抑制产气荚膜梭菌感染的融合蛋白疫苗的制作方法

抑制产气荚膜梭菌感染的融合蛋白疫苗的制作方法
【专利摘要】本发明公开了抑制产气荚膜梭菌感染的融合蛋白疫苗。该疫苗含有a)或b)或c)的蛋白质：a)由SEQ ID No.2的氨基酸序列组成的蛋白质；b)由SEQ ID No.2第51?937位所示的氨基酸序列组成的蛋白质；c)在a)或b)所示的蛋白质的羧基端或/和氨基端融合蛋白标签得到的融合蛋白。该疫苗免疫动物后可使动物产生较高的血清抗体水平，并且可抵抗产气荚膜梭菌的攻击。该疫苗在抵抗A型、B型、C型和D型产气荚膜梭菌攻击时的7天内的免疫保护率为100％、100％、90％和100％。最高抗体效价达1：128000。
【专利说明】
抑制产气芙膜梭菌感染的融合蛋白疫苗
技术领域
[0001] 本发明设及生物技术领域中抑制产气芙膜梭菌感染的融合蛋白疫苗。
【背景技术】
[0002] 产气芙膜梭菌(Clostridium化计ringens)也称魏氏梭菌，是一种重要的人畜共 患病，该病原是创伤性气性坏痘和人类食物中毒W及羊快疫、黑羊频疾、牛羊坏死性肠炎、 牛羊肠毒血症的主要病原之一，对畜牧业造成了巨大的经济损失。产气芙膜梭菌主要的致 病因素是其分泌的外毒素，种类多达13种，其中α、β和ε是最主要的外毒素，根据产生外毒素 的种类不同，可将产气芙膜梭菌分为4、8、(：、0、6运五个血清型。目前产气芙膜梭菌病的免疫 主要通过传统的经过灭活的单价苗、多联苗或者类毒素疫苗而实现，运些传统疫苗虽然能 够诱导动物产生一定的保护性抗体，但是它们存在安全性不高、稳定性差、免疫后副反应大 等缺点，运些缺点大大限制了其应用，研发一种针对多种血清型的基因工程亚单位多价疫 苗因而成为了世界各国研究者的重点研究目标。由于基因工程亚单位多价疫苗含有产生保 护性免疫应答所必需的有效免疫成分，去除了与免疫无关的成分，因而相对于传统疫苗而 言安全性、稳定性更好，同时也消除了传统疫苗成分中的热原与应激原、变应原等反应原， 很好的解决了传统疫苗免疫后动物出现的副反应与炎性刺激反应等问题。
[0003] 宫旭颖等（宫旭颖等.产气芙膜梭菌α-β2-ε毒素融合蛋白在大肠杆菌中的表达及 免疫原性研究.中国预防兽医学报.第37卷第2期2015年2月）利用PCR技术构建了含有α、β和 ε融合基因的重组质粒，并且进行了 α-的-ε融合蛋白的诱导表达，为进一步研制多价基因工 程亚单位苗提供了基因材料，为解决困扰我国畜牧业的动物坏死性肠炎和肠毒血症提供了 一条新的途径。但是该重组质粒表达出的α-β2-ε融合蛋白为包涵体结构，且α-β2-ε融合蛋 白的表达量占菌体总蛋白含量的18.4%。
[0004] 现有技术中对产气芙膜梭菌主要外毒素蛋白的表达与纯化方法相对复杂，表达产 物通常W不溶性的包涵体形式存在，可溶性蛋白表达的报道在国内外非常少。因为包涵体 中的表达产物不具有生物学活性，因而需要进行变性与复性处理。蛋白的变性与复性是一 个极其复杂的过程，不同蛋白的复性条件各异，复性率往往很难提高。运是限制其应用的主 要制约因素。采用可溶性表达方式可很好的克服运一问题。如何构建可溶性表达载体并且 优化可溶性蛋白的高效表达方法，是本领域长期W来一直研究的热点课题。

【发明内容】

[0005] 本发明所要解决的一个技术问题是如何获得抑制产气芙膜梭菌感染的可溶性蛋 白质疫苗。
[0006] 为解决上述技术问题，本发明提供了制备抑制产气芙膜梭菌感染的可溶性蛋白质 疫苗的方法。
[0007] 本发明所提供的制备抗产气芙膜梭菌疫苗的方法，包括使蛋白质的编码基因在生 物中进行表达得到所述蛋白质，利用表达得到的所述蛋白质制备抗产气芙膜梭菌疫苗(将 所述蛋白质作为抗产气芙膜梭菌疫苗的活性成分）；所述蛋白质为a)或b)或c)或d):
[000引a)由SEQ ID No.2的氨基酸序列组成的蛋白质；
[0009] b)由SEQ ID No.2第51-937位所示的氨基酸序列组成的蛋白质；
[0010] C)在a)或b)所示的蛋白质的簇基端或/和氨基端融合蛋白标签得到的融合蛋白；
[0011] d)将SEQ ID No. 2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺 失和/或添加得到的可溶性蛋白质；
[0012] 所述生物为微生物、植物或非人动物。
[0013] 上述方法中，a)的蛋白质名称为a-02-e-Ms，b)的蛋白质名称为a-02-e"SEQ ID No. 2由937个氨基酸残基组成。
[0014] 上述方法中，蛋白标签是指利用DNA体外重组技术，与目的蛋白一起融合表达的一 种多肤或者蛋白，W便于目的蛋白的表达、检测、示踪和/或纯化等。
[0015] 上述方法中，使所述蛋白质的编码基因在生物中进行表达包括将所述的蛋白质的 编码基因导入受体微生物，得到表达所述蛋白质的重组微生物，培养所述重组微生物，表达 得到所述蛋白质。
[0016] 上述方法中，所述受体微生物可为Cl)-C4)中的任一种：
[0017] C1)原核微生物；
[001引 C2)革兰氏阴性细菌；
[0019] C3)埃希氏菌属细菌；
[0020] C4)大肠杆菌化 21(DE3)。
[0021] 上述方法中，所述蛋白质的编码基因为如下1)或2)或3)所示的基因：
[0022] 1)编码序列是SEQ ID No.l所示的DNA分子(编码a-02-e-his);
[0023] 2)编码序列是沈Q ID No. 1的第151-2814位所示的DM分子(编码α-β2-ε);
[0024] 3)与1)或2)限定的DM分子具有90% W上的同一性且编码所述蛋白质的DM分子。
[00巧]其中，SEQ ID No.l由2820个核巧酸组成，其名称为cH32-e-MsY基因，编码氨基酸 序列是沈〇1〇齡.2的蛋白质〇-02-6-山3。沈9 1〇齡.1的第151-2814位所示的〇魁分子是 α-β2-ε-Υ基因，编码由SEQ ID齡.2第51-937位所示的氨基酸序列组成的蛋白质曰-02-6。 [00%] 上述方法中，所述重组微生物为将祀Τ3〇3-α-β2-ε-Υ导入大肠杆菌化2UDE3)得到 的表达氨基酸序列是SEQ ID No.2的蛋白质的重组微生物，所述重组微生物命名为化21 (DE3)/祀T3Oa-a-02-e-Y，所述祀T30a-a-K-e-Y为将载体祀T30a( + )的Ba恤巧日趾〇1位点之 间的序列替换为SEQ ID No. 1第151-2814位(编码α-β2-ε)所示的DNA片段得到的重组载体。
[0027] 上述方法中，所述表达为诱导表达，所述诱导表达是用0.75mM的IPTG在16°C诱导 13-16小时或13-24小时或13小时或16小时。
[0028] 所述蛋白质或与所述蛋白质相关的生物材料在制备抗产气芙膜梭菌疫苗中的应 用也属于本发明的保护范围：
[00巧]所述生物材料为下述B1)至B16)中的任一种：
[0030] B1)编码所述蛋白质的核酸分子；
[0031] B2)含有B1)所述核酸分子的表达盒；
[0032] B3)含有B1)所述核酸分子的重组载体；
[0033] B4)含有B2)所述表达盒的重组载体；
[0034] B5)含有Bl)所述核酸分子的重组微生物；
[0(X3日]B6)含有B2)所述表达盒的重组微生物；
[0036] B7)含有B3)所述重组载体的重组微生物；
[0037] B8)含有B4)所述重组载体的重组微生物；
