专利名称：一种梭菌及其培养方法与应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及微生物领域中的一种梭菌及其培养方法与应用。
技术背景植物通过光合作用生成有机物，其中35%或更多以作物秸秆等纤维素类物质形 式存在，但是这类纤维素类物质目前还没能被充分开发利用，因而又成为重要的环 境污染源。纤维素类物质能被降解为五碳糖、六碳糖，然后糖可通过微生物发酵产 生燃料酒精或其它化工产品原料。因此人们一直在探索研究将纤维素类废弃物转化 为可再生能源。目前一般是用化学或物理方法水解纤维素产生糖，再用生物发酵糖 产生燃料乙醇，但此种技术成本高， 一直没有大规模产业化。用微生物细胞及纤维 素酶来降解纤维素可以提高降解效率，降低成本。因而寻找高效的微生物细胞或纤 维素酶应用于纤维素降解工业，将会对促进纤维素类物质转化为可再生资源有重要 的意义。瘤胃作为反刍动物的消化器官，是迄今已知的、降解转化纤维素类物质效率最 高的天然体系，它依赖于瘤胃微生物群体的协同作用将天然纤维类物质快速降解转 化成一系列动物营养和能源物质。可以认为瘤胃是一个完美的、天然的秸秆纤维降 解消化加工厂和高效厌氧发酵罐，目前尚没有任何人工系统能与之媲美。目前报道的能降解纤维素的梭菌有解纤维梭菌，分离自土壤，具有分解纤维 素的能力，但不具有酯酶活性(Petitdemange, E., F. Caillet， J. Giallo， and C. Gaudin. 1984. 67ostrio^."/z ce77iA/oZy"c咖sp. nov. ， a cellulolytic， mesophilic species from decayed grass. Int. J. Syst. Bacteriol. 34:155 - 159);热纤维梭菌，分离自土壤，高温(58°C)生长，具有分解纤维素 的能力，但不能利用其中的木聚糖和木糖(Johnson EA, Sakajoh M, Halliwell G， Madia A， Demain AL. 1982. Saccharif ication of Complex Cellulosic Substrates by the Cellulase System from t7osfrW〃/H ^ ei7z oce72咖.Appl Environ Microbiol. 43(5):1125-1132)。 发明内容本发明的一个目的是提供一种梭菌，该梭菌具有降解纤维素及木聚糖、木糖和
酯类物质的活性。本发明所提供的梭菌，被鉴定为居瘤胃梭菌67oWW&'咖rw肌'/20coh肌来源 于牦牛瘤胃内容物。所述居瘤胃梭菌具体为居瘤胃梭菌("o"n'c^咖r咖i'"oco7咖)Hl，它于2007 年8月6日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏中心地址 是中国北京市朝阳区大屯路甲3号，保藏号为CGMCCNo. 2125。本发明所提供的居瘤胃梭菌H1具有以下特征1) 菌落特征菌落直径为1.0-2.0 mm，菌落呈圆形，表面光滑，边缘整齐， 凸起，黄色或白色。2) 细胞形态特征细胞为杆状，顶端圆钝；革兰氏染色阴性；细胞直径 0. 8-1.0 um。3) 生理生化特征厌氧生长；接触酶阴性；不产H引哚；脲酶阴性；不水解七 叶灵；不液化明胶；不产生H2S;不还原硝酸盐；VP试验阴性；能利用纤维二糖、 纤维素、麦芽糖、木糖、木聚糖、乳糖作为碳源，不能利用阿拉伯糖、果糖、半乳 糖、葡萄糖、糖原、丙酮酸、蔗糖、海藻糖、淀粉、苦杏仁苷、赤藓糖醇、甘油、 肌醇、乳酸、甘露醇、松三糖、蜜二糖、棉子糖、鼠李糖、核糖、水杨苷、马尿酸； 可以利用铵盐作为氮源。4) 居瘤胃梭菌Hl的16S rRNA基因序列长度为1547 bp，其核苷酸序列如序列 表序列1所示。本发明的另一个目的是提供一种培养居瘤胃梭菌H1的方法。 本发明所提供的培养居瘤胃梭菌Hl的方法，是将居瘤胃梭菌Hl接种于RC培养基，在25—45t、 pH 6—10的条件下培养。