一株木质纤维素类物质高效降解菌ii5及其应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及一株木质纤维素类物质高效降解菌Π5及其应用。
【背景技术】
[0002] 我国是一个农业大国，农业废弃物产生量极其巨大，由于受经济效益和技术普及 的限制，农业废弃物大都粗放低效利用且闲置状况严重，造成资源浪费和环境污染，废弃物 已经成为中国最大的污染源。而在农业废弃物存在着大量的木质纤维素，亟待人们去开发 利用。
[0003] 木质纤维素是自然界中仅次于纤维素的第二丰富的有机可再生资源，也是微生物 最难降解的成分之一。近年来，某些降解木质素的真菌已开始在实际中得以应用，但仍有待 进一步开发。木质素微生物降解的应用主要有:造纸工业;饲料工业;发酵与食品工业;生物 物肥料环境保护;木素酶的生物漂白技术，等等。
[0004] 目前农业有机固体废弃通常通过能源化利用、有机肥料、禽畜饲料、可食用菌培养 基料和工业原料进行利用。在利用农业废弃物的生产实践中，物理、化学和生物处理方法经 常结合使用，而其中生物处理方法尤其是利用微生物处理代表了今后的发展趋势。生物方 法就是指利用木质素降解酶去降解木质纤维材料中的木质素，从而使木质素-半纤维素-纤 维素结构解体，纤维素得以暴露出来供后续步骤处理与传统的机械、物理化学类法相比，生 物处理法的优点是能耗低，所需环境条件温和，避免了传统化学处理、机械处理技术等耗能 较多、存在环境污染等缺点，从成本和设备角度考虑，生物脱木质素法占有独特的优势。但 是，目前的生物处理法有一个很大的弱点限制了它的应用，这就是生物处理法中的关键角 色-木质素降解酶的活性普遍不高，从而导致处理效率较低，如果能利用基因工程和传统的 生物技术对菌种和酶进行改造，提高酶活力，降低酶成本，生物法脱木质素法则有望应用于 大规模工业生产。
[0005] 而目前应用最广泛的是微生物菌肥，微生物菌肥作为一种新的农业技术措施，在 发展高产、优质、高效农业中的作用逐渐被人们所认识。传统的微生物肥料己经在大面积推 广应用中，新型的微生物菌肥品种不断开发出来。微生物肥是由具有特殊效能的微生物经 过发酵而制成的、含有大量有益微生物、对作物有特定肥效的特定微生物制品。微生物肥料 利用微生物的生命活动，将作物不能吸收利用的物质转化为可被作物吸收利用的营养物， 改善作物的营养条件，有些兼有刺激作物生长或增强抗病性的作用，以提高作物产量，改 善农产品品质。它既能增加农产品的出日创汇，又具有工农业有机废物有效利用、防止环境 污染、改进土壤结构、提高土壤肥力和保护生态良性循环的巨大社会效益和生态效益。
[0006] 国内的研究大多数为真菌降解木质纤维素。但是，利用真菌降解木质纤维素普遍 存在酶活力较低的问题。由于细菌繁殖较快，发酵周期短，可应用于工业生产，且细菌产生 的纤维素酶一般作用条件为中性或偏碱性，这在制浆、造纸和洗涤剂工业等污染行业的废 水治理上有着潜在的应用前景，因此从细菌中筛选出有效菌株应用于木质纤维素降解具有 一定的实际意义及开发前景。
【发明内容】
[0007]本发明的目的是为了提供一株木质素高效降解菌115及其应用。
[0008]本发明的一株木质素高效降解菌为微小杆菌属(Exiguobacterium sp. )115,保藏 在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址是北京市朝阳区北辰西路1 号院3号，保藏日期为2014年12月12日，保藏号CGMCCNo.10167。
[0009]本发明的一株木质素高效降解菌115用于降解木质素上。
[0010] 本发明的有益效果如下：
[0011] 本发明的微小杆菌(Exiguobacteriumsp. )115增值迅速，适应性强，应用广泛;连 续传代培养10次，菌株生长情况、产酶情况以及酶活力稳定，无退化现象;对袋料木耳废料 和玉米猜杆具有明显的降解效果，经微小杆菌(Exiguobacteriumsp.) 115发酵处理后的袋 料木耳废料的失重率在36%以上，经微小杆菌(Exiguobacteriumsp.) 115发酵处理后的玉 米秸杆的失重率在30%以上;具有显著的木质素降解能力，可以高效降解木质素，经复合微 生物菌剂发酵处理的玉米猜杆中木质素含量是经微小杆菌(Exiguobacteriumsp. )115发 酵处理的玉米猜杆中木质素含量的1.6倍，作为单一菌株微小杆菌(Exiguobacteriumsp.) 115对木质素的降解能力强于复合微生物菌剂;在降解样品时，不影响样品中的主要元素含 量，不会导致试样中的全氮、全磷、全钾、速效磷和速效钾含量变化，保存样品肥效。