[0038] B9)含有B1)所述核酸分子的转基因动物细胞系；
[0039] B10)含有B2)所述表达盒的转基因动物细胞系；
[0040] B11)含有B3)所述重组载体的转基因动物细胞系；
[0041 ] B12)含有B4)所述重组载体的转基因动物细胞系；
[0042] B13)含有B1)所述核酸分子的转基因植物细胞系；
[0043] B14)含有B2)所述表达盒的转基因植物细胞系；
[0044] B15)含有B3)所述重组载体的转基因植物细胞系；
[0045] B16)含有B4)所述重组载体的转基因植物细胞系。
[0046] 上述生物材料中，所述核酸分子可为如下1)或2)或3)所示的基因：
[0047] 1)编码序列是SEQ ID No.l所示的DNA分子(编码a-02-e-his);
[004引 2)编码序列是沈Q ID No.l的第151-2814位所示的DNA分子(编码α-β2-ε);
[0049] 3)与1)或2)限定的DM分子具有90% W上的同一性且编码所述蛋白质的DM分子。
[(K)加]上述生物材料中，所述重组载体可为所述祀Τ3〇3-α-β2-ε-Υ;
[0化1] 所述重组微生物可为Ε1)或Ε2):
[0052] Ε1)所述重组微生物为将所述的蛋白质的编码基因导入受体微生物，得到表达所 述蛋白质的重组微生物，所述受体微生物为C1)-C4)中的任一种：
[0化3] C1)原核微生物；
[0054] C2)革兰氏阴性细菌；
[0055] C3)埃希氏菌属细菌；
[0化6] C4)大肠杆菌化21(DE3)。
[0057] E2)所述重组微生物为将所述祀Τ3〇3-α-β2-ε-Υ导入大肠杆菌化2UDE3)得到的表 达氨基酸序列是SEQ ID No.2的蛋白质的重组微生物。
[0化引其中，所述核酸分子可W是DNA，如cDNA、基因组DNA或重组DNA;所述核酸分子也可 W 是 RNA，如 mRNA 或 hnRNA 等。
[0059] 运里使用的术语"同一性"指与天然核酸序列的序列相似性。同一性可W用肉眼或 计算机软件进行评价。使用计算机软件，两个或多个序列之间的同一性可W用百分比（％ ) 表示，其可W用来评价相关序列之间的同一性。
[0060] 上述应用中，所述蛋白质具体可为上述方法表达得到的所述蛋白质。
[0061] 本发明还提供了预防动物产气芙膜梭菌感染的疫苗。
[0062] 本发明所提供的预防动物产气芙膜梭菌感染的疫苗，其含有所述蛋白质或与所述 蛋白质相关的生物材料；
[0063] 上述预防动物产气芙膜梭菌感染的疫苗中，所述蛋白质具体可为上述方法表达得 到的所述蛋白质。
[0064] 本发明中，所述产气芙膜梭菌可为A、B、C、D和E运5种型产气芙膜梭菌中的任5种、 任4种、任3种、任2种或任1种。
[0065] 本发明中，所述抗产气芙膜梭菌疫苗具体可为上述预防动物产气芙膜梭菌感染的 疫苗。
[0066] 在实际应用中，可W将本发明的所述蛋白质或其相关生物材料作为药物直接给予 病人、或者与适宜的载体或赋形剂混合后给予病人，W达到治疗产气芙膜梭菌感染的目的。 运里的载体材料包括但不限于水溶性载体材料(如聚乙二醇、聚乙締化咯烧酬、有机酸等）、 难溶性载体材料(如乙基纤维素、胆固醇硬脂酸醋等）、肠溶性载体材料(如醋酸纤维素献酸 醋和簇甲乙纤维素等）。其中优选的是水溶性载体材料。使用运些材料可W制成多种剂型， 包括但不限于片剂、胶囊、滴丸、气雾剂、丸剂、粉剂、溶液剂、混悬剂、乳剂、颗粒剂、脂质体、 透皮剂、口含片、栓剂、冻干粉针剂等。可W是普通制剂、缓释制剂、控释制剂及各种微粒给 药系统。为了将单位给药剂型制成片剂，可W广泛使用本领域公知的各种载体。关于载体的 例子是，例如稀释剂与吸收剂，如淀粉、糊精、硫酸巧、乳糖、甘露醇、薦糖、氯化钢、葡萄糖、 尿素、碳酸巧、白陶上、微晶纤维素、娃酸侣等;湿润剂与粘合剂，如水、甘油、聚乙二醇、乙 醇、丙醇、淀粉浆、糊精、糖浆、蜂蜜、葡萄糖溶液、阿拉伯胶浆、明胶浆、簇甲基纤维素钢、紫 胶、甲基纤维素、憐酸钟、聚乙締化咯烧酬等；崩解剂，例如干燥淀粉、海藻酸盐、琼脂粉、褐 藻淀粉、碳酸氨钢与构祿酸、碳酸巧、聚氧乙締、山梨糖醇脂肪酸醋、十二烷基横酸钢、甲基 纤维素、乙基纤维素等;崩解抑制剂，例如薦糖、Ξ硬脂酸甘油醋、可可脂、氨化油等;吸收促 进剂，例如季锭盐、十二烷基硫酸钢等；润滑剂，例如滑石粉、二氧化娃、玉米淀粉、硬脂酸 盐、棚酸、液体石蜡、聚乙二醇等。还可W将片剂进一步制成包衣片，例如糖包衣片、薄膜包 衣片、肠溶包衣片，或双层片和多层片。为了将单位给药剂型制成丸剂，可W广泛使用本领 域公知的各种载体。关于载体的例子是，例如稀释剂与吸收剂，如葡萄糖、乳糖、淀粉、可可 月旨、氨化植物油、聚乙締化咯烧酬、Gelucire、高岭±、滑石粉等;粘合剂如阿拉伯胶、黄著 胶、明胶、乙醇、蜂蜜、液糖、米糊或面糊等；崩解剂，如琼脂粉、干燥淀粉、海藻酸盐、十二烧 基横酸钢、甲基纤维素、乙基纤维素等。为了将单位给药剂型制成栓剂，可W广泛使用本领 域公知的各种载体。关于载体的例子是，例如聚乙二醇、卵憐脂、可可脂、高级醇、高级醇的 醋、明胶、半合成甘油醋等。为了将单位给药剂型制成注射用制剂，如溶液剂、乳剂、冻干粉 针剂和混悬剂，可W使用本领域常用的所有稀释剂，例如，水、乙醇、聚乙二醇、1,3-丙二醇、 乙氧基化的异硬脂醇、多氧化的异硬脂醇、聚氧乙締山梨醇脂肪酸醋等。另外，为了制备等 渗注射液，可W向注射用制剂中添加适量的氯化钢、葡萄糖或甘油，此外，还可W添加常规 的助溶剂、缓冲剂、抑调节剂等。此外，如需要，也可W向药物制剂中添加着色剂、防腐剂、香 料、矫味剂、甜味剂或其它材料。使用上述剂型可W经注射给药，包括皮下注射、静脉注射、 肌肉注射和腔内注射等;腔道给药，如经直肠和阴道;呼吸道给药，如经鼻腔;粘膜给药。上 述给药途径优选的是注射给药。
[0067] 本发明将沈Q ID No.l的第151-2814位所示的DNA分子插入pET30a( + )的BamHI和 化〇1位点，得到表达沈0 10齡.2的重组蛋白日-的-6-山3的重组表达载体祀了30日-日-的-6- Y。将重组表达载体祀Τ3〇3-α-β2-ε-Υ导入大肠杆菌化2UDE3)获得了可溶性的目的蛋白α-β 2-e-his。本发明优化了 a-02-e-his的表达条件，进一步提高了 a-02-e-his的表达量，用 〇.75111]\1的1口了6在16°(：诱导13-16小时，日-02-6-山3的含量达到菌体总蛋白的65%，表达的口- i32-e-Ms 92%可溶。a-02-e-MsY免疫动物后可使动物产生较高的血清抗体水平，并且可 抵抗产气芙膜梭菌的攻击。a-K-e-his在抵抗A型产气芙膜梭菌攻击时的7天内的免疫保护 率为100%，PBS对照组小鼠全部死亡;α-β2-ε-Μs在抵抗B型产气芙膜梭菌攻击时的免疫保 护率为l〇〇%，PBS对照组小鼠全部死亡;免疫a-02-e-Ms在抵抗C型产气芙膜梭菌攻击时的 免疫保护率为90%，PBS对照组小鼠全部死亡;a-02-e-Ms在抵抗D型产气芙膜梭菌攻击时 的免疫保护率为100%，而PBS对照组小鼠全部死亡。第Ξ次免疫α-β2-ε-Μ3后7-14天抗体 效价达到峰值，最高抗体效价达1:128000。
【附图说明】
[006引图1为各菌株表达蛋白的SDS-PAGE电泳图谱。
