀浆产物的上清液和所述酚-氯仿-异戊醇溶液的体积比为1:1; 所述水相和所述体积百分含量为50%_70%异戊醇水溶液的体积比为1:1; 所述异戊醇沉淀后DNA与所述体积百分含量为70%乙醇水溶液的体积倍为1:3-5。9. 根据权利要求7或8所述的方法，其特征在于： 所述酚-氯仿-异戊醇溶液为酚、氯仿、异戊醇按照体积比为25:24:1混匀得到的溶液； 所述溶解液为水； 和/或，所述离心的条件均为14000g离心10min_30min; 所述静置的条件为-4°C-(-20°C)静置0.5-6h。10. 根据权利要求1-9中任一所述的方法，其特征在于： 所述纤维素降解菌群为稳定降解木质纤维素原料的天然纤维素降解菌群。
【文档编号】C12N15/10GK105821033SQ201610307905
【公开日】2016年8月3日
【申请日】2016年5月11日
【发明人】闫建斌, 杜然
【申请人】清华大学