一种基于约氏乳酸杆菌bs15的肉鸡饲料及其制备方法
【专利摘要】本发明公开了一种基于约氏乳酸杆菌BS15的肉鸡饲料及其制备方法，所述基于约氏乳酸杆菌BS15的肉鸡饲料包含1×108?1×109cfu/kg的约氏乳酸杆菌BS15；使用时间是自雏鸡孵化1日龄至肉鸡出栏屠宰；与饲料混合实现对肉鸡的饲喂。本发明解决了抗生素所致药物残留的问题，并且弥补了抗生素禁用以后该领域的空白；可以调节肉鸡肠道，使肉鸡更加健康生长的目标，是一种整合了促生长和预防疾病功能的全新防治方法；用于辅助肉鸡建立起更加健康的消化系统，从而预防肉鸡在亚临床NE发生时的肉质下降。CCTCC No.M201366320131213
【专利说明】
一种基于约氏乳酸杆菌BS15的肉鸡饲料及其制备方法
技术领域
[0001] 本发明属于肉鸡养殖技术领域，尤其涉及一种基于约氏乳酸杆菌BS15的肉鸡饲料 及其制备方法。
【背景技术】
[0002] 坏死性肠炎(Necrotic enteritis，NE)是肉鸡养殖业最值得关注的问题之一，由 产气荚膜梭菌（Clostridium perfringens，简称CP)为主因引起。CP对抗生素敏感，在部分 发达国家因为抗生素作为促生长剂的禁用，NE的发病率日益增加，以美国为例，NE已导致的 经济损失每年达30亿美元，平均每只肉鸡损失0.05美元。此外由A型CP引起的食物中毒病例 数在美、英等国家已居第2位。肉鸡NE分为临床型和亚临床型，均可损伤肠道黏膜，损害肠道 健康。临床型NE主要在鸡2至6周发病，日死亡率可达1 %，总死亡率在10 %到40 %之间。然而 近年来，NE呈现出的亚临床类型受到更高的关注，主要表现为肉鸡长势缓慢及饲料报酬降 低，不会导致鸡的死亡。亚临床NE由于没有明显的临床表现，因此更易在生产过程中导致经 济损失并且加大疾病的防疫难度。欧盟诸国的统计显示，亚临床NE带来的经济损失比典型 症状的NE高出近33 %。亚临床NE的发生将导致鸡肉品质的明显下降，主要体现在鸡肉易丧 失水分、保存时间变短以及包括脂肪酸在内的各种营养物质的水平下降。且由于亚临床NE 无明显病变的特点，导致大量肉质受损的鸡肉被消费者购买和食用。鸡肉作为被食用最多 的肉类之一，是人类重要的多不饱和脂肪酸来源，多不饱和脂肪酸(尤其是EPA和DHA)则是 预防人类心血管系统疾病的重要营养物质。随着中国逐渐进入后抗生素时代，对于亚临床 NE的预防研究也变得十分迫切。从世界范围来看，目前寻找到的抗生素替代物主要包括一 些益生菌、溶菌酶等酶类制剂以及诸如丁酸等有机酸的添加。但是，关于寻找一种有效的抗 生素替代物来改善亚临床NE肉鸡肉质下降的问题，却未见报道。益生菌是预防亚临床NE发 生的手段，同时，有大量报道证明一些益生菌可以在正常饲养肉鸡的过程中改善鸡肉品质。 但是，不仅从未有相关的报道论证益生菌具有改善亚临床NE发病肉鸡鸡肉品质的报道，同 时，目前已有的报道中，所使用益生菌自身的研究并不深入，研究基础缺乏也将导致后续应 用上的局限。约氏乳酸杆菌(LactobaciIlus johnsonii)是一种兼性厌氧的革兰式阳性杆 菌，绝大多数约氏乳酸杆菌被视为益生菌，被用于发酵乳制品等的生产，同时，部分约氏乳 酸杆菌具有降低胆固醇的效果。约氏乳酸杆菌BS15分离自四川省阿坝藏族自治州红原草原 的牧民土制酸奶，前期研究证实其具有良好的预防小鼠非酒精性脂肪肝的效果(发明专利 号：201410156594.5)。在我们进行改善亚临床NE肉鸡肉质的研究过程中，我们发现在饲料 中添加 BS15,可以有效地控制肉鸡肉质下降的情况。考虑到BS15作为一种益生菌，可以被视 为重要的抗生素替代物，同时，在益生菌研究领域中BS15具有良好的研究基础，因此，在后 抗生素时代，利用BSl 5对亚临床NE发病肉鸡的鸡肉品质进行改善，可以弥补这一食品安全 领域的空白。