[0069] 图中，Μ为Marker，从上到下分别为 180KD、130KD、95KD、72KD、55KD、43KD、：34KD、 2服D;l、诱导表达的受体菌全菌蛋白液体，2、未诱导表达的化21(DE3)/祀Τ3〇3-α-β2-ε-Υ全 菌蛋白液体，3、诱导表达的化2UDE3)/祀Τ3〇3-α-β2-ε-Υ全菌蛋白液体，4、诱导表达的化21 (DE3 )/pET3Oa-a-02-e-Y含蛋白上清液，5、诱导表达的化21 (DE3)/祀T3Oa-a-02-e-Y含蛋白 沉淀，6、未诱导表达的化21(DE3)/pET3Oa-a-02-e-W全菌蛋白液体，7、诱导表达的化21 (DE3)/pET3Oa-a-02-e-W全菌蛋白液体，8、诱导表达的化21(DE3)/祀T3Oa-a-02-e-W含蛋白 上清液，9、诱导表达的化21(DE3)/pET3Oa-a-02-e-W含蛋白沉淀，10、未诱导表达的化21 (DE3)/祀 T3Oa-pma-02-e-W 全菌蛋白液体，11、诱导表达的化 21(DE3)/祀 T3Oa-pma-02-e-W 全菌蛋白液体，12、诱导表达的化21(DE3)/祀T3Oa-pma-02-e-W含蛋白上清液，13、诱导表达 的化21(DE3)/pET30a-pmα-β2-e-W含蛋白沉淀。
[0070] 图 2 为Western-blot 图谱。
[0071] 图中，1、诱导表达的受体菌全菌蛋白液体，2、未诱导表达的化2UDE3)/祀T30a-a- 的-ε-Υ全菌蛋白液体，3、诱导表达的化21(DE3)/祀Τ3〇3-α-β2-ε-Υ全菌蛋白液体，4、诱导表 达的化21(DE3)/祀T3Oa-a-02-e-Y含蛋白上清液，5、诱导表达的化21(DE3)/祀Τ3〇3-α-β2- ε-Υ含蛋白沉淀，6、未诱导表达的化21(DE3)/祀T3Oa-a-02-e-W全菌蛋白液体，7、诱导表达 的化21(DE3)/祀T3Oa-a-02-e-W全菌蛋白液体，8、诱导表达的化2UDE3)/祀T3Oa-a-02-e-W 含蛋白上清液，9、诱导表达的化21(DE3)/祀T3Oa-a-02-e-W含蛋白沉淀，10、未诱导表达的 化21 (DE3) /祀T3Oa-pma-02-e -W 全菌蛋白液体，11、诱导表达的化21 (DE3) /祀 T3Oa-pma-02- ε-W全菌蛋白液体，12、诱导表达的化21(DE3)/祀T3Oa-pma-02-e-W含蛋白上清液，13、诱导 表达的化21(DE3)/祀T3Oa-pma-02-e-W含蛋白沉淀。
[0072] 图3为重组蛋白a-02-e-his的AKTA纯化鉴定。箭头所指的为纯化的目的蛋白峰。
[0073] 图4为重组蛋白a-02-e-Ms的分子筛纯化鉴定与结构初步判定。箭头所指的为纯 化的目的蛋白峰。
[0074] 图5为纯化的目的蛋白的SDS-PAGE电泳图谱。
[0075] 其中 1 是化 21 (DE3)/祀 T3Oa-a-02-e-Y 含蛋白沉淀；2 是化 21 (DE3)/祀 Τ3〇3-α-β2- ε -Υ全菌蛋白液体;Μ是Marker，从上到下分别为180邸、130邸、95邸、72邸、55邸、43邸、34邸、 26KD; 3是受体菌全菌蛋白液体;4是化21 (DE3) /祀Τ3〇3-α-β2-ε-Υ含蛋白上清液；5是儀柱纯 化目的蛋白样品；6是纯化的cH32-e-his蛋白（分子筛纯化目的蛋白样品）。
[0076] 图6为摸索化2UDE3)/祀Τ3〇3-α-β2-ε-Υ不同诱导溫度与时间点的对比电泳图。箭 头示目的条带。
[0077] 其中 Μ是Marker，从上到下分别为 180KD、130KD、95KD、72KD、55KD、43KD、：34KD、 26KD;1是37°C诱导化后的全菌蛋白液体;2是37°C诱导化的全菌蛋白液体;3是37°C诱导4h 的全菌蛋白液体;4是37°C诱导化的全菌蛋白液体;5是16°C诱导13h的全菌蛋白液体;6是16 °C诱导24h的全菌蛋白液体。箭头示目的条带。
[0078] 图7为化2UDE3)/祀Τ3〇3-α-β2-ε-Υ不同IPTG浓度条件的对比电泳图。箭头示目的 条带。
[0079] 其中Μ是Marker，从上到下分别为180邸、130邸、95邸、72邸、55邸、43邸、34邸、26邸 (扣L); 1是16°C、0.1 mM诱导后的全菌蛋白液体;2是16°C、0.3mM诱导后的全菌蛋白液体;3是 16 °C、0.5 mM诱导后的全菌蛋白液体;4是16 °C、0.7 5 mM诱导后的全菌蛋白液体;5是：16 °C、 ImM诱导后的全菌蛋白液体;6是无诱导剂空白对照。
[0080] 图8为化21 (DE3) /祀T3Oa-a-02-e -Y不同诱导溫度的对比电泳图。
[0081 ] 其中Μ是Marker，从上到下分别为180邸、130邸、95邸、72邸、55邸、43邸、34邸、26邸 (扣L);l是低溫16°C诱导1化后提取的含蛋白上清液;2是低溫16°C诱导1化后提取的含蛋白 上清液。
【具体实施方式】
[0082] 下面结合【具体实施方式】对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐 明本发明，而不是为了限制本发明的范围。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为 常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
[0083] pET30a (+)为No vagen公司产品。pET28a (+)为No vagen公司产品。
[0084] A型产气芙膜梭菌强毒株巧7-10、B型产气芙膜梭菌强毒株巧8-5、C型产气芙膜梭 菌强毒株巧9-4、D型产气芙膜梭菌强毒株C60-11均为中国兽医药品监察所产品。
[0085] 实施例1、可溶性表达a-02-e-his [00化]1、合成基因
[0087] 本申请设计了巧巾融合基因，分别为SEQ ID No.l所示的a-02-e-hisY基因、SEQ ID 齡.3所示的〇-02-6-]113胖基因、56〇1〇齡.4所示的口111〇-02-6-]113胖基因。
[008引 0-02-6-1113￥基因和日-的-6-1113胖基因均编码沈9 10齡.2所示的蛋白质日-的-6- hisepma-02-e-hisW基因编码SEQ ID No.5所示的蛋白质pma-02-e-hisWea-02-e-his是将 pma-02-e-MsW的第52-146位氨基酸残基、464-492位氨基酸残基和743-750位氨基酸残基 缺失得到的蛋白质。
[0089] 用化学合成的方法合成出SEQ ID No.l的第151-2814位所示的α-β2-ε-Υ基因（编 码SEQ ID No.2的第51-937位氨基酸残基所示的蛋白质），SEQ ID No.3的第151-2814位所 示的〇-02-6-胖基因（编码56〇1〇齡.2的第51-937位氨基酸残基所示的蛋白质），56〇1〇 No.4的第151-3210位所示pma-02-e-W基因（编码沈Q ID No.5的第51-1069位氨基酸残基所 示的蛋白质pma-02-e-W)。
[0090] 2、重组表达载体和重组菌的构建
[0091 ] W α - β 2 - ε - Y基因作为模板，利用上游引物F 1 (序列为5 ' - g g a t C C atgttttgggacccggacaccgac-3'）和下游引 物 Rl(序列为5'- CTCGAGTCATTTGATGCCCGGTGCTTTGA-3'）进行 PCR 扩增，在 α-的-ε-Υ 基因的两端加上 BamHI 位 点（带下划线的序列）和化01识别位点（带下划线的序列），得到SEQ ID No. 1的第145-2820 位所示的α-β2-ε-Υ基因 PCR产物。
