产气荚膜梭菌α毒素单克隆抗体阻断ELISA检测方法
【专利摘要】本发明公开了一种产气荚膜梭菌α毒素单克隆抗体阻断ELISA检测方法，用于α毒素的早期检测，为产气荚膜梭菌的早期诊断、传播预防、后续研究提供有效检测工具。所述方法包括以下两个步骤：一、单克隆抗体阻断ELISA检测方法的建立；二、结果判定标准的确定。本发明首次建立了特异性好、灵敏度高、稳定性好，快速、简便，高效检测α毒素的单克隆抗体阻断ELISA检测方法，该方法操作简单、检测速度快、可定量检测和大批量检测。总之，该单克隆抗体阻断ELISA有望在产气荚膜梭菌病的防治中发挥重要作用。
【专利说明】产气荚膜梭菌Ct毒素单克隆抗体阻断ELISA检测方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种检测产气荚膜梭菌a毒素的单克隆抗体阻断ELISA方法。
【背景技术】
[0002] 产气荚膜梭菌是人、畜消化道的正常菌群，是引起人的创伤性气性坏疽、食物中 毒、坏死性肠炎和肠毒血症的主要病原。在家禽中，主要引起坏死性肠炎而危害养禽业。在 家畜中，主要引起牛羊"猝死症"、羔羊痢疾、牛的肠毒血症及绵羊软肾病。a毒素（CPA)是 几乎所有类型产气荚膜梭菌都能产生的一种多功能性金属酶，是典型的致死性毒素，因此 a毒素是诊断产气荚膜梭菌病的重要依据，是判定食品安全的重要指标。
[0003] 检测a毒素的经典方法包括毒素中和试验、动物试验、卵磷脂分解试验等，但操 作步骤较繁琐、敏感性不高。随着国外生物技术的快速发展，近年来对a毒素的检测方法 已有很大进展，Naylor等建立了多抗基础上的ELISA检测方法，McCourt等用双夹心ELISA 检测a毒素，Hale等建立了捕获抗体ELISA方法。但是这些方法在国内可操作性欠缺，灵 敏度亦不是特别高，而国外可购买的检测试剂盒价格高昂，无法定量和大批量检测，在国内 推广可能性较低，因此为了填补国内a毒素检测的空白，需要建立一种快速、灵敏、特异并 能定量和大批量检测的ELISA方法。
【发明内容】
[0004] 基于以上不足之处，本发明提供了一种产气荚膜梭菌a毒素单克隆抗体阻断 ELISA检测方法，用于a毒素的早期检测，为产气荚膜梭菌的早期诊断、传播预防、后续研 究提供有效检测工具。
[0005] 本发明的目的通过下述技术方案实现：
[0006] -种产气荚膜梭菌a毒素单克隆抗体阻断ELISA检测方法，包括如下步骤：
[0007] -、单克隆抗体阻断ELISA检测方法的建立：
[0008] (1)用包被液将a毒素重组蛋白稀释至5iig/mL。100iiL/孔包被96孔酶标板， 4°C过夜。
[0009] 本步骤中，所述包被液为0. 05mol/L碳酸盐包被缓冲液，其配制方法如下：称取 Na2CO3L5g、NaHC032. 93g，调节pH至 9. 6,力口蒸馏水至IOOOmL, 4。。保存。
[0010] ⑵用PBST溶液洗涤3次，加入含5%脱脂奶粉的PBS溶液作为封闭液200 i! L/ 孔，37°C孵育2h。
[0011] 本步骤中，所述PBST溶液为含0.05 % Tween-20的PBS溶液，其配制方法为：称取 NaCl8g、KCl 0.2g、Na2HP04.12H20 3.588、腿2?040.278，加蒸馏水至10001^，调至？117.4(此 步配成溶液即为PBS);再加入0.5mL Tween-20。
[0012] 本步骤中，所述含5 %脱脂奶粉的PBS溶液的配制方法为：每100ml PBS溶液中加 5g脱脂奶粉。
[0013] (3)用PBST溶液洗涤3次后加入待检样品，同时设置阴阳性对照，阳性对照为a 毒素多克隆抗体，阴性对照为阴性血清，100 y L/孔，37°C孵育lh。