[0012]本发明从袋料木耳废料、林间朽木和林间土壤中分离筛选出能够以木质素为唯一 碳源生长的原始菌株，确定对木质素的降解能力以及种属关系，为将来复合微生物菌剂构 建奠定基础。将为我国农业资源的有效化利用提供有力帮助。
【附图说明】
[0013]图1为本发明微小杆菌属(Exiguobacteriumsp. )115培养12h后的扫描电子显微 镜图（X20，000);
[0014]图2为16SrDNA序列PCR扩增的琼脂糖凝胶电泳检测图其中，1泳道为Maker DL2000,2泳道为菌株115;
[0015]图3为回收后的PCR产物琼脂糖凝胶电泳检测图其中，1泳道为Maker DL2000,2泳 道为菌株115;
[0016]图4为阳性克隆子筛选的琼脂糖凝胶电泳检测图其中，1泳道为MakerDL2000,2泳 道为菌株115;
[0017] 图5为本发明微小杆菌属(Exiguobacteriumsp. )115的系统进化树；
[0018]图6为本发明微小杆菌(Exiguobacteriumsp. )115对袋料木耳废料的失重率图；[0019] 图7为本发明微小杆菌(Exiguobacteriumsp. )115对玉米猜杆的失重率图；
[0020] 图8为本发明微小杆菌(Exiguobacteriumsp. )115菌株降解后玉米猜杆中各组分 含量柱状图；其中，1为木质素含量柱状图；2为纤维素含量柱状图；3为半纤维素含量柱状 图；
[0021 ] 图9为本发明微小杆菌(Exiguobacteriumsp. )115菌株发酵处理后玉米猜杆中全 氮全磷和全钾含量柱状图；其中，1为全氮含量柱状图；2为全磷含量柱状图；3为全钾含量柱 状图；
[0022] 图10为本发明微小杆菌(Exiguobacterium sp. )115菌株发酵处理后玉米猜杆中 速效磷含量柱状图；
[0023] 图11为本发明微小杆菌(Exiguobacterium sp. )115菌株发酵处理后玉米猜杆中 速效钾含量柱状图。
【具体实施方式】
[0024]【具体实施方式】一:本实施方式的一株木质纤维素类物质高效降解菌115,它为微小 杆菌(Exiguobacterium sp.) 115，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中 心，保藏地址是北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日期为2014年12月12日，保藏号 CGMCCN0.10167。
[0025] 本实施方式的微小杆菌(Exiguobacteriumsp. )115为革兰氏阳性菌，该菌株幼龄 菌体形态呈杆状、成熟菌体呈球状，幼龄菌体大小为0.61~0.67X1.8~1.9μπι，成熟菌体直 径为0.59~0.65μπι，不形成芽孢，无鞭毛和荚膜;在LB培养基上形成圆形、不透明、橙黄色、 平坦、光滑、边缘整齐的菌落(如图1所示）。
[0026]该菌株的生理生化反应结果共18项、28个指标;结合形态与生理生化反应结果，比 对《伯杰氏细囷鉴定手册》确定该囷株的种属，结果如表1所不。
[0027]根据《常见细菌系统鉴定手册》和《伯杰细菌手册》对分离出的微小杆菌(Exiguobacterium sp. )115进行进行革兰氏染色、氧化酶、接触酶、焚光色素、甲基红、七叶 苷溶解、明胶液化、石蕊牛乳胨化及产酸、脂酶、淀粉水解、V.P.测定、柠檬酸盐利用、纤维素 降解、3-酮基乳糖利用、苯丙氨酸脱氨酶、色氨酸脱氨酶、耐热热性、耐盐性生理生化实验的 检测和鉴定。结果表明微小杆菌(Exiguobacterium sp.)II5为革兰氏阳性菌，耐盐性为 NaCl浓度10%，耐热性为50°C，可产生接触酶和色氨酸脱氨酶，但不能产生氧化酶、脂酶、苯 丙氨酸脱氨酶和荧光色素，甲基红、柠檬酸盐利用、七叶苷溶解和石蕊牛乳产酸表现为阳 性，V.P.试验、淀粉水解、明胶液化、石蕊牛乳胨化、纤维素降解和3-酮基乳糖利用表现为阴 性。
[0028] 表1菌株115的形态学特征与生理生化鉴定结果
[0029]
[0031]本实施方式的木质素高效降解菌为微小杆菌属(Exiguobacteriumsp. )115的筛 选方法如下：
[0032] 1、筛选方法
[0033]取10g样品在无菌条件下充分研磨，加入装有90mL无菌水(带玻璃珠)的三角瓶中， 振荡20min。取5mL样品悬液接入装有100mL液