[0092] Wa-02-e-W基因作为模板，利用上游引物F1和下游引物R2(序列为5'- CTCGAGTCATTTGATACCCGGCGCTTTGA-3'）进行 PCR 扩增，在 α-的-ε-W 基因的两端加上 BamHI 和 化〇1识别位点，得到沈Q ID齡.3的第145-282〇位所示的〇-02-6-胖基因？〇?产物。
[009引 W P m曰-β 2 - ε - W基因作为模板，利用上游引物F 3 (序列为5 ' - ggatccatgaaacgcaaaatctgcaaagcc-3 '）和下游引物R2进行PCR扩增，在pma-02-e-W基因的 两端加上BamHI和化01识别位点，得到沈Q ID齡.4的第145-3216位所示的91110-02-6-胖基因 PCR产物。
[0094] 将上述α-β2-ε-Υ基因 PCR产物用BamHI和趾〇1酶切，回收目的片段（α-β2-ε-Υ基 因）；同时用BamHI和Xhol酶切载体祀T30a( + )，回收载体大片段;将回收的目的片段与回收 的载体大片段连接，得到目的质粒。将目的质粒转化大肠杆菌化21 (DE3)感受态细胞。将其 均匀涂布于含卡那霉素的LB平板上，37Γ培养16小时。单菌落振荡培养过夜，提取质粒用 BamHI和趾〇1进行双酶切鉴定，将酶切验证正确的质粒进行测序，将测序结果表明是用SEQ ID No. 1的第151-2814位所示的α-β2-ε-Υ基因替换祀T30a( + )的BamHI和化〇1识别位点间的 片段，保持pET30( + )的其它序列不变得到的重组表达载体，命名为ρΕΤ3〇3-α-β2-ε-Υ。 pET30a-a-f32-e-Y含有带His标签的a-f32-e-MsY基因，a-f32-e-MsY基因的核巧酸序列是 沈Q ID No.l，编码沈Q ID齡.2所示的蛋白质〇-02-6-山3。将含有祀了3〇曰-〇-02-6-￥的重组 大肠杆菌命名为化21(DE3)/祀Τ3〇3-α-β2-ε-Υ。
[00巧]将上述a-02-e-W基因 PCR产物用BamHI和趾〇1酶切，回收目的片段（a-02-e-W基 因）；同时用BamHI和Xhol酶切载体祀T30a( + )，回收载体大片段;将回收的目的片段与回收 的载体大片段连接，得到目的质粒。将目的质粒转化大肠杆菌化21 (DE3)感受态细胞。将其 均匀涂布于含卡那霉素的LB平板上，37Γ培养16小时。单菌落振荡培养过夜，提取质粒用 BamHI和趾〇1进行双酶切鉴定，将酶切验证正确的质粒进行测序，将测序结果表明是用SEQ ID齡.3的第151-2814位所示的〇-02-6-胖基因替换祀了3〇曰(+ )的8曰恤1和化〇1识别位点间的 片段，保持pET30a( + )的其它序列不变得到的重组表达载体，命名为pET3Oa-a-02-e-W。 pET30a-a-的-e-W含有Hi S标签融合蛋白α-β2-Ε -hi sW基因，α-β2-Ε -Μ sW基因的核巧酸序列 是沈9 1〇齡.3，编码沈9 1〇齡.2所示的蛋白质〇-02-6-山3。将含有祀了3〇曰-〇-02-6-胖的重 组大肠杆菌命名为化21(DE3)/祀T3Oa-a-02-e-W。
[0096] 将上述pma-02-e-W基因 PCR产物用BamH巧日趾〇1酶切，回收目的片段(pma-02-e-W 基因）；同时用BamHI和化〇1酶切载体pET30a( + )，回收载体大片段;将回收的目的片段与回 收的载体大片段连接，得到目的质粒。将目的质粒转化大肠杆菌化21邮3)感受态细胞。将 其均匀涂布于含卡那霉素的LB平板上，37Γ培养16小时。单菌落振荡培养过夜，提取质粒用 BamHI和趾〇1进行双酶切鉴定，将酶切验证正确的质粒进行测序，将测序结果表明是用SEQ ID No.4的第151-3210位所示的pmα-β2-ε-W基因替换祀T30a( + )的BamH巧肋hoI识别位点间 的片段，保持祀Τ30( + )的其它序列不变得到的重组表达载体，命名为祀T3Oa-pma-02-e-W。 pET3Oa-pma-02-e-W 含有带 His 标签的 pma-02-e-hisW 基因，pma-02-e-hisW 基因的核巧酸序 列是沈9 1〇齡.4，编码沈9 1〇齡.5所示的蛋白质口111日-02-6-山3胖。将含有祀了3〇日-口111日-的- ε-W的重组大肠杆菌命名为化21(DE3)/祀T3Oa-pma-02-e-W。
[0097] 3、蛋白表达形式的分析与鉴定
[009 引 将化 21(DE3)/pET3Oa-a-02-e-Y、化21(DE3)/pET3Oa-a-02-e-W、^21(DE3)/ pET3Oa-pma-02-e-W和大肠杆菌化21(DE3)(简称受体菌)运四个菌株分别单独接种于含50μ g/ml卡那霉素的LB液体培养基(在LB液体培养基中加入卡那霉素至卡那霉素的浓度为50μ g/ml得到的培养基）中，37°C，采用化ermo MaxQ6000型全溫振荡器20化pm振荡培养至OD600 值（W含50μg/ml卡那霉素的LB液体培养基为空白对照)达到0.6时，取出1 mL菌液作为未诱 导表达的菌液(对照），其余液体中加入异丙基硫代-β-D-半乳糖巧（IPTG)进行诱导表达。上 述四株菌的诱导表达均是用0.75mM的IPTG在16°C诱导13小时。
[0099] 取未诱导表达的菌液和诱导表达菌液用于蛋白表达形式分析。具体步骤为，取Im L菌液置于1.5m L离屯、管中，做好标记，4°C条件下8000巧m/min离屯、30min，弃掉上清液，收 集菌体沉淀。加入Im L PBS重悬沉淀，800化pm/min离屯、5min，弃掉上清液。向洗涂好的菌体 沉淀中加入20化L PBS，高压破碎菌体，裂解至菌液不再粘稠，得到全菌蛋白液体。将全菌蛋 白液体于4 °C离屯、机中1600化pm/min离屯、30min，分别收集上清液(命名为含蛋白上清液)和 沉淀(命名为含蛋白沉淀），向含蛋白沉淀中加入50化PBS重悬洗涂沉淀。向全菌蛋白液体、 含蛋白上清液和含蛋白沉淀中加入10化5 XSDS-PAGE loading Buffer,充分混匀后，置沸 水浴中煮沸5min，待样品冷却后，用掌式离屯、机瞬离。取化L用于SDS-PAGE电泳分析，并且结 合蛋白灰度分析软件初步分析蛋白含量。将电泳后的凝胶转印于NC膜，W抗化S标签的羊抗 鼠抗体为结合抗体DAB显色，进行Western-blot鉴定。将上述全菌蛋白液体和含蛋白上清液 用0.22皿滤膜过滤后上样至预先用溶液1(溶质及其浓度如下：20mM化is、150mM化C1，溶 剂是水，P册.0的溶液)平衡好的儀柱。将儀柱接入AKTA机器上，分别用10个柱体积的溶液1 与10个柱体积的溶液2(溶质及其浓度如下：20mM化is、150mM化Cl、50mM咪挫，溶剂是水， P册.0的溶液)清洗儀柱中的杂质蛋白，并在AKTA机器上监测蛋白峰。用溶液3(溶质及其浓 度如下：20mM Tris、150mM化C1、300mM咪挫，溶剂是水，P册.0的溶液)冲洗儀柱挂在儀柱上 的目的蛋白，并使用AKTA收集出现目的蛋白峰的洗脱样品，将该样品称为儀柱纯化目的蛋 白样品。