[0014] 本步骤中，所述a毒素多克隆抗体的制备步骤如下：选取2-3Kg新西兰大白兔， 首免为纯化的重组a毒素与等体积弗式完全佐剂完全乳化后背部皮下多点注射，剂量为 2mg/只，首免两周后用弗式不完全佐剂与等体积纯化的重组a毒素完全乳化，剂量为Img/ 只，每周免疫一次，3免后1周用不加佐剂的纯化的重组a毒素加强免疫，7d后兔心脏采血 获得血清，得到抗产气荚膜梭菌a毒素多克隆抗体，通过间接ELISA法检测抗体效价，蛋白 质印迹法用于多抗特性鉴定。
[0015] (4)3次PBST溶液洗涤后，将杂交瘤细胞株A10E5制备的单克隆抗体纯化腹水用 PBS缓冲液稀释至 2. 5iig/mL，100iiL/ 孔，37°C反应lh。
[0016] 本步骤中，所述杂交瘤细胞株A10E5制备的单克隆抗体纯化腹水是按以下方法 获得的：
[0017] a、抗产气荚膜梭菌a毒素单克隆抗体的制备：选择与骨髓瘤细胞SP2/0同源的纯 系雌性BALB/c小鼠（4-6周龄）作为免疫动物,免疫方案：以切胶纯化和复性后a毒素重 组蛋白为免疫原制备单克隆抗体。首次免疫时取50 y g纯化蛋白与等体积完全弗氏佐剂进 行乳化，采用腹腔注射方式对6周龄雌性BALB/c小鼠进行免疫；3周后取50 y g纯化蛋白与 等体积不完全弗氏佐剂乳化进行第二次免疫；此后每隔2周进行一次免疫，免疫剂量和免 疫途径与第二次免疫相同，最后一次免疫后3-5天取效价最高小鼠脾细胞用于细胞融合。
[0018] b、取生长状态良好骨髓瘤细胞SP2/0与上述ELISA检测效价最高小鼠脾细胞利用 PEG 3350进行化学法融合，运用间接ELISA方法筛选阳性杂交瘤细胞，并采用有限稀释法 进行3-5次亚克隆，得到抗产气荚膜梭菌a毒素杂交瘤细胞株A10E5;利用A10E5单克隆 抗体杂交瘤细胞腹腔注射BALB/c小鼠制备腹水，纯化后-70°C保存备用。
[0019] (5)用PBST溶液洗涤3次，加入用PBS缓冲液1 : 5000体积比稀释的HRP标记的 羊抗鼠IgG，37°C孵育lh，PBST溶液洗涤3次。
[0020] (6)最后加入显色液100i! L/孔，室温条件避光反应lOmin，用2MH2SO4溶液终止 反应，490nm处读取吸光值。
[0021] 二、结果判定标准的确定：
[0022] 计算CP阴性样品平均值（孓）与标准差⑶，求得（孓）+3(S)为阳性临界值， (x)+2(S)为阴性临界值。样品阻断率PI2( x)+3(S)，则血清样品判为阳性；当 PI贫I计2(： S )时为阴性；对于在介于两者之间的血清样品，判定为可疑，需要重复检测 一次，如仍可疑则判定为阳性。
[0023] 相比于现有技术，本发明具有如下的优点：
[0024] (1)特异性强：利用已建立的阻断ELISA检测方法对实验室保存的其他病原阳性 血清进行检测。结果显示，只有产气荚膜梭菌阳性血清检测为阳性，其他血清均为阴性，说 明本发明建立的检测体系特异性良好，无交叉反应。
[0025] (2)灵敏度高：用建立的阻断ELISA检测方法对倍比稀释的a毒素阳性多抗进行 检测，结果表明该阻断ELISA检测方法最低可以检测到0. 0125mg/mL的抗体，即为此方法最 低检测线。
[0026] (3)重复性好：对3个不同批次制备的兔抗产气荚膜梭菌梭菌a毒素多抗血清在 板内和板间进行重复性试验。板内重复性试验是在同一块酶标板内对每个样品设置4个复 孔进行阻断ELISA检测，计算其变异系数在2. 080-2. 819%之间；板间重复试验是在4块不 同的酶标板进行阻断ELISA检测每个样品，计算其变异系数在1. 735-2. 975%。这两个重 复性试验的变异系数都小于10%，证明本发明建立的阻断ELISA检测方法具有良好的重复 性。
