一种凝结芽孢杆菌饲料添加剂及其制备方法

专利名称：：一种凝结芽孢杆菌饲料添加剂及其制备方法
技术领域：
：本发明涉及一种凝结芽孢杆菌饲料添加剂及其制备方法，属于微生物饲料添加剂
技术领域：
。
背景技术：
：作为抗生素的替代品，微生态制剂凭借其独特的调节肠道菌群的功能，正越来越受到词料业界人士的关注，而其中的乳酸菌类制剂更是备受青睐，以双歧乳酸杆菌和嗜酸乳杆菌、粪链球菌所制成的各种动物(包括人体在内)的保健品在国内外极其盛行。但这些制剂中使用的都是营养体细胞，对热和干燥的抵抗能力均较弱，保存性差，不耐加工，且经过消化道胃酸和胆盐的作用后活菌数急剧下降，使产品的应用受到限制。微胶囊包被法可提高产品中活菌的数量，但通过此法得到的产品价格昂贵。因此，只有找到一种既有良好的生物学功能又具有很强抗性的细菌，才能从根本上解决抗逆性和成本的问题。凝结芽孢杆菌^!"7/肌"^"/tf附，由于其独特的芽孢结构，兼具有乳酸菌的有益功能和芽孢杆菌的抗逆性强的特性、耐热、耐酸，此菌一方面可以改变目前市售各种乳酸菌保存性差，培养和加工条件苛刻等缺点，减少流通领域中由于保存性差带来的损失；另一方面由于省掉了微囊包被环节，大大降低了生产成本。将凝结芽孢杆菌用于饲料添加剂并进行工业化生产，可以提高动物体内的整肠和免疫力功能，更可以克服因一些抗生素药物饲料添加剂所带来的动物耐药性和二重感染等问题，起到某些抗生素药物所不能实现的保健效果。目前，凝结芽孢杆菌产品的研究尚处于起步阶段，专利CN1831U3A公开的一种用于水质净化的凝结芽孢杆菌的制备方法中，进行了固体发酵，制备的凝结芽孢杆菌活菌数高，可达ixio"，但是由于固体发酵法易于污染杂菌的缺点导致研究者开始转向采用液体发酵法；专利CN1579200A中公开了一种采用液体发酵法制备凝结芽孢杆菌菌剂的方法，液体发酵工艺简单，成本低，但是活菌数下降快，储存期短，且体积大，携带运输不便，容易污染;专利CN1857326A采用在菌泥中添加载体进行气流干燥将活菌制剂进行固化的技术，避免了液体发酵的弊端，提高了保存期，但是该专利将液体进行固化的过程中只采用了淀粉作为载体，载体类型比较单一，限制了应用的范围。
发明内容本发明的目的在于提供一种新型饲料添加剂——凝结芽孢杆菌饲料添加剂，本发明的另一目的是提供该凝结芽孢杆菌饲料添加剂的制备方法。本发明的技术方案如下本发明提供一种凝结芽孢杆菌伺料添加剂的制备方法，包括下述的步骤-1)凝结芽孢杆菌的一级斜面培养将凝结芽孢杆菌接种于一级斜面培养基上，于304(TC培养2436小时，得到一级凝结芽孢杆菌单菌落；所述的一级斜面培养基为按下述比例配制的混合液(g/L):大豆蛋白胨5.015.0，酵母膏5.015.0，葡萄糖3.010.0,MgS04.7H200.51.5，K2HP041.04.0，MnS042070ppm，CaC035.015.0，琼脂2030，pH为7.0;2)凝结芽孢杆菌的二级液体培养-将步骤1)培养的一级凝结芽孢杆菌单菌落接种于二级培养液中，装液量20100ml/500ml，在3545。C、180300rpm/min条件下培养2536小时，得到二级凝结芽孢杆菌种子液；所述的二级液体培养基为按下述比例配制的混合液(g/L):大豆蛋白胨5.015.0，酵母膏5.015.0，葡萄糖3.010.0，MgS04.7H200.51.5，K2HP041.04.0，MnS042070ppm，CaC035.015.0，pH为7.0;3)凝结芽孢杆菌三级扩大培养将步骤2)得到的二级凝结芽孢杆菌种子液体积百分比0.55%，在培养基上于3545。