[0100] 将儀柱纯化的目的蛋白样品用GE公司生产的Superdex200凝胶柱通过分子筛进一 步纯化。流动相使用溶液1。通过分子筛纯化后可W除去样品中的含有的大量咪挫，收集洗 脱峰，得到分子筛纯化的目的蛋白样品，使用化no化OP2000超微量分光光度计(ND2000)对 得到的分子筛纯化的目的蛋白样品中蛋白（即可溶性目的蛋白）的含量进行定量分析。并用 Nano化OP2000超微量分光光度计(ND2000)测定全菌蛋白液体中的蛋白质含量，得到菌体总 蛋白含量。将含蛋白沉淀用尿素溶解后，用化no化OP2000超微量分光光度计(ND2000)测定 含蛋白沉淀中的蛋白质的含量。
[0101] 结果表明诱导表达的化2UDE3)/祀Τ3〇3-α-β2-ε-Υ的全菌蛋白液体、含蛋白上清 液和含蛋白沉淀中均含有大小为10化D的目的蛋白a-02-e-his，未诱导表达的化2UDE3)/ 祀Τ3〇3-α-β2-ε-Υ的全菌蛋白液体中不含有大小为105kD的目的蛋白a-02-e-his;诱导表达 的化2UDE3)/祀Τ3〇3-α-β2-ε-Υ的全菌蛋白液体中的目的蛋白a-02-e-his占菌体总蛋白 (全菌总蛋白）的65%，诱导表达的化21(DE3)/pET3Oa-a-02-e-Y的含蛋白上清液中的目的 蛋白a-02-e-his占诱导表达的化2UDE3)/祀T30a-a-i32-e-Y的全菌蛋白液体中目的蛋白α- f32-e-his的92%，该92%的目的蛋白a-02-e-his为可溶性蛋白；诱导表达的化21(DE3)/ ρΕΤ3〇3-α-β2-ε-Υ的含蛋白沉淀中的目的蛋白a-02-e-his占诱导表达的化21(DE3)/ 祀Τ3〇3-α-β2-ε-Υ的全菌蛋白液体中目的蛋白a-02-e-his的8%，该8%的目的蛋白α-β2-ε- his为不溶性包涵体蛋白；说明诱导表达的化21(DE3)/祀Τ3〇3-α-β2-ε-Υ的目的蛋白α-β2- ε-Ms占菌体总蛋白的65%，BL21(DE3)/pET3Oa-a-02-e-Y表达的目的蛋白a-02-e-his中 92%为可溶性蛋白，8%为不溶性包涵体蛋白。诱导表达的化21 (DE3)/祀T3Oa-a-02-e-W的 全菌蛋白液体、含蛋白上清液和含蛋白沉淀中均含有大小为10化D的目的蛋白a-02-e-his， 未诱导表达的化21(DE3)/祀T3Oa-a-02-e-W的全菌蛋白液体中不含有大小为10化D的目的 蛋白a-02-e-his;诱导表达的化2UDE3)/祀T3Oa-a-02-e-W的全菌蛋白液体中的目的蛋白 a-02-e-Ms占菌体总蛋白的65%，诱导表达的化2UDE3)/祀T3Oa-a-02-e-W的含蛋白上清 液中的目的蛋白曰-02-e-his占诱导表达的化2UDE3)/祀T3Oa-a-02-e-W的全菌蛋白液体中 目的蛋白日-的-e-his的8%，该8%的目的蛋白a-02-e-his为可溶性蛋白；诱导表达的化21 (DE3)/祀T3Oa-a-02-e-W的含蛋白沉淀中的目的蛋白a-02-e-his占诱导表达的化2UDE3)/ 祀T3Oa-a-02-e-W的全菌蛋白液体中目的蛋白a-02-e-his的92%，该92%的目的蛋白α-β2- ε-Ms为不溶性包涵体蛋白；说明诱导表达的化21(DE3)/祀T3Oa-a-02-e-W的目的蛋白α-β 2-e-Ms占菌体总蛋白的65%，BL21(DE3)/pET3Oa-a-02-e-W表达的目的蛋白a-02-e-his中 8%为可溶性蛋白，92%为不溶性包涵体蛋白。未诱导表达的化2UDE3)/祀T3Oa-pma-02-e- W的全菌蛋白液体和诱导表达的化2UDE3)/祀T3Oa-pma-02-e-W的全菌蛋白液体、含蛋白上 清液和含蛋白沉淀中均不含有大小为120KD的目的蛋白pma-02-e-Ms;说明化2UDE3)/ pET3Oa-pma-02-e-W没有表达目的蛋白ρπια-β2-ε-hiS。诱导表达的大肠杆菌化21 (DE3)的全 菌蛋白液体不含有大小为105kD的目的蛋白a-02-e-Ms;说明大肠杆菌化2UDE3)没有表达 目的蛋白日-的-e-Ms。菌落形成单位（CFU)数量相同的诱导表达的化2UDE3)/祀T30a-a-e 2-ε-Υ和诱导表达的化21 (DE3)/祀T3Oa-a-02-e-W表达的菌体总蛋白质量相同（图1和图2)。
[0102] 4、a-02-e-his 的纯化
[0103] 将化2UDE3)/祀Τ3〇3-α-β2-ε-Υ接种于含50μg/ml卡那霉素的LB液体培养基（在LB 液体培养基中加入卡那霉素至卡那霉素的浓度为50μg/ml得到的培养基）中，37°C，采用 Thermo MaxQ6000型全溫振荡器200rpm振荡培养至0D6日日值（W含50μg/ml卡那霉素的LB液体 培养基为空白对照)达到0.6时，加入IPTG进行诱导表达。该诱导表达用0.75mM的IPTG在16 °C诱导13h。取IPTG诱导表达13h后的菌液收集菌体沉淀。加入PBS重悬沉淀，80(K)rpm/min离 屯、5min，弃掉上清液。向洗涂好的菌体沉淀中加入PBS，高压破碎菌体，裂解至菌液不再粘 稠，于4°C离屯、机中1600化pm/min离屯、30min，收集上清液(命名为含蛋白上清液），弃沉淀。 将含蛋白上清液用〇.22μπι滤膜过滤后上样至预先用溶液1(溶质及其浓度如下：20mM Tris、 150mM化Cl，溶剂是水，p册.0的溶液)平衡好的儀柱。将儀柱接入AKTA机器上，分别用10个 柱体积的溶液1与10个柱体积的溶液2(溶质及其浓度如下：20mM化is、150mM NaCl、50mM咪 挫，溶剂是水，P册.0的溶液)清洗儀柱中的杂质蛋白，并在AKTA机器上监测蛋白峰。用溶液3 (溶质及其浓度如下：20mM化is、150mM化Cl、300mM咪挫，溶剂是水，P册.0的溶液)冲洗儀 柱挂在儀柱上的目的蛋白，并使用AKTA收集出现目的蛋白峰的洗脱样品，将该样品称为儀 柱纯化的a-K-e-his蛋白（儀柱纯化目的蛋白样品）（图3)。
[0104] 将儀柱纯化的a-i32-e-his蛋白用GE公司生产的Superdex200凝胶柱通过分子筛进 一步纯化。流动相使用溶液1。通过分子筛纯化后可W除去样品中的含有的大量咪挫，α-的- ε-Ms蛋白的结构为单体与二聚体共存结构。收集单体与二聚体结构的洗脱峰，得到分子筛 纯化的a-02-e-his蛋白（分子筛纯化目的蛋白样品），使用化no化op2000超微量分光光度计 (ND2000)对得到的蛋白的纯度进行定量分析。
[0105] 将分子筛纯化的α-β2-ε-Μ3蛋白进行质谱分析其氨基酸序列，结果表明α-β2-ε- 1113的氨基酸序列如56〇10齡.2所示。
[0106] 将化21(DE3)/祀Τ3〇3-α-β2-ε-Υ和大肠杆菌化21(DE3)(简称受体菌）运两个菌株 分别单独接种于含50μg/ml卡那霉素的LB液体培养基(在LB液体培养基中加入卡那霉素至 卡那霉素的浓度为50μg/ml得到的培养基）中，37°C，采用化ermo MaxQ6000型全溫振荡器 200巧m振荡培养至0D6日日值（W含50μg/ml卡那霉素的LB液体培养基为空白对照)达到0.6时， 加入异丙基硫代-0-D-半乳糖巧（IPTG)进行诱导表达。上述两株菌的诱导表达均是用 0.75mM的IPTG在16 °C诱导13小时。