[0027] (4)本发明首次建立了特异性好、灵敏度高、稳定性好，快速、简便，高效检测a毒 素的单克隆抗体阻断ELISA检测方法，该方法操作简单、检测速度快、可定量检测和大批量 检测。总之，该单克隆抗体阻断ELISA有望在产气荚膜梭菌病的防治中发挥重要作用。
【专利附图】
【附图说明】
[0028] 图1是产气荚膜梭菌a毒素基因PCR图，其中，M:DNAmarker;1:a毒素基因扩 增结果；
[0029] 图2是最佳抗原包被浓度的选择；
[0030] 图3是抗原包被时间的选择；
[0031] 图4是最佳封闭液的选择；
[0032] 图5是最佳封闭时间的选择；
[0033] 图6是最佳待检样品孵育时间的选择；
[0034] 图7是最佳单抗孵育时间的选择；
[0035] 图8是最佳酶标抗体稀释浓度的选择；
[0036] 图9是最佳酶标抗体孵育时间的选择；
[0037] 图10是最佳显色液作用时间的选择；
[0038] 图11是单克隆抗体阻断ELISA特异性试验。
【具体实施方式】
[0039] 下面结合附图对本发明的技术方案作进一步的说明，但并不局限于此，凡是对本 发明技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围，均应涵盖 在本发明的保护范围中。
[0040] 实施例1
[0041] 产气荚膜梭菌a毒素的原核表达：
[0042] 根据GenBank已发表的产气荚膜梭菌a毒素基因序列（登录号CP000246. 1)，设 计引物Pl和P2 :
[0043]Pl:5' -GGGGGAATTCTGGGATGGAAA-3，(下划线表示引入的酶切位点为EcoRI)。
[0044]P2 :5' -GGGGCTCGAGTTATTTTATAT-3'(下划线表示引入的酶切位点为XhoI)。
[0045] 选取标准菌种ATCC13124,用细菌基因组DNA提取试剂盒提取DNA后，利用PCR扩 增产气荚膜梭菌a毒素基因片段，扩增条件：94°C预变性10min、94°C变性30s、50. 2°C退火 30s、72°C延伸Imin和 94°C预变性 10min、94°C变性 30s、49. 6°C退火 30s、72°C延伸lmin，共 进行30个循环，72°C终延伸lOmin。PCR产物用质量分数为1 %的琼脂糖凝胶电泳进行分 析，在1134bp附近存在单一的目标条带，结果如图1所示，表明实验获得了与预期相符的特 异DNA片段即a毒素基因片段。将经DNA纯化回收试剂盒纯化的目的产物与pMD18-T连 接并测序。测序正确的重组质粒与载体PGEX-6P-1分别用EcoRI和XhoI双酶切处理，连 接后转入表达感受态细胞BL21中，将菌液涂布于固体LB培养基（NaCllg，蛋白胨lg，酵母 提取物0.5g，琼脂粉I.5g，用IOOmL去离子水溶解后高压灭菌），挑取单菌落接种于含有氨 苄青霉素（Amp+)的液体LB培养基中，37°C培养3h至OD为0. 4-0. 6时，加入IPTG(异丙基 硫代半乳糖苷，终浓度ImmoVU诱导表达6h，菌体超声破碎后，经切胶纯化制备的a毒素 重组蛋白；利用聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE)和蛋白质印迹法（Western-blot)验证纯 化后的a毒素重组蛋白的纯度和免疫原性，用于后续动物免疫实验和检测实验。
[0046] 实施例2
[0047] 抗产气荚膜梭菌a毒素多克隆抗体的制备：
[0048] 选取2_3Kg新西兰大白兔，首免为纯化的重组a毒素与等体积弗式完全佐剂完全 乳化后背部皮下多点注射，剂量为2mg/只，首免两周后用弗式不完全佐剂与等体积纯化的 重组a毒素完全乳化，剂量为Img/只，每周免疫一次，3免后1周用不加佐剂的纯化的重组 a毒素加强免疫，7d后兔心脏采血获得血清，得到抗产气荚膜梭菌a毒素多克隆抗体，通 过间接ELISA法检测抗体效价，蛋白质印迹法用于多抗特性鉴定。