在1000ml上述RC培养基中含有瘤胃液，200-600ml;无机盐溶液I ，100-200ml;无机盐溶液II， 100-200ml;碳源物质，l-4g;氮源物质，0. 3-1.0g;余量为水。其中，所述无机盐溶液I是浓度为0. 2-0. 4%的iyP04溶液；所述无机盐溶液 II为含0. 2-0. 4% KH2P04、 0. 4-0. 8% (NH4)2S04、 0. 4-0. 8% NaCl、 0. 04-0. 08% MgS04、 0.04-0.08% CaCl2的水溶液。所述百分含量均为质量百分含量。其中，碳源物质可以选自纤维二糖、纤维素、麦芽糖、木糖、木聚糖和乳糖中 的一种或几种，氮源物质可以为半胱氨酸盐酸盐和铵盐中的一种或几种，具体可以 根据实际情况而定。 为了使RC培养基维持在一个比较稳定的pH值范围内，还要向培养基中加入 5-15g的NaHC03。上述RC培养基还包括氧化还原指示剂，具体可为刃天青，其含量可为 0. 2-0. 6mg。本发明培养方法中，所需的厌氧环境是通过注入C02气体得到的， 一般注入达 到l大气压的量。其中，最适培养温度为35—4rC，最适pH为6.5—7.5。 本发明所提供的居瘤胃梭菌H1易培养，培养效率高，可达2.5士lg/L。 本发明的居瘤胃梭菌H1是从牦牛的瘤胃中分离得到的，是一种能够降解纤维 素及木聚糖、木糖和酯类的微生物。该微生物中含有降解纤维素的复合酶系，包括 外切纤维素酶、内切纤维素酶、木聚糖酶、甘露聚糖酶、酯酶、果胶酸酶，酶活分 别为为4. 1±1. 19U/mg、 118. 7±4. 5U/mg、 167. 36±22. 9U/mg、 45. 9±3. 52U/mg、 4土0.5U/mg、 35.3士1.77U/mg。与解纤维梭菌相比，本发明中的居瘤胃梭菌HI除 具有分解天然纤维素的能力外，还具有分解其中酯的酯酶活性；与热纤维梭菌相比， 居瘤胃梭菌H1中温(39°C)生长，易培养，并具有利用戊糖的能力。通过对本发 明居瘤胃梭菌H1参与纤维素类物质降解的酶系的研究，探索利用其细胞或纤维素 酶建立纤维素类物质高效转化系统，可以为实现纤维素类物质高效利用提供技术支 持。因此本发明中的居瘤胃梭菌H1在降解纤维素类物质中将能够得到广泛应用， 在纤维素降解工业中会有广阔的应用前景。
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明均为常规方法。 实验中所使用的RC液体培养基的基本组成为(/升)瘤胃液400ml;无机盐溶液I: 150ml;无机盐溶液II: 150ml;纤维二糖2.5g;半胱氨酸盐酸盐0.5g;刃天青0. 4mg; Na线:10g;蒸馏水定容至1000ml。 无机盐溶液I :质量百分比浓度为0. 3%的K2HP04溶液。无机盐溶液II :含0. 3% KH2P04、 0. 6% (NH4) 2S04、 0. 6% NaCl 、 0. 06% MgS04、 0. 06% CaCh的水溶液。所述百分含量均为质量百分含量。实验中所使用的RC固体培养基是向上述RC液体培养基中加入15g琼脂，使其 终浓度为1. 5%。
实施例l、菌株H1的分离制备取牦牛瘤胃内容物，将其接种于以滤纸纤维素为底物的RC液体培养基中传代 培养，得到富集物；用富集物作为接种源，将其接种于以纤维二糖为底物的RC固 体培养基，用Himgate滚管技术分离得到。将其保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC),其保藏 编号为CGMCC No. 2125。实施例2、菌株鉴定一、 形态及生理生化特征将菌株H1 (CGMCC No. 2125)接种于纤维二糖为底物的RC固体培养基(含质量 百分含量为1. 5%的琼脂)，在pH为7.0，温度为39t:的条件下固体滚管培养2天。