[0107] 取IPTG诱导表达13h后的菌液用于蛋白表达形式分析。具体步骤为，取Im L诱导后 的重组菌液置于1.5m L离屯、管中，做好标记，4°C条件下8000巧m/min离屯、30min，弃掉上清 液，收集菌体沉淀。加入Im L PBS重悬沉淀，800化pm/min离屯、5min，弃掉上清液。向洗涂好 的菌体沉淀中加入20化1 PBS，高压破碎菌体，裂解至菌液不再粘稠，得到全菌蛋白液体。将 全菌蛋白液体于4 °C离屯、机中1600化pm/min离屯、30min，分别收集上清液(命名为含蛋白上 清液)和沉淀(命名为含蛋白沉淀），向含蛋白沉淀中加入50化PBS重悬洗涂沉淀。向全菌蛋 白液体、含蛋白上清液和含蛋白沉淀中加入10化5 XSDS-PAGE loading Buffer,充分混匀 后，置沸水浴中煮沸5min，待样品冷却后，用掌式离屯、机瞬离。取6化用于SDS-PAGE电泳分 析。同时将上述儀柱纯化目的蛋白样品和上述纯化的曰-的-ε-Ms蛋白（分子筛纯化目的蛋 白样品)进行SDS-PAGE电泳分析。
[0108] 结果表明化2UDE3)/祀Τ3〇3-α-β2-ε-Υ表达的目的蛋白a-02-e-MsW可溶性的形 式存在于细菌破碎菌体的上清液中，可溶性蛋白目的条带表达明显，上清液中杂质较少。通 过对AKTA机器纯化洗脱条件的优化，可W得到纯度更好的可溶性目的蛋白条带，进一步通 过分子筛的纯化后，可W除去蛋白样品中的含有的大量咪挫（图5)，并且首次发现了该融合 重组蛋白的结构为单体与二聚体共存结构。通过分子筛的纯化后的可溶性蛋白可W作为诊 断抗原、制备成单克隆抗体或进一步对蛋白功能与构象关系进行研究。
[0109] 另外，按照上述方法，将祀T28a( + )的限制性内切酶化el和Notl位点之间的序列替 换为SEQ ID No.l第151-2814位所示的α-β2-ε-Υ基因，保持祀T28a( + )的其它序列不变，得 到含有α-β2-ε-Υ基因的重组表达载体，将该重组表达载体命名为pET28a-a-02-e-Y。将 祀T28a-a-02-e-Y转入大肠杆菌化2UDE3)感受态细胞，将得到的重组大肠杆菌命名为化21 (DE3)/祀 T28a-a-02-e-Y。将化 21(DE3)/祀 T28a-a-02-e-Y 接种于含 50μg/ml 卡那霉素的 LB 液体培养基(在LB液体培养基中加入卡那霉素至卡那霉素的浓度为50μg/ml得到的培养基） 中，37°C，采用Thermo MaxQ6000型全溫振荡器200巧m振荡培养至ODsqq值（W含50μg/ml卡那 霉素的LB液体培养基为空白对照）达到0.6时，取出1 mL菌液作为未诱导表达的菌液（对 照），其余液体中加入异丙基硫代-β-D-半乳糖巧（IPTG)进行诱导表达。该诱导表达是用 0.75mM的IPTG在16 °C诱导13小时。取诱导表达的菌液和未诱导表达的菌液按照上述方法进 行蛋白表达形式分析。结果表明，未诱导表达的化2UDE3)/祀T28a-a-02-e-Y全菌蛋白液 体、诱导表达的化21(〇63)/96了28曰-〇-02-6-￥全菌蛋白液体、诱导表达的化21(〇63)/ pET28a-a-02-e-Y含蛋白上清液和诱导表达的化2UDE3)/祀T28a-a-02-e-Y含蛋白沉淀中 均没有目的蛋白的表达。可见，虽然采用同一种外源目的基因（α-β2-ε-Υ基因），在不同的 BL2UDE3)表达载体-pET28a( + )和祀T30a( + )中，外源目的基因的表达情况相差很大，将α-β 2-ε-Υ基因通过pET30a( + )导入大肠杆菌化21(DE3)可获得α-β2-ε-Υ基因的高效可溶性表 达，将α-β2-ε-Υ基因通过祀T28a( + )导入大肠杆菌化2UDE3)中，α-β2-ε-Υ基因却没有表达。
[0110] 实施例2、α-β2-ε -hi S的动物免疫保护性试验
[0111] 1、抗产气芙膜梭菌疫苗的制备
[0112] 将实施例1中分子筛纯化的a-02-e-his蛋白用无菌PBS溶解，得到cH32-e-Ms浓度 为lOOOyg/mL的a-02-e-Ms溶液，用于免疫。将a-02-e-Ms溶液与弗氏佐剂按1:1等体积混 合，乳化制备油乳剂疫苗，将其命名为首免疫苗。将a-e2-e-his溶液与不完全弗氏佐剂按1: 1等体积混合，乳化制备油乳剂疫苗，将其命名为二免疫苗。
[0113] 取出从中国兽医药品监察所购买到的A型产气芙膜梭菌强毒株巧7-10、B型产气芙 膜梭菌强毒株巧8-5、C型产气芙膜梭菌强毒株巧9-4、D型产气芙膜梭菌强毒株C60-11。在超 净工作台中，用75%酒精棉球仔细擦拭保存菌种的安飯瓶外壁，然后用砂轮在安瓶的上Ξ 分之一处做一划痕，再用干燥的无菌纱布包裹安瓶将其斑开。吸取4(Κ)化厌氧肉肝汤液体培 养基反复吹打安瓶中的菌种，使冻干菌种溶解菌悬液。按照1:100的比例将菌悬液接种到含 有牛肉膏的厌氧肉肝汤的试管中，并在试管上层加盖l-2cm的液体石蜡隔绝空气。将接好菌 的试管放入厌氧培养箱，置37Γ恒溫培养箱中，培养16-24h后，观察细菌的生长情况。复苏 后的菌种经过涂片、染色、镜检，确认无误后传1-2代后使用，并将一部分菌种用30%的甘油 盐水-80°C冰箱保存。
[0114] 2、A型产气芙膜梭菌攻毒试验
[0115] 按照如下方法测试a-02-e-his对A型产气芙膜梭菌强毒株巧7-10的抗性试验：
[0116] 将30只体重在18-22g的雌性昆明小鼠，随机分成2组(攻毒剂量组20只，并设10只 小鼠的PBS对照组）。攻毒剂量组，首次免疫、第二次免疫与第Ξ次免疫均采用皮下注射的方 法进行免疫，首次免疫用首免疫苗，第二次免疫与第Ξ次免疫用二免疫苗，每次免疫剂量均 为0.2mL/只（a-02-e-Ms免疫剂量为l(K)yg/只）；PBS对照组中的每只小鼠首次免疫、第二次 免疫与第Ξ次免疫，皮下注射0.2mL PBS。首次免疫之前，先对小鼠进行一次割尾采血，分离 血清，用作阴性对照血清。首次免疫后，间隔14d进行第二次免疫，二免后14d进行第Ξ次免 疫。第Ξ次免疫两周后每只攻毒剂量组小鼠和每只PBS对照组小鼠腹腔注射1.5 X 109c化的 A型产气芙膜梭菌强毒株巧7-10进行攻毒试验。自一免后开始，每组小鼠每周采血一次，每 组采5只，分离血清，于-80°C冰箱保存，用于检测抗体。采用间接化ISA检测免疫动物抗体水 平，具体方法如下：
[0117] 1)包被:将实施例1中分子筛纯化的a-02-e-his蛋白用0.05mol/L P Η 9.0的碳酸 盐包被缓冲液进行稀释，然后按10化L/孔逐一加入化ISA板中，将加好的化ISA板置4°C冰箱 中过夜；
[0118] 2)洗涂:从4°C冰箱中取出化ISA板，弃去板孔内的液体，并在滤纸上拍干，向每孔 加入20化L PBST置于洗板机中进行洗版，重复4次。
[0119] 3)封闭：向ELISA板的每个孔中加入100化含有5%脱脂乳的PBST溶液，放入37°C溫 箱解育化；
[0120] 4)洗涂：向每孔加入20化L PBST置于洗板机中进行洗版，重复4次；
[0121] 5)加待检血清:将待检血清按比例用灭菌PBS进行稀释，每孔加10化L，同时设阴性 对照、阳性对照和空白对照孔，放入37°C溫箱解育化；
[0122] 6)洗涂：向每孔加入20化L PBST置于洗板机中进行洗版，重复4次；
[0123] 7)酶标二抗结合:将HRP标记的羊抗鼠二抗用含有5%脱脂乳的PBS封闭缓冲液按 1:20 000-1:40000浓度稀释后，分别向每孔加入l(K)yL，放入37°C溫箱解育化；
[0124] 8)洗涂：向每孔加入20化L PBST置于洗板机中进行洗板，重复4次；
