本发明属于木质纤维素降解和微生物代谢领域，主要涉及一种酿酒酵母和尖孢镰刀菌两种菌同步糖化共发酵生产乙醇的方法，通过在不同时间段添加尖孢镰刀菌和酿酒酵母，以避免两种菌拮抗作用，提高己糖和戊糖利用率，从而达到利用木质纤维素生产乙醇的目的，同时通过原位酶的生产降低总成本。
背景技术：
纤维素是自然界中存在最广泛的一类碳水化合物，同时也是地球上数量最多的生物质资源，植物每年通过光合作用产生约1.55×1011吨纤维素类物质，仅我国农作物秸秆量就达7亿多吨。目前，自然界中只有小部分纤维素得到了利用，绝大多数纤维素被浪费并造成环境污染。产量巨大的木质纤维材料的主要成分为糖类和芳香族化合物，利用微生物生产的纤维素酶将其转化为糖，并进一步发酵生成乙醇等化工原料，对于开发新能源、保护环境具有非常重要的现实意义。
从纤维素生物质的乙醇生产涉及五个单元操作：预处理、纤维素酶的生产、酶水解、微生物发酵、产品回收。纤维素生产生物乙醇的过程一般有四种方式：单独水解和发酵、同步糖化发酵、同步糖化共发酵、联合生物加工技术。目前使用最为广泛的为同步糖化发酵。此方法用纤维素酶对纤维素进行水解，水解同时加入乙醇发酵菌，使水解与发酵在同一容器内进行。酶水解过程中得到的糖类能迅速被微生物利用生产乙醇。酶解过程中产生的葡萄糖和纤维二糖会很快积累，会对纤维素酶产生非常显著的终端产物反馈抑制作用，抑制酶解，使得最终的糖的转化率降低。同步糖化发酵在同一个反应容器中进行，可以消除纤维素酶受葡萄糖和纤维二糖的终产物抑制，提高纤维素酶解的效果并能降低酶制剂的用量，所得酒精浓度较高等优点。
在纤维素乙醇生产过程中，纤维素酶较高的成本一直是制约纤维素乙醇产业化的关键因素，尖孢镰刀菌(fusariumoxysporum)是一种丝状真菌，具有分解纤维素和半纤维素的酶系统，酿酒酵母主要利用己糖生成乙醇，对戊糖基本不能利用，而尖孢镰刀菌(fusariumoxysporum，除了具有分解纤维素和半纤维素的酶系统，还可以利用戊糖发酵生成乙醇。将尖孢镰刀菌和酿酒酵母共培养同步糖化共发酵木质纤维素生物质，通过分段添加已活化的酿酒酵母和尖孢镰刀菌，可减少纤维素酶用量，降低纤维素乙醇生产过程的成本，同时可提高己糖和戊糖利用率，进而达到利用木质纤维素生产乙醇的目的。
技术实现要素：
本发明针对原位酶的生产成本高，木糖利用率低，木质纤维素到乙醇的转化效率低的缺点，采用酿酒酵母和尖孢镰刀菌两种菌同步糖化共发酵方法。在同步糖化发酵前先使用naoh在低料液比下预处理小麦秸秆和水稻秸秆原料，破坏原料中部分木质素。通过添加少量纤维素酶对原料进行预酶解，再通过在不同时间段添加尖孢镰刀菌和酿酒酵母糖化发酵预处理后的木质纤维素生物质，以避免两种菌拮抗作用，提高己糖和戊糖利用率，从而达到提高木质纤维素到乙醇转化效率的目的。
实现上述目的，本发明所采用的具体实验步骤如下：
(1)将小麦秸秆与0.5mnaoh溶液按料液比1∶20混合，于高压蒸汽灭菌锅中121℃、预处理1小时，固体残渣水洗至中性，烘干然后粉碎，过20目筛。
(2)将上述经naoh处理后的物料添加少量纤维素酶进行预酶解，反应体积为100ml，葡聚糖负荷为3％-6％(w/v)。预酶解12-24小时。
(3)将上述预酶解12-24小时原料进行同步糖化发酵，在不同时间段分别添加已活化的酿酒酵母和尖孢镰刀菌。