观察菌落及细胞的形态特征，并进行如下生理生化实验l革兰氏染色试验，2 接触酶试验，3产生吲哚试验，4脲酶试验，5水解七叶灵试验，6液化明胶试验， 7产生H2S试验，8还原硝酸盐试验，9 VP试验，IO底物利用试验，ll氮源利用 实验。观察结果及实验结果如下1) 菌落特征菌落直径为1.0-2.0 mm，菌落呈圆形，表面光滑，边缘整齐， 凸起，黄色或白色。2) 细胞形态特征细胞为杆状，顶端圆钝；革兰氏染色阴性；细胞直径 0.8-l.Oum。产生端生芽孢，胞囊膨大。3) 生理生化特征厌氧生长；接触酶阴性；不产吲哚；脲酶阴性；不水解七 叶灵；不液化明胶；不产生H2S;不还原硝酸盐；VP试验阴性；能利用纤维二糖、 纤维素、麦芽糖、木糖、木聚糖、乳糖作为碳源，不能利用阿拉伯糖、果糖、半乳 糖、葡萄糖、糖原、丙酮酸、蔗糖、海藻糖、淀粉、苦杏仁苷、赤藓糖醇、甘油、 肌醇、乳酸、甘露醇、松三糖、蜜二糖、棉子糖、鼠李糖、核糖、水杨苷、马尿酸; 可以利用铵盐作为氮源。二、 菌株H1 (CGMCC No. 2125)的16S rRNA基因的PCR扩增和序列测定 1)提取DNA将居瘤胃梭菌H1 (CGMCCNo. 2125)接种于RC液体培养基培养；取生长至对数 晚期的发酵液，5000转/分钟离心5分钟，去除上清液；用TES (50mMTris， 50 mM EDTA-Na2， 50mM NaCl， pH 8. 0-8. 2)溶液洗3遍；用0. 5 mL TES溶液将菌体混
匀，加入适量溶菌酶，37。C保温2小时；加入0. 2 mL 20% SDS， 6(TC保温10分钟； 加入0.3mL 5M NaC104，混匀；加入等体积酚-氯仿-异戊醇(25: 24: 1)，轻轻摇 匀5分钟左右，离心(5000转/分钟，5分钟)，吸取上清液，再用酚-氯仿-异戊 醇(25: 24: l)处理一遍；然后依次用氯仿-异戊醇(24: 1， v/v)处理两遍，直到 没有蛋白膜出现；上清液加入20ul 0.2 % RNA酶37t:保温30分钟，氯仿-异戊 醇(24: 1， v/v)处理一遍；上清液加入20ixl蛋白酶K (50-70 u g/mL) ， 37°C 保温1小时，氯仿-异戊醇(24: 1， v/v)处理一遍；上清液用2倍体积冰乙醇沉 淀，70%冰乙醇溶液浸泡5分钟；晾干后溶于TE溶液中作为模板DNA。 2) 16S rRNA基因的PCR扩增及测序用于PCR扩增的正向引物为5， -AGAGTTTGATCCTGGCTCAGAACGAACGCT-3， (nt 8-37)，反向引物为5' -TACGGCTACCTTGTTACGACTTCACCCC-3' (nt 1479-1506)，分 别对应于大肠杆菌的16S rRNA基因中8-37和1479-1506位的碱基。PCR反应体系 (50ul)为10Xbuffer 5n 1 ; 25誦ol/L MgCl2 4u 1; 10 mmol/L dNTPs 1 u 1; 30 pmol/L引物各lul; ddH20 36ul; Taq DNA酶lul;模板lul。 PCR反应条 件为95°C 10 min， 95°C 1 min， 55°C 1 min， 72°C 1 min， 30个循环；72°C 10 rain， 4。C保存。PCR产物的测序采用ABI BigDye3. 1测序试剂盒(Applied Biosystems)和 DNA自动测序仪(model ABI3730; Applied Biosystems)。测序结果表明，菌株H1 (CGMCCNo. 2125)的16S rRNA基因序列长度为1547 bp，其核苷酸序列如序列表序列1所示。将16S rRNA基因序列在GenBank中进行同源比对分析，结果表明，其序列与 67ostr^/Z咖7e/7foce"鹏的16S rRNA基因序列的相似性为94%。参照《Bergey， s Manual of Systematic Bacteriology》(第二版)，根据 其形态特征和生理生化特征，以及根据其16S rRNA基因序列在GenBank中的搜索 结果，菌株H1 (CGMCC No. 2125)被鉴定为新种居瘤胃梭菌(Ga^WW咖实施例3、居瘤胃梭菌H1的培养1)将居瘤胃梭菌H1以5y。的比例接种于50ml RC液体培养基，在25°C、 pH为 6的条件下培养。RC液体培养基的组成(/升)如下