【发明内容】
[0003] 本发明的目的在于提供一种基于约氏乳酸杆菌BS15的肉鸡饲料及其制备方法，旨 在解决利用BS15对亚临床NE发病肉鸡的鸡肉品质进行改善，弥补食品安全领域的技术空白 和抗生素所致药物残留的问题。
[0004] 本发明是这样实现的，一种基于约氏乳酸杆菌BS15的肉鸡饲料，所述基于约氏乳 酸杆菌BS15的肉鸡饲料I X IO8-I X 109cfu/kg的约氏乳酸杆菌BS15。
[0005] 进一步，所述基于约氏乳酸杆菌BS15的肉鸡饲料使用时间是自雏鸡孵化1日龄至 肉鸡出栏屠宰。
[0006] 进一步，所述基于约氏乳酸杆菌BS15的肉鸡饲料与饲料混合实现对肉鸡的饲喂。
[0007] 本发明的另一目的在于提供一种所述的基于约氏乳酸杆菌BS15的肉鸡饲料的制 备方法，所述制备方法包括以下步骤：
[0008] 步骤一，将从微生物菌种保藏中心保存的约氏乳酸杆菌BS15菌种取出，菌种于25 °C下融化解冻，以接种环接1-2环于改良MRS固体培养基，置于36-37°C生化培养箱恒温培养 12h；
[0009] 步骤二，挑取所得单菌落，无菌操作接种至改良MRS液体培养基，置于36-37Γ生化 培养箱恒温培养12h，得初始菌液；
[0010] 步骤三，将所得菌液以无菌生理盐水进行10倍稀释，取菌液200yL以涂布法接种于 无菌改良MRS固体培养基，静止Imin后，再放置于36-37°C生化培养箱恒温培养12h后，统计 平板上菌落数，并计算出所得菌液中每毫升所含细菌活菌数；
[0011] 步骤四，按照每公斤饲料中I X IO8-IO9Cfu活菌计算，将菌液与相应重量的饲料用 搅拌机混合搅拌均匀，再将混合饲料分装，于避光、干燥、低温环境下储存。
[0012] 进一步，所述MRS固体培养基为：蛋白胨10 · 00g/L，牛肉膏5 · 00g/L，酵母膏4 · OOg/ L，葡萄糖20.00g/L，吐温-80 1.00mL/L，乙酸钠5.00g/L，柠檬酸二铵0.20g，磷酸氢二钾 2.0(^/1硫酸镁0.2(^/^，硫酸锰0.058/^，固体培养基需加琼脂17.0(^，加灭菌水至 1000mL，调节 pH至6 · 2，121 °C 灭菌 20min。
[0013] 进一步，所述计算所得菌液中每毫升所含细菌活菌数公式如下：
[0014] 每毫升原菌液活菌数=AXB X 5
[0015]式中，A:同一稀释度三个以上重复平板菌落数；
[0016] B:稀释倍数。
[0017]本发明提供的基于约氏乳酸杆菌BS15的肉鸡饲料及其制备方法，目的是为改善亚 临床NE肉鸡的鸡肉品质提供一种行之有效的手段，即约氏乳酸杆菌BS15在肉鸡饲料中的添 加，进而解决这一领域食品安全方面的问题。本发明适应了目前逐步禁止饲料中添加抗生 素的必然趋势，解决了抗生素所致药物残留的问题，并且弥补了抗生素禁用以后该领域的 空白；另外，本发明在肉鸡未发生亚临床NE的情况下，依旧可以调节肉鸡肠道，使肉鸡更加 健康生长的目标，是一种整合了促生长和预防疾病功能的全新防治方法。
[0018]本发明涉及约氏乳酸杆菌BS15的全新用途，是将BS15作为一种饲料添加剂，用于 辅助肉鸡建立起更加健康的消化系统，从而预防肉鸡在亚临床NE发生时的肉质下降，使用 方法是将BS15与饲料混合的方式实现对肉鸡的饲喂，使用时间是自雏鸡孵化出壳（1日龄） 至肉鸡出栏屠宰，用量控制在I X IO8-I X 109cfu/kg饲料。一种基于约氏乳酸杆菌BS15的肉 鸡饲料。
[0019] 本发明首先提出预防亚临床NE发病肉鸡的肉质下降问题，并寻找到了目前唯一一 种可以应用于该目标的抗生素替代物；（2)依据肠道微生态理论，BS15可以改善肉鸡肠道内 菌群结构，完善肠道内环境，因此可能具有同时预防多种肠道疾病的功效；（3)BS15的添加 对肉鸡本身不构成任何药物残留问题，并且本身具备护理肠道的功效，保证了食品健康。