[0049] 实施例3
[0050] 抗产气荚膜梭菌a毒素单克隆抗体的制备：
[0051] 选择与骨髓瘤细胞SP2/0同源的纯系雌性BALB/c小鼠（4-6周龄）作为免疫动物， 免疫方案：以切胶纯化和复性后a毒素重组蛋白（步骤1中得到）为免疫原制备单克隆抗 体。首次免疫时取50yg纯化蛋白与等体积完全弗氏佐剂进行乳化，采用腹腔注射方式对 6周龄雌性BALB/c小鼠进行免疫；3周后取50yg纯化蛋白与等体积不完全弗氏佐剂乳化 进行第二次免疫；此后每隔2周进行一次免疫，免疫剂量和免疫途径与第二次免疫相同，最 后一次免疫后3-5d取效价最高小鼠脾细胞用于细胞融合。
[0052] 取生长状态良好骨髓瘤细胞SP2/0与上述ELISA检测效价最高小鼠脾细胞利用 PEG3350进行化学法融合，运用间接ELISA方法筛选阳性杂交瘤细胞，并采用有限稀释法 进行3-5次亚克隆，得到抗产气荚膜梭菌a毒素杂交瘤细胞株A10E5。
[0053] 选择7周龄雌性BALB/c小鼠，腹腔注射石蜡0. 5mL/只致敏，一周后注射阳性杂交 瘤细胞株A10E5,0. 5XIO6个/只，7-10d后收集小鼠腹水，间接ELISA方法检测腹水效价。腹 水经正辛酸-硫酸铵方法纯化后，SDS-PAGE检测纯化效果；蛋白质印迹法（Western-blot) 用于单抗特性鉴定，包括单克隆抗体的特异性、鉴定单抗与a毒素的反应性。
[0054] 实施例4
[0055] 单克隆抗体阻断ELISA检测方法的建立：
[0056] (1)单克隆抗体和多抗血清工作浓度的确定：
[0057] 按矩阵滴定法，按之前实验室已经确定的抗原包被浓度，纯化后a毒素蛋白 0. 5ug/100ul，100ul/孔的量包被，4°C过夜。将纯化后的兔抗pic多克隆抗体（4. 00mg/ml) 用PBS按 1 : 10、1 : 20、1 : 40、1 : 80、1 : 160、1 : 320、1 : 640 和 1 : 1280 倍稀释 作为检验抗体，兔阴性血清进行相同的稀释作为阴性对照。将纯化后的鼠抗a毒素单克隆 抗体A10E5 (I. 70mg/ml)用PBS稀释至 20ug/ml、10ug/ml、5ug/ml、2. 5ug/ml和I. 25ug/ml 作为结合抗体。HRP-羊抗鼠IgG酶标抗体I: 5000倍稀释作为二抗。操作程序按上述方 法进行，酶标仪测定OD49tol值后分析。计算出工作浓度的阳性血清和阴性血清对单克隆抗 体的阻断率。选取阴性对照孔的OD49tlnm值为1左右，同时阳性血清阻断率彡50%时所对应 的稀释度作为单克隆抗体和多抗血清的最佳工作浓度。
[0058] 最终确定抗产气荚膜梭菌a毒素多抗包被浓度为50 ii g/ml，鼠抗产气荚膜梭菌 a毒素单抗A10E5检测浓度为2. 5iig/ml时为两者的最适工作浓度，见表1。
[0059] (2)抗原包被浓度的选择：
[0060] 将纯化后的a毒素蛋白按最佳浓度包被，包被浓度有lug/100ul，0. 5ug/100ul， 0. 25ug/100ul和0. 125ug/100ul，按标准程序进行抗体阻断ELISA。根据OD49tol值计算，选 取阴性对照孔的OD49tol值为1左右，同时阳性血清阻断率> 50%时，具有最大阻断率的包被 浓度作为最佳抗原包被浓度。
[0061] 最终确定的抗原包被浓度为〇? 5ug/100ul，见图2。
[0062] (3)抗原包被时间的选择：