[0125] 9)显色反应:将新鲜配制的TMB显色液按10化L/孔加入到化ISA板的各个孔中，放 入37°C溫箱避光显色15min;
[01%] 10)终止反应：向按照50化/孔加入2mol/L的浓出S〇4终止液，放入37°C溫箱反应 5min，终止显色；
[0127] 11)读数:将终止显色的ELISA板放酶标仪中检测OD450的值。
[0128] 12)判定检测结果：用确定好的阴阳性临界值来判定检测结果。阳性临界值=阴性 样本的OD450平均值+3S(S为标准方差）。待检血清的效价为待检血清的00值> 阳性临界值时 所对应的血清稀释度。
[0129] 3、B型产气芙膜梭菌攻毒试验
[0130] 除了将A型产气芙膜梭菌强毒株巧7-10替换为B型产气芙膜梭菌强毒株巧8-5,攻 毒剂量调整为2 X 109c化外，其它操作完全相同。
[0131] 4、C型产气芙膜梭菌攻毒试验
[0132] 除了将A型产气芙膜梭菌强毒株巧7-10替换为C型产气芙膜梭菌强毒株巧9-4,攻 毒剂量调整为1.5 X 108c化外，其它操作完全相同。
[0133] 5、D型产气芙膜梭菌攻毒试验
[0134] 除了将A型产气芙膜梭菌强毒株巧7-10替换为D型产气芙膜梭菌强毒株C60-11，攻 毒剂量调整为1.8 X 109c化外，其它操作完全相同。
[0135] 攻毒剂量组和PBS对照组实验小鼠在Ξ免二周后，分别使用各型产气芙膜梭菌 1MLD 100的剂量对小鼠进行攻毒，并于一周内观察和记录小鼠发病死亡情况。攻毒结果表 明，攻毒剂量组(免疫a-02-e-his)对各型产气芙膜梭菌的攻击均具有一定的免疫保护效 果。攻毒剂量组(免疫α-02-ε-Μ S)在抵抗A型产气芙膜梭菌攻击时的7天内的免疫保护率为 1〇〇%(2〇只全部存活），？85对照组小鼠全部死亡;攻毒剂量组(免疫〇-02-6-山3)在抵抗8型 产气芙膜梭菌攻击时的免疫保护率为100% (20只全部存活），PBS对照组小鼠全部死亡;攻 毒剂量组(免疫a-02-e-Ms)在抵抗C型产气芙膜梭菌攻击时的免疫保护率为90% (18只存 活，2只死亡），PBS对照组小鼠全部死亡;攻毒剂量组(免疫a-02-e-his)在抵抗D型产气芙膜 梭菌攻击时的免疫保护率为100% (20只全部存活），而PBS对照组小鼠全部死亡。将纯化后 的曰-02-e-his作为诊断抗原包被酶标板检测检测小鼠免疫抗原或者攻毒后的血清抗体，发 现曰-02-e-his作为诊断抗原建立的检测方法均具有非常好的灵敏性与特异性。分别检测各 实验组中小鼠初免后0-6周的血清中抗体效价水平，结果表明a-02-e-Ms融合毒素蛋白免 疫组抗体效价有明显升高，在二免后抗体效价快速上升，Ξ免后7-14天抗体效价达到峰值， 最高抗体效价达1:128000。
[0136] 实施例3、a-02-e-his诱导表达条件的优化
[0137] 1、诱导溫度和时间的优化
[0138] 将化2UDE3)/祀Τ3〇3-α-β2-ε-Υ接种于含50μg/ml卡那霉素的LB液体培养基（在LB 液体培养基中加入卡那霉素至卡那霉素的浓度为50μg/ml得到的培养基）中，37°C，采用 Thermo MaxQ6000型全溫振荡器200rpm振荡培养至0D6日日值（W含50μg/ml卡那霉素的LB液体 培养基为空白对照)达到0.6时，加入异丙基硫代-β-D-半乳糖巧（IPTG)分别进行下述6种诱 导表达。第一种诱导表达是用〇.75mM的IPTG在37°C诱导1小时。第二种诱导表达是用0.75mM 的IPTG在37°C诱导2小时。第Ξ种诱导表达是用0.75mM的IPTG在37°C诱导4小时。第四种诱 导表达是用〇.75mM的IPTG在37°C诱导5小时。第五种诱导表达是用0.75mM的IPTG在16°C诱 导13小时。第六种诱导表达是用0.75mM的IPTG在16°C诱导24小时。
[0139] 取Im L诱导后的重组菌液置于1.5m L离屯、管中，做好标记，4°C条件下8000巧m/ min离屯、30min，弃掉上清液，收集菌体沉淀。加入Im L PBS重悬沉淀，8000rpm/min离屯、 5min，弃掉上清液。向洗涂好的菌体沉淀中加入20化1 PBS，高压破碎菌体，裂解至菌液不再 粘稠，得到全菌蛋白液体。向全菌蛋白液体中加入10化5XSDS-PAGE loading Buffer,充 分混匀后，置沸水浴中煮沸5min，待样品冷却后，用掌式离屯、机瞬离。取化L用于SDS-PAGE电 泳分析。结果表明化2UDE3)/祀Τ3〇3-α-β2-ε-Υ在诱导溫度为37°C，诱导时间在l-4h的条件 下，α-02-ε-his蛋白表达量随时间延长逐渐上升，化诱导条件下蛋白表达量有所下降。但是 随着诱导溫度的降低，a-02-e-his表达量也有所增加，当诱导溫度降低至16°C，时间为诱导 1化时，a-02-e-Ms表达量达到最高，目的蛋白a-02-e-Ms占全菌总蛋白的65%。继续培养 至2地，α-β2-ε-hiS的表达量略有下降，因此，通过实验验证化21 (DE3)/祀Τ3〇3-α-β2-ε-Y的 最佳诱导溫度为16°C，诱导时间为13-24h(图6)。
[0140] 2、IPTG浓度的优化
[0141] 将化2UDE3)/祀Τ3〇3-α-β2-ε-Υ接种于含50μg/ml卡那霉素的LB液体培养基（在LB 液体培养基中加入卡那霉素至卡那霉素的浓度为50μg/ml得到的培养基）中，37°C，采用 Thermo MaxQ6000型全溫振荡器200rpm振荡培养至0D6日日值（W含50μg/ml卡那霉素的LB液体 培养基为空白对照)达到0.6时，加入异丙基硫代-β-D-半乳糖巧（IPTG)分别进行下述6种诱 导表达。第一种诱导表达是用O.lmM的IPTG在16°C诱导13小时。第二种诱导表达是用0.3mM 的IPTG在16 °C诱导13小时。第Ξ种诱导表达是用0.5mM的IPTG在16 °C诱导13小时。第四种诱 导表达是用〇.75mM的IPTG在16°C诱导13小时。第五种诱导表达是用ImM的IPTG在16°C诱导 13小时。第六种诱导表达是用OmM的IPTG在16 °C诱导13小时。
[0142] 取Im L诱导后的重组菌液置于1.5m L离屯、管中，做好标记，4°C条件下8000巧m/ min离屯、30min，弃掉上清液，收集菌体沉淀。加入Im L PBS重悬沉淀，8000rpm/min离屯、 5min，弃掉上清液。向洗涂好的菌体沉淀中加入20化1 PBS，高压破碎菌体，裂解至菌液不再 粘稠，得到全菌蛋白液体。将全菌蛋白液体于4 °C离屯、机中1600化pm/min离屯、30min，收集上 清液(命名为含蛋白上清液），向含蛋白上清液中加入10化5XSDS-PAGE loading Buffer, 充分混匀后，置沸水浴中煮沸5min，待样品冷却后，用掌式离屯、机瞬离。取化L用于SDS-PAGE 电泳分析。结果表明a-f32-e-Ms在不同浓度的IPTG诱导下，表达量也有所不同。a-02-e-his 表达量与加入IPTG浓度在0.1-0.75mM之间呈递增关系。当IPTG诱导浓度为ImM时，蛋白表达 量有所减少，运可能与IPTG本身的毒性有关。因此选择IPTG浓度0.75mM为最佳诱导浓度(图 7)。
[0143] 3、诱导时间的优化