瘤胃液200 ml;无机盐溶液I: 100 ml;无机盐溶液II : 100 ml;纤维素l.Og;半胱氨酸盐酸盐0.3g; NaHC03: 5g;刃天青0. 2 mg;蒸馏水定容至lOOOOml。 无机盐溶液I :质量百分比浓度为0. 2%的K2HP04溶液。无机盐溶液II :含0. 2%KH2P04、 0. 4% (NH4)2S04、 0. 4%NaCl、 0. 04%MgS04、 0. 04% CaCl2的水溶液。所述百分含量均为质量百分含量。培养所需的厌氧环境是通过注入C02气体得到的，直至达到1大气压(1. 01X105 Pa)为止。实验设三次重复，平均菌体浓度达0.5土0.3g/L。2) 将居瘤胃梭菌H1以5%比例接种于50 ml RC培养基，在35。C、 PH为6. 5 的条件下培养。RC培养基的组成(/升)如下瘤胃液300 ml;无机盐溶液I: 125 ml;无机盐溶液II: 125 ml;麦芽糖2.0g;半胱氨酸盐酸盐0.4g; NaHC03: 7g;刃天青0. 3mg;蒸馏水定容至lOOOml。 无机盐溶液I :质量百分比浓度为0. 25%的K2HP04溶液。无机盐溶液II :含0. 25%KH2P04、 0. 5% (NH4)2S04、 0. 5%NaCl、 0. 05%MgS04、 0. 05% CaCh的水溶液。所述百分含量均为质量百分含量。培养所需的厌氧环境是通过注入C02气体得到的，直至达到1大气压(1. 01X105 Pa)为止。实验设三次重复，平均菌体浓度达2.0土lg/L3) 将居瘤胃梭菌HI以5%的比例接种于50 ml RC培养基，在38°C、 pH为7. 0的条件下培养。RC培养基的组成(/升)瘤胃液400ml;无机盐溶液I: 150ml;无机盐溶液II: 150ml;纤维二糖2. 5g;半胱氨酸盐酸盐0. 5g; Na线:10g;刃天青0. 4 mg;蒸馏水定容至lOOOOml。 无机盐溶液I :质量百分比浓度为0. 3%的K2HP04溶液。无机盐溶液II:含0. 3% KH2P04、 0. 6% (NH4)2S04、 0. 6% NaCl、 0. 06% MgS04、 0. 06% CaCl2的水溶液。所述百分含量均为质量百分含量。
培养所需的厌氧环境是通过注入C02气体得到的，直至达到1大气压(1. 01X105 Pa)为止。实验设三次重复，平均菌体浓度达2.5士lg/L。4) 将居瘤胃梭菌H1以5%比例接种于50 ml RC培养基，在41'C、 pH为7. 5的条件下培养。RC培养基的组成(/升)瘤胃液..500ml;无机盐溶液I: 175 ml;无机盐溶液II: 175 ml;木聚糖和 木糖中的一种或二种共3.5g; (NH4)2S04: 0. 7g; Na线:12 g;刃天青0.5mg; 蒸馏水定容至1000ml。无机盐溶液I :质量百分比浓度为0. 35%的K2HP04溶液。无机盐溶液II:含O. 35% KH2P04、 0.7% (NH4)2S04、 0.7% NaCl、 0.07% MgS04、 0.07% CaCl2的水溶液。所述百分含量均为质量百分含量。培养所需的厌氧环境是通过注入C02气体得到的，直至达到1大气压(1. 01X105 Pa)为止。实验设三次重复，平均菌体浓度达2.0土lg/L。5) 将居瘤胃梭菌Hl以5%比例接种于50 ml RC培养基，在45°C、 pH为10的条件下培养。RC培养基的组成(/升)-瘤胃液600ml;无机盐溶液I: 200 ml;无机盐溶液II: 200 ml;乳糖4g;N跳:l.Og; Na跳:15g;刃天青0.6mg;蒸馏水定容至1000ml。 无机盐溶液I :质量百分比浓度为0. 4%的K2HP04溶液。