[0063] 将纯化后的a毒素蛋白按最佳浓度包被，包被条件有37°Clh，37°CI. 5h，37°C2h 和4°C过夜，按标准程序进行阻断ELISA。根据OD49tlnm值计算，选取阴性对照孔的OD49tol值 为1左右，同时阳性血清阻断率> 50%时，具有最大阻断率的包被条件作为最佳抗原包被 条件。
[0064] 最终确定的抗原包被时间为4°C包被过夜，见图3。
[0065] (4)最适封闭液的选择：
[0066] 将纯化后的a毒素按最佳条件包被，封闭液分别选择PBS稀释的10%胎牛血 清、5%脱脂乳、2%BSA、1%BSA，同时设置不封闭对照，37°C封闭2h，按常规程序进行阻 断ELISA，根据OD49tol值计算，选取阴性对照孔的OD49_值为1左右，同时阳性血清阻断率 > 50%时，具有最大阻断率的封闭液为最佳封闭液。
[0067] 最终确定的最佳封闭液为5%脱脂乳，见图4。
[0068] (5)最佳封闭时间的选择：
[0069]将纯化后的a毒素按最佳浓度包被，使用最佳封闭液封闭，封闭时间分别设定 37°Clh，37°C2h，37°C3h和37°C4h，按程序进行阻断ELISA。根据OD49tol值计算，选取阴性 对照孔的OD49tol值为1左右，同时阳性血清阻断率彡50%时，具有最大阻断率的时间为最佳 封闭时间。
[0070] 最终确定的最佳封闭时间为37 °C封闭2h，见图5。
[0071] (6)最佳待检样品孵育时间的选择：
[0072] 将纯化后的a毒素按最佳浓度包被，最佳封闭液封闭适当时间，待检样品分别在 37°C孵育30min，60min，90min，按程序进行阻断ELISA。根据OD49tlmi值为1左右，同时阳性 血清阻断率>50%时，具有最大阻断率的时间为最佳待检样品孵育时间。
[0073] 最终确定的最佳待检样品孵育时间为60min，见图6。
[0074] (7)最佳单抗孵育时间选择：
[0075] 按已确定的最适条件包被、封闭、待检样品孵育，加入最佳浓度的鼠抗产气荚膜梭 菌a毒素单抗A10E5之后，分别在37°C孵育3〇1^11，6〇111111，9〇111111，按程序进行阻断￡115八。 根据OD49tol值为1左右，同时阳性血清阻断率> 50%时，具有最大阻断率的时间为最佳单抗 孵育时间。
[0076] 最终确定的最佳单抗孵育时间为37°C作用lh，见图7。
[0077] (8)酶标羊抗鼠IgG工作浓度的选择：
[0078] 按已确定的最适条件包被、封闭、待检样品孵育和检测抗体孵育条件进行阻断 ELISA操作，在加入鼠抗产气荚膜梭菌a毒素单抗之后，分别加入1 : 3000，1 : 4000、 1 : 5000和1 : 6000不同稀释度的酶标羊抗鼠IgG。结果使用酶标仪测定OD49tol值为1左 右，同时阳性血清阻断率> 50%时，具有最大阻断率的抗体浓度为最佳酶标抗体工作浓度。 [0079] 最终确定的最佳工作浓度为1 : 5000,见图8。
[0080] (9)酶标羊抗鼠IgG作用时间的选择：
[0081] 在优化二抗作用时间时，选择在37°C分别作用3〇111；[11，601]1；[11，901]1；[11，操作按阻断 ELISA程序进行。结果使用酶标仪测定OD49tol值为1左右，同时阳性血清阻断率彡50%时， 具有最大阻断率的时间为最佳酶标抗体工作时间。
[0082] 最终确定的酶标抗体作用时间为37°C孵育60min，见图9。
[0083] (10)最佳显色时间的选择：
[0084] 在加入显色液之后，分别室温避光显色5min，lOmin，15min和20min，酶标仪测定 OD49tol值为1左右，同时阳性血清阻断率> 50%时，具有最大阻断率的时间为最佳显色液作 用时间。
[0085] 最终确定的最佳显色时间为IOmin,见图10。