(4)将酵母接种的时间定义为同步糖化发酵开始起点0h，在不同时间间隔取样监测发酵情况。用高效液相色谱法测乙醇和葡萄糖、木糖含量。
本发明的最大特点是在同步糖化发酵过程中的不同时间段添加酿酒酵母和尖孢镰刀菌两种菌进行共发酵，具有以下优点：
1)同步糖化发酵在同一个反应容器中进行，可以消除纤维素酶受葡萄糖和纤维二糖的终产物抑制，提高纤维素酶解的效果并能降低酶制剂的用量，所得酒精浓度较高等优点。
2)尖孢镰刀菌可以利用己糖和戊糖发酵生成乙醇，提高纤维素转化为乙醇的转化效率。
3)通过不同时间段添加尖孢镰刀菌和酿酒酵母避免两种菌的拮抗作用，提高己糖和戊糖利用率，从而达到提高木质纤维素到乙醇转化效率的目的。
附图说明
图1同步糖化共发酵工艺流程图
具体实施方式
下面通过具体实施例对本发明的技术方案做进一步说明。
本发明关键在于控制同步糖化发酵过程中酿酒酵母和尖孢镰刀菌添加时间，以获得较高乙醇浓度和转化率。因此，具体实施方式的主要差别为酿酒酵母和尖孢镰刀菌添加时间。具体实施方式如下：
实施例1：
(1)将自然风干的小麦秸秆切割为长度小于3cm的小段，按料液比为1∶20(g∶ml)加入0.5mol/lnaoh溶液，混匀，于高压蒸汽灭菌锅中121℃、预处理1小时，固体残渣水洗至中性，烘干后粉碎。
(2)将上述经naoh处理后的物料进行预酶解，反应体积为100ml，葡聚糖负荷为3％(w/v)。预酶解12-24小时。纤维素酶和β-葡萄糖苷酶按酶负荷为25fpu/g葡聚糖加入酶解体系中，木聚糖酶按照10mg/g葡聚糖加入酶体系中。加入终浓度50mg/l的氨苄卡那霉素防止发酵过程杂菌污染。
(3)酶解条件为50℃，摇床转速180rpm，预酶解12h后取1ml测糖浓度。
(4)将酵母接种的时间定义为同步糖化发酵开始起点0h，将尖孢镰刀菌种子液按总体积5％加入预酶解样品中。
(5)在6h、12h、24h、48h、72h取样监测发酵情况。样品12000rpm下离心5min，取上清，用高效液相色谱法测乙醇和葡萄糖、木糖含量。
实施例2：
(1)将自然风干的小麦秸秆切割为长度小于3cm的小段，按料液比为1∶20(g∶ml)加入0.5mol/lnaoh溶液，混匀，于高压蒸汽灭菌锅中121℃、预处理1小时，固体残渣水洗至中性，烘干后粉碎。
(2)将上述经naoh处理后的物料进行预酶解，反应体积为100ml，葡聚糖负荷为3％(w/v)。预酶解12-24小时。纤维素酶和β-葡萄糖苷酶按酶负荷为25fpu/g葡聚糖加入酶解体系中，木聚糖酶按照10mg/g葡聚糖加入酶体系中。加入终浓度50mg/l的氨苄卡那霉素防止发酵过程杂菌污染。
(3)酶解条件为50℃，摇床转速180rpm，预酶解12h后取1ml测糖浓度。
(4)将酵母接种的时间定义为同步糖化发酵开始起点0h，将尖孢镰刀菌种子液按总体积5％加入预酶解样品中，24h后将酵母种子液按总体积5％(3.2×107个/ml)加入酶解液中。
(5)在6h、12h、24h、30h、36h、48h、72h取样监测发酵情况。样品12000rpm下离心5min，取上清，用高效液相色谱法测乙醇和葡萄糖、木糖含量。
实施例3
