专利名称：一种纤维素梭菌分解纤维素产氢的方法
技术领域：
本发明涉及一种分解纤维素产氢的方法。
技术背景生物制氢技术利用微生物发酵有机废水、秸秆类农林业废弃物、有机垃圾 等制氢，具有治污、环保和产能等特点。其中利用秸秆类农林业废弃物产氢的 效率高、能耗低、污染少、成本低，发展潜力巨大，为处理农林业有机废弃物， 实现资源、能源、环境和经济的可持续发展具有现实意义。纤维素梭菌H10有较强的纤维素代谢能力，纤维素利用率可达40% 60%;目前，利用纤维素梭菌H10分解纤维素发酵产氢的方法中，直接将纤维 素梭菌H10接种于纤维素底物的培养基中，由于纤维素梭菌H10在对纤维素 进行分解之前要附着于纤维素表面，在纤维素表面定殖才能对纤维素进行代 谢，而此过程还涉及到合成大量纤维素酶等生理准备阶段，其代谢和产氢在初 期有一段延迟期，因此存在培养时间长，纤维素的利用率低，仅为45% 55%， 且产氢速率仅为1.6±0.1molH2/mol己糖。发明内容本发明目的是为了解决现有利用纤维素梭菌H10分解纤维素发酵产氢的 方法存在培养时间长、纤维素的利用率低及产氢速率低的问题，而提供一种纤 维素梭菌分解纤维素产氢的方法。纤维素梭菌分解纤维素产氢的方法按以下步骤实现 一、将细胞浓度为 lxl01。个/L的纤维素梭菌H10菌液，以8% 12%的体积比例接种于生长培养 基中，在温度为35。C、 pH值为7.0 8.0、质量浓度为99.99%的氮气气氛的条 件下培养46 50h; 二、将培养后的纤维素梭菌HIO以8% 12%的体积比树 转接于产氢培养基中，在温度为34°C、 pH值为7.0 8.0、摇床转速为90 110r/min、质量浓度为99.99%的氮气气氛中进行厌氧发酵22 26h，即完成纤 维素梭菌分解纤维素产氢；其中步骤一所述生长培养基中的每1L培养基由 2.9g三水磷酸氢二钾，1.Sg磷酸二氢钾，1.3g硫酸铵，l.Og六水氯化镁，0.15g二水氯化钙，1.25mg硫酸亚铁，2.0g酵母粉，5.0g纤维二糖，2.0mg刃天青， l.OgL-半胱氨酸，0.018g四水氯化亚铁，O.lmg六水氯化钴，O.lmg二水氯化 亚铜，0.007g四水合氯化锰，O.OOlg氯化锌，0.005g硼酸，O.lmg五水合硒酸 钠，O.OOlg生物素，3.5mg烟酸，0.003g盐酸硫胺素，0.002g对氨基苯甲酸， O.OOlg泛酸f丐，0.5mg维生素B^， O.OOlg盐酸吡哆铵和余量的水组成；步骤 二所述产氢培养基中的每1L培养基由2.9g三水磷酸氢二钾，1.5g磷酸二氢钾， 1.3g硫酸铵，l.Og六水氯化镁，0.15g二水氯化钙，1.25mg硫酸亚铁，2.0g酵 母粉，7.5g纤维素(MN301), 2.0mg刃天青，l.Og L-半胱氨酸，0.018g四水 氯化亚铁，O.lmg六水氯化钴，O.lmg二水氯化亚铜，0.007g四水合氯化锰， O.OOlg氯化锌，0.005g硼酸，O.lmg五水合硒酸钠，O.OOlg生物素，3.5mg烟 酸，0.003g盐酸硫胺素，0.002g对氨基苯甲酸，O.OOlg泛酸钙，0.5mg维生素 B12， O.OOlg盐酸吡哆铵和余量的水组成。本发明将纤维素梭菌H10的产氢过程分为两个阶段生长阶段和产氢阶 段。生长阶段针对纤维素梭菌H10对较小分子碳水化合物累底物容易利用的 特性，选择纤维二糖为底物，使细菌能够迅速生长，延迟期縮短了 20% 30%; 产氢阶段的底物为纤维素MN301,此时纤维素梭菌H10在生长培养基中达到 对数生长期，将其转接入产氢培养基，在细菌活性最高时进行纤维素的代谢和 产氢，比产氢率达到最大产氢速率7.29mLH2/g-CDW h，纤维素利用率高达 65% 75%，产氢速率达1.9±0.1mol H2/mol己糖。本发明操作简单，易于管 理。
具体实施方式
本发明技术方案不局限于以下所列举具体实施方式