[0086] (11)阻断ELISA临界值的确定：
[0087]取110份产气荚膜梭菌阴性鸡血清，用建立的阻断ELISA方法进行检测，同 时设置阳性和阴性对照，测定OD49tlnm值。计算110份阴性血清样品平均阻断率平均值 (X)=5.4844%和标准差（S) = 9.4764%。
[0088] 样品阻断率Piy孓）+3(S)，则血清样品判为阳性；当PIS(S)+2(S)时为 阴性；对于在介于两者之间的血清样品，判定为可疑，需要重复检测一次，如仍可疑则判定 为阳性。所以PI彡33. 91 %判为阳性；PI彡24. 44%判为阴性；33. 91 %<PI< 24. 44%判 为可疑。
[0089] 实施例5
[0090] 单克隆抗体阻断ELISA方法性能评价：
[0091] (1)特异性试验：采用初步建立的阻断ELISA检测方法对禽大肠杆菌病、禽沙门氏 菌病、禽白血病、鸡球虫病、鸡传染性法氏囊病、鸡马立克氏病、鸡传染性支气管炎病的阳性 血清进行检测，以鸡阴性血清和产气荚膜梭菌阳性血清作为对照。根据已确立的临界值进 行判断，分析有无交叉反应。结果显示，只有产气荚膜梭菌阳性血清检测为阳性，其他血清 均为阴性，统计学结果也表明检测产气荚膜梭菌阳性血清时的OD49tlnm值与检测其他参考血 清的数值表现差异极显著（P< 0.01)，说明本实验建立的检测体系特异性良好，无交叉反 应，见图11。
[0092] (2)灵敏度试验：将兔抗a毒素血清用PBS缓冲液分别作1 : 20、1 : 40、1 : 80、 1 : 160、1 : 320、1 : 640和1 : 1280倍稀释，按阻断ELISA程序进行，同时设立阴性对 照，根据阳性临界值判定，以最高稀释度为单抗检测的灵敏度。已知本批次兔抗产气荚膜梭 菌a毒素多抗血清的浓度为4.Omg/ml。用建立的阻断ELISA方法检测的结果见表2。在阴 性对照成立的情况下，根据确定的阳性临界值，所能检测多抗的最高稀释倍数为1 : 320， 此时抗体浓度为〇. 〇125mg/mL，说明阻断ELISA方法最低可以检测到0. 0125mg/mL的抗体。
[0093] (3)重复性试验：对3个不同批次制备的兔抗产气荚膜梭菌梭菌a毒素多抗血 清在板内和板间进行重复性试验。板内重复性试验是在同一块酶标板内对每个样品设 置4个复孔进行阻断ELISA检测，计算其变异系数在2. 080-2. 819%之间（结果见表3); 板间重复试验是在4块不同的酶标板进行阻断ELISA检测每个样品，计算其变异系数在 1.735-2.975% (结果见表4)。这两个重复性试验的变异系数都小于10%，证明本实验建 立的阻断ELISA检测方法具有良好的重复性。
[0094] 表1鼠抗产气荚膜梭菌a毒素单抗A10E5和兔抗产气荚膜梭菌a毒素多抗血清 工作浓度的确定
【权利要求】
1. 一种产气荚膜梭菌α毒素单克隆抗体阻断ELISA检测方法，其特征在于所述检测方 法步骤如下： 一、 单克隆抗体阻断ELISA检测方法的建立： (1) 用包被液将α毒素重组蛋白稀释至5 μ g/mL, 100 μ L/孔包被96孔酶标板,4°C过 夜； (2) 用PBST溶液洗涤3次，加入含5 %脱脂奶粉的PBS溶液作为封闭液200 μ L/孔， 37°C 孵育 2h ; (3) 用PBST溶液洗涤3次后加入待检样品，同时设置阴阳性对照，阳性对照为α毒素 多克隆抗体，阴性对照为阴性血清，100 μ L/孔，37°C孵育Ih ; (4) 3次PBST溶液洗涤后，将杂交瘤细胞株A10E5制备的单克隆抗体纯化腹水用PBS缓 冲液稀释至2. 