【附图说明】
[0020] 图1是本发明实施例提供的基于约氏乳酸杆菌BS15的肉鸡饲料的制备方法流程 图。
【具体实施方式】
[0021] 为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发 明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用 于限定本发明。
[0022] 下面结合附图对本发明的应用原理作详细的描述。
[0023] 本发明实施例的约氏乳酸杆菌BS15 Lactobacillus johnsonii BS15的保藏编号 为CCTCC No.M2013663;保藏单位：中国典型培养物保藏中心，保藏于中国，武汉，武汉大学； 约氏乳酸杆菌BS15的培养物由2013年12月13日起，保藏期限为30年。
[0024]如图1所示，本发明实施例的基于约氏乳酸杆菌BS15的肉鸡饲料的制备方法包括 以下步骤：
[0025] S101:将从微生物菌种保藏中心保存的约氏乳酸杆菌BS15菌种取出，菌种于25°C 下融化解冻，以接种环接1-2环于改良MRS固体培养基(改良MRS培养基配方:蛋白胨10.0 Og/ L，牛肉膏5 · 00g/L，酵母膏4 · 00g/L，葡萄糖20 · 00g/L，吐温-80 1 · 00mL/L，乙酸钠5 · 00g/L， 柠檬酸二铵〇 · 20g，磷酸氢二钾（K2HPO4)2 · 00g/L，硫酸镁(MgS〇4 · 7H20)0 · 20g/L，硫酸锰 (MnS〇4 · 10H20)0.05g/L，固体培养基需加琼脂17.0(^，加灭菌水至100011^，调节?!1至6.2， 121°C灭菌20min)，置于36-37°C生化培养箱恒温培养12h;
[0026] S102:挑取所得单菌落，无菌操作接种至改良MRS液体培养基，置于36-37 °C生化培 养箱恒温培养12h，得初始菌液；
[0027] S103:将所得菌液以无菌生理盐水进行一系列10倍稀释，取各稀释梯度(取10-6、 10 一7和10-8)菌液200yL以涂布法接种于无菌改良MRS固体培养基，静止Imin后，再放置于36-37°C生化培养箱恒温培养12h后，统计平板上菌落数，并计算出2.所得菌液中每毫升所含 细菌活菌数。计算公式如下：
[0028] 每毫升原菌液活菌数=AXB X 5
[0029]式中，A:同一稀释度三个以上重复平板菌落数，
[0030] B:稀释倍数。
[0031] 根据计数结果，将得到的菌液以无菌生理盐水稀释至2 X 108CFU/ml，分装后置于4 °(：冰箱保存备用。
[0032] S104:按照每公斤饲料中I X IO8-IO9Cfu活菌计算，将菌液与相应重量的饲料用搅 拌机(搅拌机需事先清洁干净，保证无霉菌、抗生素等残留）混合搅拌均匀，再将混合饲料分 装，于避光、干燥、低温环境下储存。
[0033] 下面结合具体实施例对本发明的应用效果作详细的描述。
[0034] 本发明实施例中所得到的结果，均基于以下条件完成:将1日龄艾维茵肉鸡雄性健 雏480只随机分为四组:对照组(基础日粮）、亚临床NE组(基础日粮)和两个不同剂量的BS15 预防组(基础日粮+1 X 108cfu/kg及I X 109cfu/kg日粮的BS15菌液拌料）。对亚临床NE组及 BS15预防组建造亚临床NE模型（于15日龄灌喂10倍剂量艾美尔球虫活疫苗;于18-21日龄每 日灌喂A型产气荚膜梭菌一次（1.0 X IO8Cfu CP/mL，ImL/羽）。
[0035]实施例1对鸡肉基础肉质指标的检测(鸡肉比重、肉色、pH值、保水力、嫩度）
