专利名称：产气荚膜梭菌的快速检测方法及检测引物组和检测试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明属微生物检测领域，涉及一种产气荚膜梭菌快速检测方法及其检测引物组 和检测试剂盒。
背景技术：
产气荚膜梭菌(Clostridium perfringens)是一种能引起人食物中毒、抗生素相 关性腹泻和动物腹泻等疾病的重要病原菌。该菌是一种革兰氏阳性产芽胞专性厌氧杆菌， 广泛存在于自然界的土壤、水源及人和动物肠道中。研究发现，该菌至少可以产生15种以 上的毒素，目前根据产气荚膜梭菌产生的四种重要的致病性毒素(α、β、ε、ι毒素)能 力，将其分为A、B、C、D和E五种类型，各型产气荚膜梭菌均产生α-毒素，所以α-毒素被 认为是最基本、最重要的致病因子。对人致病的主要是A型产气荚膜梭菌，也有少数为C型， 其中由A型产气荚膜梭菌引起的食物中毒在美国等西方国家居前三位。在我国，随着社会 的发展、人们生活节奏的加快及海内外文化交流的增加，人们生活方式也发生了许多变化， 生冷食品、罐头制品等摆上了餐桌，产气荚膜梭菌对食品的污染也是引起人食物中毒和腹 泻的一个重要原因。目前食品检测过程中主要以平板分离鉴定为主对该菌进行检测，操作 均较为复杂，且耗时长，不能及时做出判断。同时，由于该菌为厌氧菌，培养时对环境要求较 高，随着检测环节的增加，其准确性受到一定限制。随着分子生物学技术的快速发展，环介 导等温扩增技术(Loop-Mediated Isothermal Amplification，LAMP)已逐步应用于食源性 致病菌的检测。LAMP方法是一种新型的恒温核酸扩增技术，该技术主要利用4种不同的特异性引 物识别靶DNA上6个特定区域，并利用一种具有链置换活性的DNA聚合酶(BstDNA)，在恒温 条件下快速扩增核酸，保证了扩增的高特异性和高效率。由于LAMP独特的核酸扩增机制， 它的产物是由多重复靶序列的茎一环状DNA和花椰菜状DNA所组成的混合物，在琼脂糖凝 胶电泳上会呈现出LAMP反应典型的阶梯状条带；同时，核酸大量生成时，从dNIPs中析出 的焦磷酸根离子与反应体系中的Mg2+结合，产生肉眼可见的扩增反应副产物-白色焦磷酸 镁沉淀；另外，由于扩增产物大量生成，加入荧光染料(如Syber Green I、溴化乙锭、Gel Red等)。因此LAMP扩增结果不但观察方式多样，且结果鉴定简单，非常适合高通量的快速 检测。鉴于LAMP技术有众多优势，现已被用于病原微生物的检测，如分支杆菌属、阪崎 肠杆菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌等。现尚未见有LAMP应用于产气荚膜梭菌检测的相关 报道。
发明内容
本发明的目的是提供一种产气荚膜梭菌的快速检测方法及检测引物组和检测试剂盒。为实现上述目的，本发明所采取的技术方案是所述产气荚膜梭菌的检测引物组的外引物的上游引物具有如SEQ No. 1所示的序列；其外引物的下游引物具有如SEQ No. 2 所示的序列；其内引物的上游引物具有如SEQ No. 3所示的序列；其内引物的下游引物具有 如SEQ No. 4所示的序列。本发明利用所述引物组对待测样品的DNA进行LAMP反应，反应结束后对反应液进 行阴阳性判定。进一步地，所述LAMP反应按以下第一种方案或第二种方案进行第一种方案所述LAMP反应在59. 5-62. 5°C下反应50_70min ；第二种方案所述LAMP反应包含以下步骤(1)先在 59. 5-62. 5°C下反应 50_70min ；(2)后在 80°C下反应 6_12min。进一步地，本发明在进行所述LAMP反应的反应液中，包含浓度均为0. 15-0. 25 μ M 的所述外引物的上游引物和下游引物、浓度均为0. 6-1. ομ M的内引物的上游引物和下 游引物，浓度为0. 6-0. 7Μ的甜菜碱溶液，浓度为4. 8-6. 4mM的MgSO4,10 % (体积)的 10 X BstDNA聚合酶缓冲液，浓度为0. 2-0. 4U/ μ L的BstDNA聚合酶，各浓度为0. 6-1. OmM的 三磷酸鸟嘌呤脱氧核苷酸(dGTP)、三磷酸腺嘌呤脱氧核苷酸(dATP)、三磷酸胸腺嘧啶脱氧 核苷酸(dTTP)、三磷酸胞嘧啶脱氧核苷酸(dCTP)。