无机盐溶液II:含0. 4%KH2P04、 0. 8% (NH4)2S04、 0. 8%NaCl、 0. 08%MgS04、 0. 08% CaCl2的水溶液。所述百分含量均为质量百分含量。培养所需的厌氧环境是通过注入C02气体得到的，直至达到1大气压(1. 01X105 Pa)为止。实验设三次重复，平均菌体浓度达0. 3±0. lg/U6) 将居瘤胃梭菌H1以5%比例接种于50 ml RC培养基，在46。C、 pH为7. 0 的条件下培养。 RC培养基的组成(/升)瘤胃液400ml;无机盐溶液I: 150ml;无机盐溶液II: 150ml;纤维二糖2. 5g;半胱氨酸盐酸盐0. 5g; NaHC03: 10g;刃天青0. 4 mg;蒸馏水定容至lOOOml。 无机盐溶液I :质量百分比浓度为0. 3%的K2HP04溶液。无机盐溶液II:含0. 3% KH2P04、 0. 6% (NH4)2S04、 0. 6%NaCl、 0. 06%MgS04、 0. 06% CaCl2的水溶液。所述百分含量均为质量百分含量。培养所需的厌氧环境是通过注入C02气体得到的，直至达到1大气压(1. 01X105 Pa)为止。实验设三次重复，三次重复中菌体均不生长。实验结果表明菌株H1厌氧生长，生长温度从25r到45t，46。C不生长，最 适生长温度35-4rC; pH生长范围6-10，最适生长pH为6.5-7.5。在最适生长条 件下，菌体浓度可达2.5土lg/L。实施例4、居瘤胃梭菌H1CGMCC No.2125中几种降解纤维素的酶的酶活测定一、 制备酶液将居瘤胃梭菌H1 CGMCC No. 2125接种于RC液体培养基，pH为7. 0，培养温 度为39'C，培养3天后，离心收集细胞；将细胞沉淀悬浮于PBS缓冲液中作为酶液。 RC培养基组成为(/升)瘤胃液400ml;无机盐溶液I: 150ml;无机盐溶液II: 150ml;纤维二糖2. 5g;半胱氨酸盐酸盐0. 5g; NaHC03: lOg;刃天青0. 4 mg;蒸馏水定容至麵ml。 无机盐溶液I :质量百分比浓度为0. 3%的K2HP04溶液。无机盐溶液II:含0. 3% KH2P04、 0. 6% (NH4) 2S04、 0. 6% NaCl、 0. 06% MgS04、 0. 06% CaCl2的水溶液。所述百分含量均为质量百分含量。培养所需的厌氧环境是通过注入C02气体得到的，直至达到1大气压(1.01X105 Pa)为止。二、 酶活测定1)酶活测定反应体系(500ul)包括1%反应底物(质量百分含量)，250yl; 500 mM乙烷磺酸吗啉(morpholine ethanesulfonic acid， MES) - NaOH缓冲液， 100Pl， pH为6.0;酶液，150nl。反应温度为37"C，采用DNS比色法测定产生
的还原糖量。一个酶活力单位(1U)定义为每分钟释放出lymol还原糖的酶量。2)用上述酶活测定反应体系分别测定不同酶活，每个实验设三次重复A、 外切纤维素酶底物为微晶纤维素，反应12小时，三次重复平均测得酶 活为4. 1±1. 19U/mg。B、 内切纤维素酶底物为羧甲基纤维素(CMC),反应30分钟，三次重复平 均测得酶活为118. 7±4. 5U/mg。C、 木聚糖酶底物为木聚糖，反应30分钟，三次重复平均测得酶活为 167. 36±22. 9U/mg。D、 甘露聚糖酶底物为槐豆胶(locust bean gum)，反应30分钟，三次重 复平均测得酶活为45. 9±3. 52U/mg。E、 果胶酸酶底物为果胶，反应30分钟，三次重复平均测得酶活为 35. 3 ±1. 77U/mg。F、 酯酶底物为阿魏酸甲酯，反应30分钟，三次重复平均测得酶活为 4±0. 5U/mg。实施例5、利用本发明的居瘤胃梭菌H1降解滤纸纤维素一、 配制培养基将Whatman I滤纸剪成条状，以3%的质量百分含量加入不含底物的RC培养基 中，最终形成的RC培养基的组成如下(/升)瘤胃液400 ml;无机盐溶液I: 150 ml;无机盐溶液II: 150 ml; WhatmanI号滤纸2.5g;半胱氨酸盐酸盐0. 