C、180300rpm/min条件下培养2536小时，得到凝结芽孢杆菌；所述的培养基同于步骤2)中的培养基；4)凝结芽孢杆菌的液体发酵发酵培养基为按下述比例配制的混合液(g/L):氮源2~50，碳源50150，K2HP041.03.0，CaC035.015.0;培养基混合均匀后通高压蒸汽升温至105121°C，并保温2040min，自然冷却515min，通冷却水冷却至3545°C，接入步骤3)中所述种子液，接种量0.55%，罐压0.020.10MPa，搅拌转速180300rpm，通风量l:0.21.0，发酵时间2040h，直至菌数达到10亿CFU/ml。上述步骤中所述的发酵培养基氮源为鱼粉、豆粕粉、棉籽粕、尿素、硫酸铵、磷酸氢二铵、大豆蛋白胨、酵母膏中的一种或几种。其中，所述的鱼粉、豆粕粉、棉籽粕在使用前，本发明优选用40%甲醛蒸汽灭菌2040分钟，粉碎至60120目。所述的碳源为葡萄糖、乳糖、淀粉、蔗糖、玉米粉、麸皮中的一种或几种。本发明所述的凝结芽孢杆菌词料添加剂的制备方法，进一步包括下述步骤将步骤4)中的凝结芽孢杆菌的发酵液采取离心、微滤浓縮、添加载体保护直接离心喷雾干燥工艺，发酵液经负压真空浓縮到原体积的2060%后，加入预先混合好的载体中，控制混合液固形物含量在10%50%，喷雾干燥，最终物料水分310%。最终物料菌体得率为90%，制剂的活菌数》lX10"'CFU/g。其中，所述的载体为有机载体和/或无机载体。所述的有机载体包括玉米芯粉、脱脂米糠、玉米蛋白粉、变性淀粉、葡萄糖中的一种或几种的混合物。所述的无机载体为石粉、沸石粉、硫酸铝钾中的一种或几种的混合物。本发明还包括由上述的凝结芽孢杆菌饲料添加剂的制备方法所制得的饲料添加剂。本发明提供的饲料添加剂及其生产工艺与现有技术相比，有明显的优点1)采用新型高效耐酸的凝结芽孢杆菌，耐受加工与耐受肠道生境；2)改固体发酵为液体发酵，避免固体发酵过程中杂菌污染严重的现象，但不增加生产成本；3)采用的凝结芽孢杆菌抗逆性好，活菌数高，可以避免贮存和运输中的活菌急速下降问题；4)该方法采用多种物质作为碳源、氮源以及载体的来源，大大扩大了实际应用范围；5)本方法生产成本低廉，具有显著的经济效益、社会效益和生态效益；6)该法制备的凝结芽孢杆菌活菌制剂可以促进动物生长，提高饲料转化率，以及降低动物腹泻率的发生。本发明上述主题范围不仅仅局限于以下实施例，凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范畴。具体实施例方式实施例l制备新型芽孢杆菌液剂-Yl1)凝结芽孢杆菌(保藏号为AS1.2407)—级斜面培养将凝结芽孢杆菌采用常规方法接种于一级斜面培养基上，于3(TC培养24小时，得到一级凝结芽孢杆菌单菌落；所述的培养基为按下述比例配制的混合物(g/L):大豆蛋白胨5.0，酵母膏15.0，葡萄糖3.0，MgS(V7H20:0.5，K2HP04:1.0，MnS04:20ppm，CaC03:5.0，琼脂20;pH:7.0;2)凝结芽孢杆菌二级液体培养将步骤l)培养的一级凝结芽孢杆菌单菌落采用常规方法接种于二级培养液中，装液量20ml/500ml，在35""C、180rpm/min条件下培养25小时，得到二级凝结芽孢杆菌种子液；所述的培养基为按下述比例配制的混合液(g/L):大豆蛋白胨5.0，酵母膏5.0,葡萄糖3.0，MgS047H20:0.5，K2HP04:1.0，MnS04:20ppm，CaC03:5.0;pH:7.0;3)凝结芽孢杆菌三级扩大培养将步骤2)得到的二级凝结芽孢杆菌种子液0.5%(用于步骤4)液体发酵时的接种量)分别采用常规方法在培养基上于35°C、180rpm/min条件下培养25小时，得到凝结芽孢杆菌；所述的培养基同于步骤2)中的培养基；4)