[0036] 对鸡进行屠宰后，剥离胸肌和腿肌，计算肌肉比重；取左侧胸肌及腿肌，采用CR-300便携式色差计检测肌肉最厚而规整处的L*值（亮度值）、a*值(红度值）和b*值(黄度 值），每只鸡取三次数据以算术平均数为准;使用PH-STAR便携式pH测试计对同侧胸肌及腿 肌的相同部位进行穿刺检测，每只鸡取三次数据以算术平均数为准，记录胸肌40min及24h 后的pH值;采用测滴水损失的方法测定肌肉保水力，将右侧整块胸大肌剥离，用手术刀沿肌 纤维垂直方向切成一块长5cm、宽3cm、厚2cm的长条肉样，准确称重(Wl)(准确到0.000 Ig)后 用铁丝钩住肉样一端，使肌纤维垂直向下(肌肉的肌纤维方向应与地心吸引力作用方向保 持一致），悬吊在充气的塑料袋中，扎紧袋口，避免肉样与袋壁接触，在4°C条件下贮藏24h， 取出肉样称重(W2)，计算滴水损失，公式为:滴水损失（％ ) = (W1-W2)/W1 X 100% ;利用TA · XT · plus实验分析仪检测嫩度，进行剪切操作，每条预处理好的肌肉切2次，每块胸大肌切3 个长条，计算6次剪切力的算术平均值作为最终参考值。
[0037]结果显示，BS15显著地改善了亚临床NE引起的鸡肉各项基础肉质指标的检测。
[0038] 表1.约氏乳酸杆菌BS15显著改善亚临床NE引起的基础肉质改变
[0041] a'b各行数据上标数字均不相同的差距显著.（P〈〇.05)结果以平均值土标准误差形 式呈现。
[0042]实施例2:对鸡肉货架周期（即抗氧化能力）的检测
[0043] 试验第42d每组随机抽取12只，取左侧胸大肌与腿肌_20°C冷冻保存，取材时保证 部位一致，待动物试验完成后检测相应指标。将肌肉制成10%组织勾浆，使用试剂盒(购自 南京建成生物科技公司)检测肌肉中S0D、GSH-Px、CAT的活力以及MDA的含量。
[0044]表2.约氏乳酸杆菌BS15可以延长亚临床NE肉鸡肌肉的货架周期（提高抗氧化能 力）
[0046] SOD =超氧化物歧化酶;CAT =过氧化氢酶;GSH-Px =谷胱甘肽过氧化物酶;MDA = 丙二醛
[0047] a'b各行数据上标数字均不相同的差距显著.（P〈0.05)结果以平均值土标准误差 形式呈现。
[0048] 结果显示，约氏乳酸杆菌BS15可以延长亚临床NE肉鸡肌肉的货架周期（提高抗氧 化能力）
[0049 ]实施例3:对鸡肉内肌内脂肪、肌苷酸、胆固醇及甘油三酯含量的检测
[0050] 试验第42d每组随机抽取12只，取相同部位胸大肌及腿肌各一块，锡纸包裹后液氮 冻存，后转至_20°C冰箱中保存，并于动物试验结束后采用索氏抽提法提取肌内脂肪;取相 同部位胸大肌及腿肌各一块，锡纸包裹后液氮冻存，后转至-20°C冰箱中保存，并于第42d动 物试验结束后尽快将所有样品制成10%组织匀浆，冷冻送由上海沪峰化工有限公司采用 ELISA试剂盒进行肌苷酸水平的测定;将所采血液析出血清，使用全自动生化分析仪检测胸 肌、腿肌、及肝脏中总胆固醇(TC)及甘油三酯(TG)。
[0051] 结果显示，约氏乳酸杆菌BS15可以显著改善亚临床NE鸡肉中肌内脂肪、肌苷酸、胆 固醇及甘油三酯含量的改变。
[0052]表3.BS15显著改善亚临床NE鸡肉中肌内脂肪、肌苷酸、胆固醇及甘油三酯含量的 改变
[0055] a'b各行数据上标数字均不相同的差距显著.（P〈0.05)结果以平均值土标准误差形 式呈现。
[0056] 实施例4:对鸡肉内脂肪酸组成的检测
[0057]试验第42d每组随机抽取12只，取相同部位胸大肌一块，使用HP6890气象色谱仪对 胸肌内FA组成进行检测，被检测指标包括C14:0、C16:0、C16:ln-7、C18 :0、C18:2n-6、C18: 3n-3、C20: 2n-6、C20: 4n-6、C20: 5n-3、C22: 4n-6、C22: 5n-3、C22: 6n-3、总饱和脂肪酸、总单 不饱和脂肪酸、总多不饱和脂肪酸、n-6多不饱和脂肪酸及n-3多不饱和脂肪酸。