5g; NaHC03: 10g;刃天青0. 4 mg;蒸馏水 定容至1000 ml。无机盐溶液I :质量百分比浓度为0. 3%的K2HP(V溶液。无机盐溶液II:含0. 3% KH2P04、 0. 6% (NH4) 2S04、 0. 6% NaCl、 0. 06% MgS04、 0. 06% CaCh的水溶液。所述百分含量均为质量百分含量。培养所需的厌氧环境是通过注入C02气体得到的，直至达到1大气压(1.01X105 Pa)为止。二、 将在以纤维二糖为底物的RC液体培养基中生长的居瘤胃梭菌HI作为实验 菌体，当菌体浓度达2.5g/L时，将其以1/10的体积比接种于4ml上述以Whatman
I滤纸为底物的RC培养基，在38。C、 pH 7.0的条件下培养。三、 滤纸失重测定利用硝酸-乙醇法测定培养后剩余的滤纸质量，同培养前的滤纸质量进行比较， 减少的质量为降解造成的滤纸失重。原来滤纸的质量为0. 12g，培养8天后滤纸的质量为0. 06g。四、 降解率 降解率的计算公式为降解率=(培养前滤纸的质量-培养后滤纸的质量)/培养前滤纸的质量 本实验中的降解率=(0. 12g-0.06g) /0. 12g=50%
序列表<160>1<210>1〈211〉1547〈212>醒〈213〉梭菌属居瘤胃梭菌(CJosWd/i鹏r,'/ ocoJ鹏)<400〉13g3gtttg3tacctggctcaggctgg咖cacctccttagagtttgatcatggctcaggc60tg縦gctggcggcgtgcttaacacatgcaagtcgaacgaactgaggagagcttgctctc120caaagtt3gtggcggacgggtgagtaacgcgtgggtaacctgcctcatgc鄉gggatagi180cgtttggaaa_cgaacgctaat3CCgC3t朋actatggattaccgcatggtaattatagca240aagatttatcggcatgagatggacccgcgttggattagct3gttggtg3gataacagccc300accaaggcgacgatccatagccggcctgagagggtgaacggccacattgg360cggccca3Eictccta_cggg3ggC3gCElgtgggg朋城tgcacaatgggcgC33gCCtg3420tgC3gCg3Cgccgcgtg肪gga卿aggtcttcggattgtaaacttctatC8gC3ggg肌480gaaaaa^aatgacggtacctgact犯ga^gctccggctaactacgtgccagcagccgcggt540aatacgtagggagcgagcgttatccggatttactgggtgtaaagggtgcgtaggcggcat600gg她gtc明aagtgaaattttggggctcaactccagagctgctctgaaactgctgtgct660agagtgtgggagaggEiaagtggaattccgagtgtagcggtgaaatgcgtag卿Ucgga720ggaacaccagtagcgaaggcggctttctggaccataactgacgctgaggc3cg￡ia_gigcgt780ggggagcaaaceigg3tt3g3t3CCCtggt3gtccacgccgt朋acgatga3tgcta_ggtg840tcggcccttacgggggtcggtgccg朋gttaacacattaagcattccacctggg肌gtac900gatcgcaagattgaaactcaaaggaattgacggggacccgcacaagcggtggagcatgtg960gtttaattcgaagcaacgcgaag8i3cctt8cctaaacttgacatccttctgaccggtctt1020taatcggacttttcggtgcttgcactgacggaagtgacaggtggtgcatggttgtcgtca1080gctcgtgtcgtgagatgttgggttaagtcccgcaacgagcgcaacccctatccttagtag1140ccatcattaagttgggcactctagggagactgccagggat雄ttggaggaaggtgggga1200tgacgtcaaatcatcatgccccttatgtttagggctscacacgtgctacaatggctgcta1260C3犯ggg朋gC33tgCCgCg3ggCCg3gCgascctcaaaaaagcagtcccagttcggatt1320gtagtctgcaactcgactacatgaagttggaatcgctagtaatcgcgaatcagaatgtcg1380cggtgaatacgttcccgggtcttgtacacaccgcccgtcacaccatgggagttg鄉ggg1440cccaacgtcggtga_ccca￡icccgtaagggagggagccgcctaaggcaaaatcaataactg1500gggtgaagtc gtaacaaggt agccgtatcg gaaggtgcgg ctggatc 154权利要求
1、居瘤胃梭菌(Clostridium ruminocolum)H1 CGMCC No.2125。
2、 权利要求1所述居瘤胃梭菌H1 CGMCC No. 2125的培养方法，是将居瘤胃梭菌 HI CGMCC No. 2125接种于RC培养基，在25—45°C、 pH 6—10的条件下进行培养。
3、 根据权利要求2所述的培养方法，其特征在于所述RC培养基，在1000ml 中含有瘤胃液，200-600ml;无机盐溶液I ， 100-200ml;无机盐溶液II， 100-200ml; 碳源物质，1-4g;氮源物质，0.3-1.0g;余量为水；所述无机盐溶液I是浓度为0. 2-0. 4%的K2HP04溶液；所述无机盐溶液II为含0. 2-0. 4% KH2P04、 0.4-0.8% (NH4)2S04、 0. 4-0. 8% NaCl 、 0.04-0.08% MgS04、 0.04-0.08% CaCl2的水溶液； 所述百分含量均为质量百分含量。
4、 根据权利要求3所述的培养方法，其特征在于所述碳源物质为纤维二糖、 纤维素、麦芽糖、木糖、木聚糖和乳糖中的一种或几种。
5、 根据权利要求3或4所述的培养方法，其特征在于所述氮源物质为半胱氨 酸盐酸盐和铵盐中的一种或几种。
6、 根据权利要求3或4所述的培养方法，其特征在于所述RC培养基中还含 有5—15g的NaHC03。
7、 根据权利要求3或4所述的培养方法，其特征在于所述RC培养基中还含有 0.2—0. 6mg的刃天青。
8、 根据权利要求2或3或4所述的培养方法，其特征在于所述培养温度为35— 41°C。
9、 根据权利要求2或3或4所述的培养方法，其特征在于所述pH为6. 5_7. 5。
10、 权利要求l所述居瘤胃梭菌Hl CGMCC No.2125在降解纤维素类物质中的应用。
全文摘要
本发明公开了一种梭菌及其培养方法与应用。所述梭菌为居瘤胃梭菌，具体为居瘤胃梭菌H1，其保藏号为CGMCCNo.2125。本发明所提供的居瘤胃梭菌H1的培养效率高，含有降解纤维素的复合酶系，包括外切纤维素酶、内切纤维素酶、木聚糖酶、甘露聚糖酶、酯酶、果胶酸酶。与已发现的解纤维梭菌相比，本发明中的居瘤胃梭菌H1除具有分解天然纤维素的能力外，还具有分解其中酯的酯酶活性；与热纤维梭菌相比，居瘤胃梭菌H1中温(39℃)生长，易培养，并具有利用戊糖的能力。本发明中的居瘤胃梭菌H1在纤维素降解工业中将有广阔的应用前景。
文档编号C12N1/20GK101148651SQ20071012145
公开日2008年3月26日 申请日期2007年9月6日 优先权日2007年9月6日
发明者东秀珠, 张科贵, 蔡世淳 申请人:中国科学院微生物研究所