凝结芽孢杆菌液体发酵培养所用的发酵培养基为按下述比例配制的混合液(g/L):豆粕2.0，葡萄糖50.0，K2HP041.0，CaC03:5.0;豆粕先经40%甲醛蒸汽灭菌20min，粉碎到60目后使用，发酵罐中发酵培养基混合液搅拌均匀后通高压蒸汽升温至105°C，并保温20min，灭菌时间到后自然冷却5min，通冷却水冷却至35"C，无菌条件下接入步骤3)中所述液体种子，接种量0.5%，发酵pH自然，罐压0.02MPa,搅拌转速180rpm，通风量1:0.2，发酵时间20h。直至菌数达到10亿CFU/mL。实施例2制备新型芽孢杆菌液剂-Y21)凝结芽孢杆菌(保藏号为AS1.2407)—级斜面培养将凝结芽孢杆菌采用常规方法接种于一级斜面培养基上，于4(TC培养36小时，得到一级凝结芽孢杆菌单菌落；所述的培养基为按下述比例配制的混合物(g/L):大豆蛋白胨15.0，酵母膏5.0，葡萄糖10.0，MgS047H20:1.5，K2HP04:4.0，MnS04:70ppm，CaC03:15.0，琼脂30，pH:7.0;2)凝结芽孢杆菌二级液体培养将步骤l)培养的一级凝结芽孢杆菌单菌落采用常规方法接种于二级培养液中，装液量100ml/500ml，在45。C、300rpm/min条件下培养36小时，得到二级凝结芽孢杆菌种子液；所述的培养基为按下述比例配制的混合液(g/L):大豆蛋白胨15.0，酵母膏15.0，葡萄糖10.0，MgS047H20:1.5，K2HP04:1.0，MnS04:70ppm，CaC03:15.0,pH:7.0;3)凝结芽孢杆菌三级扩大培养将步骤2)得到的二级凝结芽孢杆菌种子液5%(用于步骤4)液体发酵时的接种量)分别采用常规方法在培养基上于45-C、300rpm/niin条件下培养36小时，得到凝结芽孢杆菌；所述的培养基同于步骤2)中的培养基；4)凝结芽孢杆菌液体发酵培养所用的发酵培养基为按下述比例配制的混合液(g/L):豆粕50.0，葡萄糖150.0，K2HP044.0，CaC03:5.0;豆粕先经40%甲醛蒸汽灭菌40min，粉碎到60目后使用，发酵罐中发酵培养基混合液搅拌均匀后通高压蒸汽升温至121°C，并保温40min，灭菌时间到后自然冷却15min，通冷却水冷却至45。C，无菌条件下接入步骤3)中所述液体种子，接种量5^，发酵pH自然，罐压0.10MPa，搅拌转速300rpm，通风量1:1，发酵时间40h。直至菌数达到10亿。实施例3制备新型芽孢杆菌液剂-Y31)凝结芽孢杆菌(保藏号为AS1.2407)—级斜面培养将凝结芽孢杆菌采用常规方法接种于一级斜面培养基上，于36。C培养30小时，得到一级凝结芽孢杆菌单菌落；所述的培养基为按下述比例配制的混合物(g/L):大豆蛋白胨10.0,酵母膏10.0，葡萄糖5.0，MgS047H20:1.0，K2HP04:0.4，MnS04:40ppm，CaC03:10.0，琼脂25，pH:7.0;2)凝结芽孢杆菌二级液体培养将步骤l)培养的一级凝结芽孢杆菌单菌落采用常规方法接种于二级培养液中，装液量700ml/500ml，在36°〇、200rpm/min条件下培养30小时，得到二级凝结芽孢杆菌种子液；所述的培养基为按下述比例配制的混合液(g/L):13.0，酵母膏10.0，葡萄糖5.0，MgS047H20:1.0，K2HP04:0.4，MnS04:40ppm，CaC03:10.0,pH:7.0;3)凝结芽孢杆菌三级扩大培养-将步骤2)得到的二级凝结芽孢杆菌种子液3%(用于步骤4)液体发酵时的接种量)分别采用常规方法在培养基上于36r、200rpm/mhi条件下培养30小时，得到凝结芽孢杆菌；所述的培养基同于步骤2)中的培