一种芽孢杆菌及其同步糖化发酵生产l-乳酸的方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于有机酸发酵技术领域，设及k乳酸的生产方法，具体设及一种芽抱杆 菌极其同步糖化发酵生产高光学纯度k乳酸的方法。
【背景技术】
[0002] 生物质是指W木质素、纤维素、半纤维素W及其他有机质为主的陆生植物和水生 植物，是一种稳定的可再生能源资源，来源丰富，仅我国农作物賴杆产量每年约为7亿吨。 在上世纪石油危机后，人们开始重视由生物质为原料制备乳酸、燃料酒精的技术。
[0003] 乳酸（分子式：C2H5OCOOH)，即为a-径基丙酸，由于其分子中簇基a位碳原子为 不对称原子，因而具有旋光性，可分成U+)和D(-)两种构型，心乳酸为右旋型，D-乳酸为 左旋型。乳酸已广泛用于食品、饮料、饲料、现代医药、现代农药、日用化工、造纸及电子等行 业。高光学纯度的心乳酸是一种重要的食品添加剂和中间体，在食品、农业、医药、化工等 行业有广泛的应用，Wk乳酸为单体合成的聚k乳酸是环境友好的生物质塑料，可代替石 油来源的塑料，可缓解石油日益枯竭的能源危机，又可减缓环境污染。高光学纯度的k乳 酸，是重要的手性中间体和有机合成原料，在提高聚乳酸热稳定性等方面也具有重要作用。
[0004] 目前限制心乳酸的广泛应用的主要原因有：（1化-乳酸的生产成本高，其发酵 生产的原材料成本高，提纯和精制成本高；（2)没有筛选到合适的能发酵产生高光学纯度 k乳酸的菌株，因为一般的乳酸菌主要W发酵产生消旋乳酸为主；(3)现有已知的乳酸菌 一般不能利用戊糖，例如木糖、核糖和阿拉伯糖作为碳源。 阳0化]微生物发酵法是目前制备k乳酸的最主要方法之一，由于k乳酸的理化性质与D-乳酸极其相似，在生产工艺上可W借鉴，因此生产k乳酸的关键在于筛选出高光学纯度 k乳酸高产菌种，并应用低廉有广泛来源的原料进行发酵，简化发酵和提纯工艺，降低成 本。
[0006] 目前主要研究报道的菌种如表1所示。根据所采用的微生物菌种的不同，目前 k乳酸的微生物发酵分为根霉发酵和细菌发酵两大主要类型。根霉发酵属于好氧发酵， 需要较高水平的空气及揽拌系统，对电、蒸汽等能源的消耗较大，而且在发酵乳酸的同时还 进行其他途径的代谢，产生较多杂酸，降低了葡萄糖的转发率，生产成本高。故而用于工业 生产乳酸的菌种多为同型乳酸发酵的细菌，主要有乳杆菌属化actobacillus)、链球菌属 (Streptoccoccus)、乳球菌属（Lactococcus)。
[0007] 表1菌种及其发酵溫度
[0008] L/IN 丄WUiUiOUO A <" /J 乙/ ( X
[0009] 细菌发酵一般为同型发酵，发酵过程中杂质生成少，葡萄糖转发率高。运两类 菌的共同特点发酵溫度较低一般为30~42°C。容易污染杂菌，因此需要对发酵液进行 灭菌，造成能量的浪费和营养的损失。而化学合成法由于要用到乙醒和剧毒的氨氯酸， 酶法生产工艺复杂。微生物发酵法中主要用的菌种为乳酸菌（包括乳酸杆菌和链球菌） 和一些丝状真菌。乳酸菌作为生产菌株具有发酵周期短，代谢产物单一等优势。90%的 文献报道是关于乳酸菌作为生产菌株的，尤其是LactococcusIactis,Lactobacillus de化rueckii,Lactobacillushelveticus,Lactobacilluscasei等菌株报道得很多，运些 菌株的缺陷有W下几方面：（1)其发酵溫度较低为30~37°C，该溫度范围易染杂菌，造成发 酵产物k乳酸的光学纯度不纯；（2)代谢产物中本身含有相当数量的D-乳酸；（3)乳酸菌 本身在合成维生素B和某些氨基酸方面有缺陷，在发酵生产过程中需要补充添加复杂的营 养成分，对后续的乳酸的分离纯化及降低生产成本非常不利。丝状真菌的发酵虽然可W弥 补上述乳酸菌的一些缺点，例如可W耐受较高的初始糖浓度，可用碳源广泛，菌丝体的分离 容易进行等，但是也存在如下的缺点，例如丝状真菌的发酵生产是好氧发酵，需要配置较高 水平的空气供应和揽拌系统，对电、蒸汽等的消耗较大，而且在产生乳酸的同时，还容易产 生其他杂酸，例如米根霉发酵强度低，原料利用率不高，菌体形态难W控制等问题。