(1)将自然风干的小麦秸秆切割为长度小于3cm的小段，按料液比为1∶20(g∶ml)加入0.5mol/lnaoh溶液，混匀，于高压蒸汽灭菌锅中121℃、预处理1小时，固体残渣水洗至中性，烘干后粉碎。
(2)将上述经naoh处理后的物料进行预酶解，反应体积为100ml，葡聚糖负荷为3％(w/v)。预酶解12-24小时。纤维素酶和β-葡萄糖苷酶按酶负荷为25fpu/g葡聚糖加入酶解体系中，木聚糖酶按照10mg/g葡聚糖加入酶体系中。加入终浓度50mg/l的氨苄卡那霉素防止发酵过程杂菌污染。
(3)酶解条件为50℃，摇床转速180pm，预酶解12h后取1ml测糖浓度。
(4)将酵母接种的时间定义为同步糖化发酵开始起点0h，将尖孢镰刀菌种子液按总体积5％加入预酶解样品中，36h后将酵母种子液按总体积5％(3.2×107个/ml)加入酶解液中。
(5)在6h、12h、24h、36h、42h、48h、60h、72h取样监测发酵情况。样品12000rpm下离心5min，取上清，用高效液相色谱法测乙醇和葡萄糖、木糖含量。
实施例4
(1)将自然风干的小麦秸秆切割为长度小于3cm的小段，按料液比为1∶20(g∶ml)加入0.5mol/lnaoh溶液，混匀，于高压蒸汽灭菌锅中121℃、预处理1小时，固体残渣水洗至中性，烘干后粉碎；
(2)将上述经naoh处理后的物料进行预酶解，反应体积为100ml，葡聚糖负荷为3％(w/v)。预酶解12-24小时。纤维素酶和β-葡萄糖苷酶按酶负荷为25fpu/g葡聚糖加入酶解体系中，木聚糖酶按照10mg/g葡聚糖加入酶体系中。加入终浓度50mg/l的氨苄卡那霉素防止发酵过程杂菌污染。
(3)酶解条件为50℃，摇床转速180rpm，预酶解12h后取1ml测糖浓度。
(4)将酵母接种的时间定义为同步糖化发酵开始起点0h，将尖孢镰刀菌种子液按总体积5％加入预酶解样品中，48h后将酵母种子液按总体积5％(3.2×107个/ml)加入酶解液中。
(5)在6h、12h、24h、48h、54h、60h、72h取样监测发酵情况。样品12000rpm下离心5min，取上清，用高效液相色谱法测乙醇和葡萄糖、木糖含量。
实施例5
(1)将自然风干的小麦秸秆切割为长度小于3cm的小段，按料液比为1∶20(g∶ml)加入0.5mol/lnaoh溶液，混匀，于高压蒸汽灭菌锅中121℃、预处理1小时，固体残渣水洗至中性，烘干后粉碎；
(2)将上述经naoh处理后的物料进行预酶解，反应体积为100ml，葡聚糖负荷为6％(w/v)。预酶解12-24小时。纤维素酶和β-葡萄糖苷酶按酶负荷为25fpu/g葡聚糖加入酶解体系中，木聚糖酶按照10mg/g葡聚糖加入酶体系中。加入终浓度50mg/l的氨苄卡那霉素防止发酵过程杂菌污染。
(3)酶解条件为50℃，摇床转速180rpm，预酶解12h后取1ml测糖浓度。
(4)将酵母接种的时间定义为同步糖化发酵开始起点0h，将尖孢镰刀菌种子液按总体积5％加入预酶解样品中，24h后将酵母种子液按总体积5％(3.2×107个/ml)加入酶解液中。
(5)在6h、12h、24h、48h、54h、60h、72h取样监测发酵情况。样品12000rpm下离心5min，取上清，用高效液相色谱法测乙醇和葡萄糖、木糖含量。
同步糖化发酵过程中酿酒酵母和尖孢镰刀菌添加时间选择原则是：得到高的乙醇产率和转化率。