养基；4)凝结芽孢杆菌液体发酵所用的发酵培养基为按下述比例配制的混合液(g/L):棉籽粕50.0，淀粉150.0，K2HP042.0，CaC03:10.0;棉籽粕先经40%甲醛蒸汽灭菌25min，粉碎到60目后使用，发酵罐中发酵培养基混合液搅拌均匀后通高压蒸汽升温至115°C，并保温25min,灭菌时间到后自然冷却10min，通冷却水冷却至36'C，无菌条件下接入步骤3)中所述液体种子，接种量3%，发酵pH自然，罐压0.04MPa，搅拌转速250rpm，通风量l:0.6，发酵时间36h。直至菌数达到10亿。实施例420制备新型芽孢杆菌液剂-Y4Y20表1制备新型芽孢杆菌液剂Y4Y20<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>实施例21制备新型芽孢杆菌粉剂一F1将实施例1得到的发酵液经负压真空浓縮到原体积的20%后，加入预先混合好的载体中，载体组成为石粉80%、玉米蛋白粉20%，控制固形物含量在10%,喷雾干燥。最终物料水分3%,物料菌体得率为90%，制剂的活菌数》1X10'。C兩g。实施例22制备新型芽孢杆菌粉剂一F2将实施例2得到的发酵液经负压真空浓縮到原体积的60%后，加入预先混合好的载体中，载体组成为葡萄糖80。/。、玉米蛋白粉20%，控制固形物含量在50%，喷雾干燥。最终物料水分10%，物料菌体得率为90%，制剂的活菌数》lX10'。C雨g。实施例23制备新型芽孢杆菌粉剂一F3将实施例3得到的发酵液经负压真空浓縮到原体积的40%后，加入预宂混合好的载体中，载体组成为石粉50%、玉米蛋白粉50%，控制固形物含量在30%，喷雾干燥。最终物料水分5%,物料菌体得率为90%，制剂的活菌数》1X1010CFU/g。实施例2440制备新型芽孢杆菌制剂一F4F20表2制备新型芽孢杆菌粉剂F4F20<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table>实施例41新型芽孢杆菌制剂的耐高温性将对酸具有良好耐受的菌株凝结芽孢杆菌添加到5%预混料和全价料中进行制粒处理，检测菌株的存活率；在8(TC、90°C、10(TC下制粒处理10分钟的芽孢存活率分别在100%、91.2%、83.6%，结果见表3;说明该新型芽孢杆菌可以耐受高温制粒处理而保持良好的活性。表3新型芽孢杆菌剂在不同制粒温度下处理10min芽孢存活率结果活菌数单位CFU/g<table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table>实施例42新型芽孢杆菌制剂的耐酸性凝结芽孢杆菌在人工模拟胃液(pH2.0、3.0、4.0)37。C处理2小时，菌株的存活率分别达到3.8%、24.9%和99.4%;在人工模拟胃液(pH2.0、3.0、4.0)37。C处理6小时，菌株的存活率分别达到2.1%、10.5%和52.3%;说明该新型芽孢杆菌制剂可以经过胃液后并保持相当高活性而到达肠道。表4新型芽孢杆菌在人工模拟胃液中37'C处理2h和6h存活结果活菌数单位CFU/mL<table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table>实施例43新型芽孢杆菌制剂的储存稳定性在5%的预混料中贮存6个月和12个月的存活率分别90.1%和80.6%，说明该新型芽孢杆菌储存性良好，可以在一定的时期内保持一定的活菌数量，保证活菌活性。