[0144] 将化2UDE3)/祀Τ3〇3-α-β2-ε-Υ接种于含50μg/ml卡那霉素的LB液体培养基（在LB 液体培养基中加入卡那霉素至卡那霉素的浓度为50μg/ml得到的培养基）中，37°C，采用 Thermo MaxQ6000型全溫振荡器200rpm振荡培养至0D6日日值（W含50μg/ml卡那霉素的LB液体 培养基为空白对照)达到0.6时，加入异丙基硫代-β-D-半乳糖巧（IPTG)分别进行下述巧中诱 导表达。第一种诱导表达是用〇.75mM的IPTG在16°C诱导13小时。第二种诱导表达是用 0.75mM的IPTG在16 °C诱导16小时。
[0145] 取Im L诱导后的重组菌液置于1.5m L离屯、管中，做好标记，4°C条件下8000巧m/ min离屯、30min，弃掉上清液，收集菌体沉淀。加入Im L PBS重悬沉淀，8000rpm/min离屯、 5min，弃掉上清液。向洗涂好的菌体沉淀中加入20化1 PBS，高压破碎菌体，裂解至菌液不再 粘稠，得到全菌蛋白液体。
[0146] 向全菌蛋白液体中加入10化5 XSDS-PAGE loading Buffer,充分混匀后，置沸水 浴中煮沸5min，待样品冷却后，用掌式离屯、机瞬离。取化L用于SDS-PAGE电泳分析。
[0147] 结果表明化21(DE3)/pET3Oa-a-02-e-Y在诱导溫度为16°C，诱导时间在13h与16h 的条件下，目的蛋白a-K-e-his表达量变化不大，此时表达的蛋白几乎均为可溶性蛋白，沉 淀中的不溶性包涵体蛋白几乎没有表达。当诱导溫度为16°C，诱导时间在13h与16h的条件 下表达的可溶性目的蛋白纯度较高，表达量接近。因此，通过实验验证，进一步确定了重组 菌的最佳诱导溫度为16°C，诱导时间为13-1化(图8)。
【主权项】
1. 制备抗产气荚膜梭菌疫苗的方法，包括使蛋白质的编码基因在生物中进行表达得到 所述蛋白质，利用表达得到的所述蛋白质制备抗产气荚膜梭菌疫苗;所述蛋白质为a)或b) 或c)或d): a) 由SEQ ID No.2的氨基酸序列组成的蛋白质； b) 由SEQ ID No.2第51-937位所示的氨基酸序列组成的蛋白质； c) 在a)或b)所示的蛋白质的羧基端或/和氨基端融合蛋白标签得到的融合蛋白； d) 将SEQ ID No. 2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/ 或添加得到的可溶性蛋白质； 所述生物为微生物、植物或非人动物。2. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于:所述使蛋白质的编码基因在生物中进行表 达包括将所述蛋白质的编码基因导入受体微生物，得到表达所述蛋白质的重组微生物，培 养所述重组微生物，表达得到所述蛋白质。3. 根据权利要求2所述的方法，其特征在于:所述受体微生物为Cl )-C4)中的任一种： C1)原核微生物； C2)革兰氏阴性细菌； C3)埃希氏菌属细菌； C4)大肠杆菌BL21(DE3)。4. 根据权利要求1-3中任一所述的方法，其特征在于:所述蛋白质的编码基因为如下1) 或2)或3)所示的基因： 1) 编码序列是SEQ ID No.l所示的DNA分子； 2) 编码序列是SEQ ID No. 1的第151-2814位所示的DNA分子； 3) 与1)或2)限定的DNA分子具有90%以上的同一性且编码权利要求1所述蛋白质的DNA 分子。5. 根据权利要求2-4中任一所述的方法，其特征在于:所述重组微生物为将pET30a-a-i3 2-ε-Y导入大肠杆菌BL21(DE3)得到的表达氨基酸序列是SEQIDN 0.2的蛋白质的重组微生 物，所述重组微生物命名为BL21(DE3)/pET3Oa-a-02_e-Y，所述ρΕΤ30α-α-β2-ε-Υ为将载体 pET30a( + )的BamHI和Xhol位点之间的序列替换为SEQ ID No.l第151-2814位所示的DNA片 段得到的重组载体。6. 根据权利要求1-5中任一所述的方法，其特征在于:所述表达为诱导表达;所述诱导 表达是用〇.75mM的IPTG在16°C诱导13-16小时或13-24小时或13小时或16小时。7. 权利要求1中所述蛋白质或与所述蛋白质相关的生物材料在制备抗产气荚膜梭菌疫 苗中的应用； 所述生物材料为下述B1)至B16)中的任一种： B1)编码所述蛋白质的核酸分子； B2)含有B1)所述核酸分子的表达盒； B3)含有B1)所述核酸分子的重组载体； B4)含有B2)所述表达盒的重组载体； B5)含有B1)所述核酸分子的重组微生物； B6)含有B2)所述表达盒的重组微生物； B7)含有B3)所述重组载体的重组微生物； B8)含有Μ)所述重组载体的重组微生物； Β9)含有Β1)所述核酸分子的转基因动物细胞系； Β10)含有Β2)所述表达盒的转基因动物细胞系； Β11)含有Β3)所述重组载体的转基因动物细胞系； Β12)含有Μ)所述重组载体的转基因动物细胞系； Β13)含有Β1)所述核酸分子的转基因植物细胞系； Β14)含有Β2)所述表达盒的转基因植物细胞系； Β15)含有Β3)所述重组载体的转基因植物细胞系； Β16)含有M)所述重组载体的转基因植物细胞系。8. 根据权利要求7所述的应用，其特征在于:所述核酸分子为如下1)或2)或3)所示的基 因： 1) 编码序列是SEQ ID No.l所示的DNA分子； 2) 编码序列是SEQ ID No. 1的第151-2814位所示的DNA分子； 3) 与1)或2)限定的DNA分子具有90%以上的同一性且编码权利要求1所述蛋白质的DNA 分子； 所述重组载体为权利要求5中所述ρΕΤ30&-α-β2-ε ; 所述重组微生物为D1)或D2): D1)所述重组微生物为将权利要求1中所述的蛋白质的编码基因导入受体微生物，得到 表达权利要求1中所述蛋白质的重组微生物，所述受体微生物为Cl)-C4)中的任一种： C1)原核微生物； C2)革兰氏阴性细菌； C3)埃希氏菌属细菌； C4)大肠杆菌BL21(DE3)。9. 预防动物产气荚膜梭菌感染的疫苗，其含有权利要求7或8中所述蛋白质或与所述蛋 白质相关的生物材料； 所述生物材料为下述Β1)至Β16)中的任一种： Β1)编码权利要求1所述蛋白质的核酸分子； Β2)含有Β1)所述核酸分子的表达盒； Β3)含有Β1)所述核酸分子的重组载体； Β4)含有Β2)所述表达盒的重组载体； Β5)含有Β1)所述核酸分子的重组微生物； Β6)含有Β2)所述表达盒的重组微生物； Β7)含有Β3)所述重组载体的重组微生物； Β8)含有Μ)所述重组载体的重组微生物； Β9)含有Β1)所述核酸分子的转基因动物细胞系； Β10)含有Β2)所述表达盒的转基因动物细胞系； Β11)含有Β3)所述重组载体的转基因动物细胞系； Β12)含有Μ)所述重组载体的转基因动物细胞系； B13)含有B1)所述核酸分子的转基因植物细胞系； B14)含有B2)所述表达盒的转基因植物细胞系； B15)含有B3)所述重组载体的转基因植物细胞系； B16)含有M)所述重组载体的转基因植物细胞系。10.根据权利要求7或8所述的应用或权利要求9所述的疫苗，其特征在于:所述产气荚 膜梭菌为A、B、C、D和E这5种型产气荚膜梭菌中的任5种、任4种、任3种、任2种或任1种。
【文档编号】C07K14/33GK105999252SQ201610302594
【公开日】2016年10月12日
【申请日】2016年5月9日
【发明人】宋晓晖, 孙雨, 翟新验, 赵柏林
【申请人】中国动物疫病预防控制中心