，还包括各具体实施方 式间的任意组合。
具体实施方式
一本实施方式纤维素梭菌分解纤维素产氢的方法按以下步 骤实现 一、将细胞浓度为lxl(T个/L的纤维素梭菌H10菌液，以8% 12% 的体积比例接种于生长培养基中，在温度为35。C、 pH值为7.0 8.0、质量浓 度为99.99%的氮气气氛的条件下培养46 50h; 二、将培养后的纤维素梭菌 H10以8% 12%的体积比例转接于产氢培养基中，在温度为34。C、 pH值为 7.0 8.0、摇床转速为90 110r/min、质量浓度为99.99%的氮气气氛中进行厌氧发酵22 26h，即完成纤维素梭菌分解纤维素产氢；其中步骤一所述生长培 养基中的每1L培养基由2.9g三水磷酸氢二钾，1.5g磷酸二氢钾，1.3g硫酸铵， l.Og六水氯化镁，0.15g二水氯化钙，1.25mg硫酸亚铁，2.0g酵母粉，5.0g纤 维二糖，2.0mg刃天青，l.OgL-半胱氨酸，0.018g四水氯化亚铁，O.lmg六水 氯化钴，O.lmg二水氯化亚铜，0.007g四水合氯化锰，O.OOlg氯化锌，0.005g 硼酸，O.lmg五水合硒酸钠，O.OOlg生物素，3.5mg烟酸，0.003g盐酸硫胺素， 0.002g对氨基苯甲酸，O.OOlg泛酸钙，0.5mg维生素B^， O.OOlg盐酸吡哆铵 和余量的水组成；步骤二所述产氢培养基中的每1L培养基由2.9g三水磷酸氢 二钾，1.5g磷酸二氢钾，1.3g硫酸铵，l.Og六水氯化镁，0.15g二水氯化钙， 1.25mg硫酸亚铁，2.0g酵母粉，7.5g纤维素(MN301)， 2.0mg刃天青，l.OgL-半胱氨酸，0.018g四水氯化亚铁，O.lmg六水氯化钴，O.lmg二水氯化亚铜， 0.007g四水合氯化锰，O.OOlg氯化锌，0.005g硼酸，O.lmg五水合硒酸钠，O.OOlg 生物素，3.5mg烟酸，0.003g盐酸硫胺素，0.002g对氨基苯甲酸，O.OOlg泛酸 钙，0.5mg维生素Bu， O.OOlg盐酸吡哆铰和余量的水组成。 本实施方式中纤维素梭菌HIO由购买得到。 本实施方式步骤一中体积比例为接种菌液体积比上培养液体积。
具体实施方式
二本实施方式与具体实施方式
一不同的是步骤一中以 9% 11%的体积比例接种于生长培养基中，在温度为35°C、 pH值为7.2 7.8、 质量浓度为99.99%的氮气气氛的条件下培养47 49h。其它步骤及参数与具体 实施方式一相同。
具体实施方式
三本实施方式与具体实施方式
一不同的是步骤一中以10% 的体积比例接种于生长培养基中，在温度为35°C、 pH值为7.5、质量浓度为 99.99。/。的氮气气氛的条件下培养48h。其它步骤及参数与具体实施方式
一相 同。
具体实施方式
四本实施方式与具体实施方式
一不同的是步骤二中将培养 后的纤维素梭菌H10以9% 11%的体积比例转接于产氢培养基中，在温度为 34°C、 pH值为7.2 7.8、摇床转速为95 105r/min、质量浓度为99.99%的氮 气气氛中进行厌氧发酵23 25h。其它步骤及参数与具体实施方式
一相同。
具体实施方式
五本实施方式与具体实施方式
一不同的是步骤二中将培养后的纤维素梭菌HIO以10%的体积比例转接于产氢培养基中，在温度为34°C、pH值为7.5、摇床转速为100r/min、质量浓度为99.99%的氮气气氛中进行厌氧发酵24h。其它步骤及参数与具体实施方式
一相同。
具体实施方式