表5新型芽孢杆菌在5%预混料中贮藏6、12个月的存活率结果活菌数单位CFU/g<table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table>制剂在养猪中的应用选择同批的杜X长X大三元杂保育出栏健康活泼小猪60头，根据体重及性别比例相近的原则，将小猪分为A、B、C三个组，其中A组为对照组，不设重复，B、C组为试验组，各设2个重复，每组12头，公母各半，分头编号；A组词喂常规玉米-豆粕型日粮，不添加微生态制剂；B组在A组基础日粮的基础上添加0.1%的新型芽孢杆菌制剂；C组在A组基础日粮的基础上添加0.1%产酶益生素。试验猪处理及分组情况详见表6。表6试验猪分组处理情况重复数(个)一22试验猪数(头)122424添加竞争产品产酶益生素添加新型芽孢杆_新型芽孢杆菌菌试验结果与分析(l)试验猪只体重和平均日增重(见表7)表7各试验组猪只体重及增重别项目平均始重(kg/头)平均末重(kg/头)全期净增重(kg/头)平均日增重(g/头'日)18.50±1.0230.45±2.0017.4057919.40±0.1038.89±1.1.4819.5267419.03±0.0137.47±0.6917.97607表7是各处理组猪只体重、净增重和平均日增重。从上表可见，在试验初期，各组猪只体重差异均不显著(P>0.05)。试验期间A组、B组、C组日增重分别为579克、674克、607克，添加新型添加剂的试验B组平均日增重比对照组提高14.09%，添加产酶益生素的试验C组平均日增重比对照组提高4.61%。(2)试验猪只耗料及饲料转化率表8各试验组猪只的料肉比情况<table>tableseeoriginaldocumentpage18</column></row><table>由表8可知，添加新型芽孢杆菌剂的B组，料肉比优于对照组。(3)试验期间小猪腹泻情况表9小猪腹泻头数及腹泻率<table>tableseeoriginaldocumentpage19</column></row><table>*腹泻率=腹泻头数/总头数由表9可知，试验期间腹泻率表现为对照组最多，试验C组其次，试验B组最少。以上将新型芽孢杆菌剂添加入猪料中的饲喂效果表明该菌剂在增加体重、减少料肉比、特别是减少腹泻的发生具有良好的作用。实施例45新型芽孢杆菌制剂在肉鸡中的应用词养肉鸡，在l日龄入雏时和4周龄末(28日龄)、7周龄末(49日龄)分别以重复为单位称重，并统计耗料量，计算04周和47周龄的死亡只数、增重、采食量以及料肉比。结果见表IO。表1049日龄添加新型芽孢杆菌剂对肉仔鸡生产性能的影响<table>tableseeoriginaldocumentpage19</column></row><table>表10的数据表明，C组鸡的体重比空白对照组提高49克，比抗生素组提高40克，同时，C组鸡的耗料量也明显低于其他组。说明添加新型芽孢杆菌添加剂可明显提高肉鸡的增重，也能提高饲料转化效率，节约伺料开支，提高经济效益。权利要求1、一种凝结芽孢杆菌饲料添加剂的制备方法，其特征在于包括下述步骤1)凝结芽孢杆菌的一级斜面培养将凝结芽孢杆菌接种于一级斜面培养基上，于30～40℃培养24～36小时，得到一级凝结芽孢杆菌单菌落；所述的一级斜面培养基为按下述比例配制的混合液(g/L)大豆蛋白胨5.0～15.0，酵母膏5.0～15.0，葡萄糖3.0～10.0，MgSO4.7H2O0.5～1.5，K2HPO41.0～4.0，MnSO420～70ppm，CaCO35.0～15.0，琼脂20～30，pH为7.0；2)凝结芽孢杆菌的二级液体培养将步骤1)培养的一级凝结芽孢杆菌单菌落接种于二级培养液中，装液量20～100ml/500ml，在35～45℃、180～300rpm/min条件下培养25～36小时，得到二级凝结芽孢杆菌种子