5 μ g/mL，100 μ L/孔，37°C反应Ih ; (5) 用PBST溶液洗涤3次，加入用PBS缓冲液I : 5000体积比稀释的HRP标记的羊抗 鼠 IgG，37°C孵育lh，PBST溶液洗涤3次； (6) 最后加入显色液100 μ L/孔，室温条件避光反应lOmin，用2M H2SCV^液终止反应， 490nm处读取吸光值； 二、 结果判定标准的确定： 计算CP阴性样品平均值（S)与标准差（s)，求得（i)+3(s)为阳性临界值， (S)+2(S)为阴性临界值；当样品阻断率PI2( i)+3(S)，则血清样品判为阳性；当 Pig ^〇+2( S )时为阴性；对于在介于两者之间的血清样品，判定为可疑，需要重复检测 一次，如仍可疑则判定为阳性。
2. 根据权利要求1所述的产气荚膜梭菌α毒素单克隆抗体阻断ELISA检测方法，其 特征在于所述包被液为0. 05mol/L碳酸盐包被缓冲液，其配制方法如下：称取Na2CO3L 5g、 NaHC032. 93g，调节pH至9. 6,加蒸馏水至1000mL，4°C保存。
3. 根据权利要求1所述的产气荚膜梭菌α毒素单克隆抗体阻断ELISA检测方法，其 特征在于所述PBST溶液为含0. 05 % Tween-20的PBS溶液，其配制方法为：称取NaCl 8g、 KCl 0· 2g、Na2HP04 ·12Η203· 58g、KH2P040. 27g，加蒸馏水至 lOOOmL，调至 ρΗ7· 4 ;再加入 0· 5mL Tween-20。
4. 根据权利要求I所述的产气荚膜梭菌α毒素单克隆抗体阻断ELISA检测方法，其 特征在于所述含5%脱脂奶粉的PBS溶液的配制方法为：每100ml PBS溶液中加5g脱脂奶 粉。
5. 根据权利要求1所述的产气荚膜梭菌α毒素单克隆抗体阻断ELISA检测方法，其特 征在于所述α毒素多克隆抗体的制备步骤如下：选取2_3Kg新西兰大白兔，首免为纯化的 重组α毒素与等体积弗式完全佐剂完全乳化后背部皮下多点注射，剂量为2mg/只，首免两 周后用弗式不完全佐剂与等体积纯化的重组α毒素完全乳化，剂量为Img/只，每周免疫一 次，3免后1周用不加佐剂的纯化的重组α毒素加强免疫，7d后兔心脏采血获得血清，得到 抗产气荚膜梭菌α毒素多克隆抗体。
6. 根据权利要求1所述的产气荚膜梭菌α毒素单克隆抗体阻断ELISA检测方法，其特 征在于所述杂交瘤细胞株A10E5制备的单克隆抗体纯化腹水是按以下方法获得的： a、 抗产气荚膜梭菌α毒素单克隆抗体的制备：选择与骨髓瘤细胞SP2/0同源的纯系雌 性BALB/c小鼠作为免疫动物,免疫方案：以切胶纯化和复性后α毒素重组蛋白为免疫原制 备单克隆抗体，首次免疫时取50 μ g纯化蛋白与等体积完全弗氏佐剂进行乳化，采用腹腔 注射方式对6周龄雌性BALB/c小鼠进行免疫；3周后取50 μ g纯化蛋白与等体积不完全弗 氏佐剂乳化进行第二次免疫；此后每隔2周进行一次免疫，免疫剂量和免疫途径与第二次 免疫相同，最后一次免疫后3-5天取效价最高小鼠脾细胞用于细胞融合； b、 取生长状态良好骨髓瘤细胞SP2/0与上述ELISA检测效价最高小鼠脾细胞利用PEG 3350进行化学法融合，运用间接ELISA方法筛选阳性杂交瘤细胞，并采用有限稀释法进行 3-5次亚克隆，得到抗产气荚膜梭菌α毒素杂交瘤细胞株A10E5 ;利用A10E5单克隆抗体杂 交瘤细胞腹腔注射BALB/c小鼠制备腹水，纯化后-70°C保存备用。
7.根据权利要求1所述的产气荚膜梭菌α毒素单克隆抗体阻断ELISA检测方法，其特 征在于所述纯系雌性BALB/c小鼠4-6周龄。
【文档编号】G01N33/569GK104515854SQ201510004752
【公开日】2015年4月15日 申请日期:2015年1月6日 优先权日:2015年1月6日
【发明者】李广兴, 乔艺然, 张艳, 郑晓星, 任玉东 申请人:东北农业大学