六本实施方式纤维素梭菌分解纤维素产氢的方法按以下步 骤实现 一、将细胞浓度为lxl(T个/L的纤维素梭菌H10菌液，以10%的体积比例接种于生长培养基中，在温度为35°C、 pH值为7.0、质量浓度为99.99% 的氮气气氛的条件下培养45h; 二、将培养后的纤维素梭菌HIO以10%的体积 比例转接于产氢培养基中，在温度为34°C、 pH值为7.0、摇床转速为110r/min、 质量浓度为99.99%的氮气气氛中进行厌氧发酵24h，即完成纤维素梭菌分解纤 维素产氢；其中步骤一所述生长培养基中的每1L培养基由2.9g三水磷酸氢二 钾，1.5g磷酸二氢钾，1.3g硫酸铵，l.Og六水氯化镁，0.15g二水氯化钙，1.25mg 硫酸亚铁，2.0g酵母粉，5.0g纤维二糖，2.0mg刃天青，l.Og L-半胱氨酸，0.018g 四水氯化亚铁，O.lmg六水氯化钴，O.lmg二水氯化亚铜，0.007g四水合氯化 锰，O.OOlg氯化锌，0.005g硼酸，O.lmg五水合硒酸钠，O.OOlg生物素，3.5mg 烟酸，0.003g盐酸硫胺素，0.002g对氨基苯甲酸，O.OOlg泛酸钙，0.5mg维生 素B,2， 0.001g盐酸吡眵铵和余量的水组成；步骤二所述产氢培养基中的每1L 培养基由2.9g三水磷酸氢二钾，1.5g磷酸二氢钾，1.3g硫酸铵，l.Og六水氯 化镁，0'.15g 二水氯化钙，1.25mg硫酸亚铁，2.0g酵母粉，7.5g纤维素(MN301 )， 2.0mg刃天青，l.OgL-半胱氨酸，0.01Sg四水氯化亚铁，O.lmg六水氯化钴， O.lmg 二水氯化亚铜，0.007g四水合氯化锰，0.001g氯化锌，0.005g硼酸，O.lmg 五水合硒酸钠，0.001g生物素，3.5mg烟酸，0.003g盐酸硫胺素，0.002g对氨 基苯甲酸，0.001g泛酸钙，0.5mg维生素B12， O.OOlg盐酸吡卩多铵和余量的水 组成。本实施方式中细菌生长迅速，延迟期缩短了 27.1%;纤维素利用率高达 73.6%，产氢速率达1.9molH2/mol己糖。
具体实施方式
七本实施方式纤维素梭菌分解纤维素产氢的方法按以下步骤实现 一、将细胞浓度为lxlO'。个/L的纤维素梭菌H10菌液，以10%的体 积比例接种于生长培养基中；在温度为35。C、pH值为7.5、质量浓度为99.99% 的氮气气氛的条件下培养4511.， 二、将培养后的纤维素梭菌HIO以10%的体积比例转接于产氢培养基中，在温度为34。C、pH值为7.5、摇床转速为100r/min、 质量浓度为99.99%的氮气气氛中进行厌氧发酵24h，即完成纤维素梭菌分解纤 维素产氢；其中步骤一所述生长培养基中的每1L培养基由2.9g三水磷酸氢二 钾，1.5g磷酸二氢钾，1.3g硫酸铵，l.Og六水氯化镁，0.15g二水氯化钙，1.25mg 硫酸亚铁，2.0g酵母粉，5.0g纤维二糖，2.0mg刃天青，l.OgL-半胱氨酸，0.018g 四水氯化亚铁，O.lmg六水氯化钴，O.lmg二水氯化亚铜，0.007g四水合氯化 锰，0.001g氯化锌，0.005g硼酸，O.lmg五水合硒酸钠，0.001g生物素，3.5mg 烟酸，0.003g盐酸硫胺素，0.002g对氨基苯甲酸，0.001g泛酸转，0.5mg维生 素B,2， 0.001g盐酸吡哆铵和余量的水组成；步骤二所述产氢培养基中的每1L 培养基由2.9g三水磷酸氢二钾，1.5g磷酸二氢钾，1.3g硫酸铵，l.Og六水氯 化镁，0.15g 二水氯化钙，1.25mg硫酸亚铁，2.0g酵母粉，7.5g纤维素(MN301 )， 2.0mg刃天青，l.OgL-半胱氨酸，0.018g四水氯化亚铁，O.lmg六水氯化钴， O.lmg 二水氯化亚铜，0.007g四水合氯化锰，0.001g氯化锌，0.005g硼酸，O.lmg 五水合硒酸钠，0.001g生物素，3.5mg烟酸，0.003g盐酸硫胺素，0.002g对氨 基苯甲酸，0.001g泛酸钙，0.5mg维生素B!2， 0.001g盐酸吡眵铵和余量的水 组成。本实施方式中细菌生长迅速,延迟期縮短了 30%;纤维素利用率高达75%, 产氢速率达2.0mol H2/mol己糖。
权利要求