液；所述的二级液体培养基为按下述比例配制的混合液(g/L)大豆蛋白胨5.0～15.0，酵母膏5.0～15.0，葡萄糖3.0～10.0，MgSO4.7H2O0.5～1.5，K2HPO41.0～4.0，MnSO420～70ppm，CaCO35.0～15.0，pH为7.0；3)凝结芽孢杆菌三级扩大培养将步骤2)得到的二级凝结芽孢杆菌种子液体积百分比0.5～5％，在培养基上于35～45℃、180～300rpm/min条件下培养25～36小时，得到凝结芽孢杆菌；所述的培养基同于步骤2)中的培养基；4)凝结芽孢杆菌的液体发酵发酵培养基为按下述比例配制的混合液(g/L)氮源2～50，碳源50～150，K2HPO41.0～3.0，CaCO35.0～15.0；培养基混合均匀后通高压蒸汽升温至105～121℃，并保温20～40min，自然冷却5～15min，通冷却水冷却至35～45℃，接入步骤3)中所述种子液，接种量0.5～5％，罐压0.02～0.10MPa，搅拌转速180～300rpm，通风量10.2～1.0，发酵时间20～40h，直至菌数达到10亿CFU/ml。2、如权利要求l所述的凝结芽孢杆菌饲料添加剂的制备方法，其特征在于所述的发酵培养基氮源为鱼粉、豆粕粉、棉籽粕、尿素、硫酸铵、磷酸氢二铵、大豆蛋白胨、酵母膏中的一种或几种。3、如权利要求2所述的凝结芽孢杆菌饲料添加剂的制备方法，其特征在于所述的鱼粉、豆粕粉、棉籽粕使用前需用40%甲醛蒸汽灭菌2040分钟，粉碎至60120目。4、如权利要求1所述的凝结芽孢杆菌词料添加剂的制备方法，其特征在于所述的碳源为葡萄糖、乳糖、淀粉、蔗糖、玉米粉、麸皮中的一种或几种。5、如权利要求l所述的凝结芽孢杆菌饲料添加剂的制备方法，其特征在于进一步包括下述步骤将步骤4)中的凝结芽孢杆菌的发酵液采取离心、微滤浓縮、添加载体保护直接离心喷雾干燥工艺，发酵液经负压真空浓縮到原体积的2060。％后，加入预先混合好的载体中，控制混合液固形物含量在10%50%，喷雾干燥，最终物料水分310%。6、如权利要求5所述的凝结芽孢杆菌饲料添加剂的制备方法，其特征在于最终物料菌体得率为90%,制剂的活菌数》lXl()WCFU/g。7、如权利要求5所述的凝结芽孢杆菌饲料添加剂的制备方法，其特征在于所述的载体为有机载体和/或无机载体。8、如权利要求7所述的凝结芽孢杆菌饲料添加剂的制备方法，其特征在于:所述的有机载体包括玉米芯粉、脱脂米糠、玉米蛋白粉、变性淀粉、葡萄糖中的一种或几种的混合物。9、如权利要求7所述的凝结芽孢杆菌饲料添加剂的制备方法，其特征在于:所述的无机载体为石粉、沸石粉、硫酸铝钾中的一种或几种的混合物。10、一种如权利要求1至9任一项所述的凝结芽孢杆菌饲料添加剂的制备方法所制得的饲料添加剂。全文摘要本发明涉及一种凝结芽孢杆菌饲料添加剂及其制备方法，属于微生物饲料添加剂
技术领域：
。该添加剂使用鱼粉、豆粕粉、棉籽粕、尿素、硫酸铵、磷酸氢二铵、大豆蛋白胨、酵母膏中的一种或几种作为氮源，葡萄糖、乳糖、淀粉、蔗糖、玉米粉、麸皮中的一种或几种作为碳源进行发酵而成，活菌数达到1×10⁹CFU/ml以上，进一步经浓缩干燥或直接吸附到载体上，喷雾干燥得到芽孢杆菌粉剂，活菌数达到1×10¹⁰CFU/g以上。利用本发明提供的深层液体发酵法生产的新型芽孢杆菌产品无毒副作用、无耐药性、无残留；耐受加工、耐受肠道生境、耐储存。文档编号C12N1/00GK101390571SQ20071012211公开日2009年3月25日申请日期2007年9月21日优先权日2007年9月21日发明者宇刘,琨姚,孙占敏,宋维平,张玳华,白玉卿,云莫,贾秋英,军赵,赵雁青申请人:北京大北农科技集团有限责任公司