[0058]结果表明，约氏乳酸杆菌BS15可以显著改善亚临床NE鸡肉中脂肪酸含量的改变， 尤其可以有效地控制多不饱和脂肪酸的含量，保证鸡肉营养价值。
[0059]表4.约氏乳酸杆菌BS15显著改善亚临床NE鸡肉中脂肪酸含量的改变（单位:mg/ 100g鸡肉干物质）
[0062] SFA:饱和脂肪酸;MUFA:单不饱和脂肪酸;PUFA:多不饱和脂肪酸
[0063] a，b各行数据上标数字均不相同的差距显著.（Ρ〈0·05)
[0064] 结果以平均值土标准误差形式呈现。
[0065] 以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精 神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
【主权项】
1. 一种基于约氏乳酸杆菌BS15的肉鸡饲料，其特征在于，所述基于约氏乳酸杆菌BS15 的每公斤肉鸡饲料包含I XIO8-I X l〇9cfu/kg的约氏乳酸杆菌BS15。2. 如权利要求1所述的基于约氏乳酸杆菌BS15的肉鸡饲料，其特征在于，所述基于约氏 乳酸杆菌BS15的肉鸡饲料使用时间是自雏鸡孵化1日龄至肉鸡出栏屠宰。3. 如权利要求1所述的基于约氏乳酸杆菌BS15的肉鸡饲料，其特征在于，所述基于约氏 乳酸杆菌BS15的肉鸡饲料与饲料混合实现对肉鸡的饲喂。4. 一种如权利要求1所述的基于约氏乳酸杆菌BS15的肉鸡饲料的制备方法，其特征在 于，所述制备方法包括以下步骤： 步骤一，将从微生物菌种保藏中心保存的约氏乳酸杆菌BS15菌种取出，菌种于25°C下 融化解冻，以接种环接1-2环于改良MRS固体培养基，置于36-37 °C生化培养箱恒温培养12h; 步骤二，挑取所得单菌落，无菌操作接种至改良MRS液体培养基，置于36-37Γ生化培养 箱恒温培养12h，得初始菌液； 步骤三，将所得菌液以无菌生理盐水进行10倍稀释，取菌液200yL以涂布法接种于无菌 改良MRS固体培养基，静止Imin后，再放置于36-37 °C生化培养箱恒温培养12h后，统计平板 上菌落数，并计算出所得菌液中每毫升所含细菌活菌数； 步骤四，按照每公斤饲料中I X IO8-IO9Cfu活菌计算，将菌液与相应重量的饲料用搅拌 机混合搅拌均匀，再将混合饲料分装，于避光、干燥、低温环境下储存。5. 如权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述MRS固体培养基为：蛋白胨10.0 Og/ L，牛肉膏5 · 00g/L，酵母膏4 · 00g/L，葡萄糖20 · 00g/L，吐温-80 1 · 00mL/L，乙酸钠5 · 00g/L， 柠檬酸二铵〇 · 20g，磷酸氢二钾2 · 00g/L，硫酸镁0 · 20g/L，硫酸锰0 · 05g/L，固体培养基需加 琼脂17.00g，加灭菌水至lOOOmL，调节pH至6.2，121°C灭菌20min。6. 如权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述计算所得菌液中每毫升所含细菌活 菌数公式如下： 每毫升原菌液活菌数=A X B X 5 式中，A:同一稀释度三个以上重复平板菌落数； B:稀释倍数。
【文档编号】A23K10/18GK105941975SQ201610344197
【公开日】2016年9月21日
【申请日】2016年5月20日
【发明人】倪学勤, 曾东, 王鹤松, 舒刚, 景波, 周梦佳, 潘康成
【申请人】四川农业大学