1、一种纤维素梭菌分解纤维素产氢的方法，其特征在于纤维素梭菌分解纤维素产氢的方法按以下步骤实现一、将细胞浓度为1×1010个/L的纤维素梭菌H10菌液，以8％～12％的体积比例接种于生长培养基中，在温度为35℃、pH值为7.0～8.0、质量浓度为99.99％的氮气气氛的条件下培养46～50h；二、将培养后的纤维素梭菌H10以8％～12％的体积比例转接于产氢培养基中，在温度为34℃、pH值为7.0～8.0、摇床转速为90～110r/min、质量浓度为99.99％的氮气气氛中进行厌氧发酵22～26h，即完成纤维素梭菌分解纤维素产氢；其中步骤一所述生长培养基中的每1L培养基由2.9g三水磷酸氢二钾，1.5g磷酸二氢钾，1.3g硫酸铵，1.0g六水氯化镁，0.15g二水氯化钙，1.25mg硫酸亚铁，2.0g酵母粉，5.0g纤维二糖，2.0mg刃天青，1.0g L-半胱氨酸，0.018g四水氯化亚铁，0.1mg六水氯化钴，0.1mg二水氯化亚铜，0.007g四水合氯化锰，0.001g氯化锌，0.005g硼酸，0.1mg五水合硒酸钠，0.001g生物素，3.5mg烟酸，0.003g盐酸硫胺素，0.002g对氨基苯甲酸，0.001g泛酸钙，0.5mg维生素B12，0.001g盐酸吡哆铵和余量的水组成；步骤二所述产氢培养基中的每1L培养基由2.9g三水磷酸氢二钾，1.5g磷酸二氢钾，1.3g硫酸铵，1.0g六水氯化镁，0.15g二水氯化钙，1.25mg硫酸亚铁，2.0g酵母粉，7.5g纤维素(MN301)，2.0mg刃天青，1.0g L-半胱氨酸，0.018g四水氯化亚铁，0.1mg六水氯化钴，0.1mg二水氯化亚铜，0.007g四水合氯化锰，0.001g氯化锌，0.005g硼酸，0.1mg五水合硒酸钠，0.001g生物素，3.5mg烟酸，0.003g盐酸硫胺素，0.002g对氨基苯甲酸，0.001g泛酸钙，0.5mg维生素B12，0.001g盐酸吡哆铵和余量的水组成。
2、 根据权利要求1所述的一种纤维素梭菌分解纤维素产氢的方法，其特 征在于步骤一中以9% 11%的体积比例接种于生长培养基中，在温度为35°C、 pH值为7.2 7.8、质量浓度为99.99。/。的氮气气氛的条件下培养47 49h。
3、 根据权利要求1所述的一种纤维素梭菌分解纤维素产氢的方法，其特 征在于步骤一中以10%的体积比例接种于生长培养基中，在温度为35。C、 pH 值为7.5、质量浓度为99.99。/。的氮气气氛的条件下培养48h。
4、 根据权利要求1所述的一种纤维素梭菌分解纤维素产氢的方法，其特 征在于步骤二中将培养后的纤维素梭菌H10以9% 11%的体积比例转接于产氢培养基中，在温度为34。C、 pH值为7.2 7.8、摇床转速为95 105r/min、 质量浓度为99.99%的氮气气氛中进行厌氧发酵23 25h。
5、根据权利要求1所述的一种纤维素梭菌分解纤维素产氢的方法，其特 征在于步骤二中将培养后的纤维素梭菌H10以10%的体积比例转接于产氢培 养基中，在温度为34'C、pH值为7.5、摇床转速为100r/min、质量浓度为99.99% 的氮气气氛中进行厌氧发酵24h。
全文摘要
一种纤维素梭菌分解纤维素产氢的方法，它涉及一种分解纤维素产氢的方法。它解决了现有利用纤维素梭菌H10分解纤维素发酵产氢的方法存在培养时间长、纤维素的利用率低及产氢速率低的问题。方法一、将纤维素梭菌H10接种于生长培养基中培养；二、将培养后的纤维素梭菌H10转接于产氢培养基中进行厌氧发酵，即完成纤维素梭菌分解纤维素产氢。本发明延迟期缩短了20％～30％，纤维素利用率高达65％～75％，产氢速率达1.9±0.1mol H<sub>2</sub>/mol己糖。
文档编号C12P3/00GK101402972SQ20081013755
公开日2009年4月8日 申请日期2008年11月18日 优先权日2008年11月18日
发明者任南琪, 王胜男, 邢德峰 申请人:哈尔滨工业大学