[0010] 理想的心乳酸的生产菌株应具备W下要求：（1)细胞能够迅速生长达到高的生物 量；（2)可利用廉价原料进行发酵生产k乳酸，而且在生产过程中能耐受高浓度糖的抑制 作用；（3)具有高生产速率和产物得率，而且能耐受高浓度底物的抑制作用；(4)提取工艺 过程中副产物尽可能少。
【发明内容】
[0011] 本发明的目的在于针对上述现有技术的不足，提供一种芽抱杆菌及利用其同步糖 化发酵生产高光学纯度k乳酸的方法，该方法中k乳酸的产量高，碳源来源广泛。
[0012] 为了实现上述目的，本发明采用了如下技术方案：
[0013] 本发明筛选得到一株可用于k乳酸发酵生产的耐高溫菌株芽抱杆菌度acillus SP. ) 13002,该菌株可在45~65°C的高溫下进行发酵，大大减少了发酵过程中污染杂菌的 机会，甚至可W在培养基不灭菌的情况下进行发酵生产，降低了能耗和生产成本。同时该菌 株的k乳酸光学纯度高达99. 8%W上，易于后续的分离纯化，因此，用Bacillus13002发 酵生产k乳酸具有良好的工业化生产前景。所述芽抱杆菌13002菌株具有如下性质：
[0014] (1)形态特征：菌落呈圆形凸起且富有光泽，边缘整齐无皱權，表面光滑，呈乳白 色，稍透明。菌种经革兰氏染色后，再经过16X100放大在光学显微镜下观察如图1所示，菌 体为杆状，单个排列；革兰氏阳性细菌，在一定条件下可产生芽抱，为兼性菌，菌体为杆状， 单个排列，宽约0. 5~1.Oym,长约3. 0~5.Oym。
[0015] (2)生理特征：接触酶、过氧化氨酶、V-P实验、硫化氨都为阳性，能水解酪蛋白、 明胶和淀粉，能利用巧樣酸盐、硝酸盐，不能利用丙酸盐，吗I噪实验为阴性，最高生长溫度为 65°C;能利用葡萄糖、薦糖、麦芽糖、果糖、甘露糖、木糖、乳糖、半乳糖，不能利用鼠李糖。
[0016] (3)提取其DNA，扩增其16SrDNA并测序其与Bacilluscoagulans(凝结芽胞杆 菌）的菌种的16SrDNA序列有大于99%的同源性，见核巧酸序列，如表1。
[0017] 根据形态、生理生化特性和DNA保守序列等3方面的信息，确定其为凝结芽抱杆 -tt： 园O
[0018] 一种同步糖化发酵生产k乳酸的方法，包括如下步骤：
[0019] (1)种子培养液制备：将处于对数期生长的芽抱杆菌13002的菌悬液接种于种子 培养基中，进行连续活化培养，得到种子培养液；所述种子培养基为：按照质量比计算，细 菌学蛋白腺0. 2份~1. 0份，酵母提取粉0. 1份~0. 5份，葡萄糖1. 0份~2. 0份，化Cl0. 5 份~1. 5份，用蒸馈水定容至100份，调节抑至6. 0~7. 5,灭菌后冷却即可；
[0020] 似同步糖化发酵心乳酸：W体积比2~10 :100的比例，将种子培养液接种于发 酵培养基中，在发酵罐中启动发酵后，W恒定补料速率向发酵培养基中补充a-淀粉酶和 糖化酶的混合液，培养至7化~9化收集发酵培养液。
[0021] 所述发酵培养基为：W重量份数计，15~25 %的淀粉溶液60~80份，葡萄糖 1. 0~2. 5份，氮源1. 0~4. 0份，屯水合硫酸儀0.Ol~0. 10份，用蒸馈水定容至100份， 调培养基抑至6. 0~7. 5,灭菌后冷却至45~65 °C。
[0022] 所述氮源是指：酵母粉、蛋白腺、牛肉膏、豆巧水解液、酵母浸膏、玉米浆蛋白水解 液中的一种或两种W上W任意比例组合。 阳02引所述a-淀粉酶的添加量是W每100g干淀粉加入a-淀粉酶为0. 02~0. 08血，W每100g干淀粉加入糖化酶0. 05~0. 20mL，两种酶混合后，用无菌水稀释5~10倍。
[0024] 所述a-淀粉酶和糖化酶的混合液的流加速率为0. 5~2. 0血/min。
[0025] 所述淀粉为玉米淀粉、木馨淀粉、马铃馨淀粉、大米粉或糖米粉中的一种或两种W 上。
[0026] 步骤似所述发酵溫度为45~65 °C。
[0027] 步骤（1)所述连续活化培养2~3次，发酵溫度均为45°C，培养时间均为2地。
[0028] 利用手性柱高效液相色谱法测定k乳酸的含量