本发明使用权利要求1所述引物组的一种快速检测试剂盒包括所述引物组、阳性 对照品、BstDNA聚合酶、IOXBstDNA聚合酶缓冲液、MgSO4溶液、甜菜碱溶液和无菌超纯水， 所述阳性对照品为产气荚膜梭菌的基因组DNA。本发明使用权利要求1所述引物组的另一种快速检测试剂盒在其LAMP反应液 中包含有所述引物组、阳性对照品、BstDNA聚合酶、IOXBstDNA聚合酶缓冲液、MgSO4 溶液、甜菜碱溶液和无菌超纯水的混合液，所述外引物的上游引物和下游引物的度均为 0. 15-0. 25 μ M，内引物的上游引物和下游引物的浓度均为0. 6-1.0 μ Μ，甜菜碱的浓度为 0. 6-0. 7Μ，MgSO4的浓度为4. 8-6. 4mM，10 X BstDNA聚合酶缓冲液与所述混合液的体积 比为10%，BstDNA聚合酶的浓度为0. 2-0. 4U/μ L的，三磷酸鸟嘌呤脱氧核苷酸、三磷酸 腺嘌呤脱氧核苷酸、三磷酸胸腺嘧啶脱氧核苷酸和三磷酸胞嘧啶脱氧核苷酸的浓度各为 0. 6-1. OmM0与现有技术相比，本发明的有益效果是1、本发明是根据已公开的产气荚膜梭菌(Pa基因序列，分析设计得到本发明的产 气荚膜梭菌特异性LAMP检测引物组，特异性强，能准确检测产气荚膜梭菌基因组DNA。2、本发明的快速检测方法能快速高效扩增产气荚膜梭菌基因组DNA目的片段，整 个LAMP扩增过程可在1小时内完成，扩增产物得率高，对产气荚膜梭菌的检测准确、迅速、 简便、高效。3、在本发明的快速检测方法中，LAMP扩增反应可在恒定温度下完成，且允许的温 度波动范围较大(士 1.5°C )，因此对温控的仪器设备要求不高，水浴器或板式加热器均可 满足要求。4、本发明的快速检测方法灵敏度高，扩增模板产气荚膜梭菌基因组DNA浓度仅需
IOfg/μ Lo5、本发明的快速检测方法结果判定简便，且可根据实验室实际条件采用不同的结果判定方式，方法适应性较强。6、与常规的平板培养法相比，本发明的快速检测方法可大大缩短检测周期，减少 检测环节，从而降低因检测环节过多而导致产气荚膜梭菌因接触空气而死亡的几率，使检 测结果更为准确可靠。
图1显示了产气荚膜梭菌LAMP反应产物经离心后的情况。图2显示了产气荚膜梭菌LAMP反应产物经STOR Green I染色后，在紫外灯下观
察的结果。
具体实施例方式下面结合具体实施例对本发明做进一步阐述，但并不对本发明做任何限定。实施例1产气荚膜梭菌PCR检测本实施例采用灌溉用水作为检测样品，具体检测步骤为1、样品DNA的提取1. 1、取ImL待检测水样至9mL疱肉液体培养基，封口后应用Mart II厌氧系统 360C 士 1°C培养M小时。1. 2、应用细菌基因组DNA提取试剂盒提取培养产物中细菌DNA。2、PCR 反应2. 1、人工合成产气荚膜梭菌外引物的上下游引物，其中，上游引物F3具有如SEQ No. 1所示的核苷酸序列，下游引物B3具有如SEQ No. 2所示的核苷酸序列。2. 2、PCR 反应体系PCR 反应体系为DNA 聚合酶 0. 05U/ μ L, dATP、dTTP、dGTP、dCTP 各 0. 2mM, MgSO4 2mM, 10% (体积)的10 XDNA聚合酶缓冲液，引物F3和B3各0. 5 μ Μ,模板DNA 1 μ L。2.3、PCR 反应条件应用PCR 仪，PCR 反应条件为95°C 5min，95°C 30s，55°C 30s, 72°C 30s，30 个循 环，72°C 5min，4°C保存。2.4、结果观察将反应液直接进行琼脂糖凝胶电泳，电泳条件为0.5XTBE、2.0%琼脂糖凝胶、 150V电压条件下电泳30min，自动凝胶成像系统下成像观察结果。电泳结果可见与预期分 子量(214bp) —致的明亮片段，说明本实施例样品中存在产气荚膜梭菌。2. 5、结果验证采用常规平板检测方法对样品进行检测，检出产气荚膜梭菌，与PCR检测结果一 致。 实施例2产气荚膜梭菌LAMP快速检测Mg2+浓度测试本实施例采用灌溉用水作为检测样品，具体检测步骤为1、样品DNA的提取1. 1、取ImL待检测水样至9mL疱肉液体培养基，封口后应用Mart II厌氧系统 360C 士 1°C培养M小时。
1. 2、应用细菌基因组DNA提取试剂盒提取培养产物中细菌DNA。2、LAMP快速检测2. 1、人工合成产气荚膜梭菌LAMP检测引物组，外引物的上游引物F3，具有如SEQ No. 1所示的核苷酸序列；外引物的下游引物B3，具有如SEQ No. 2所示的核苷酸序列；内引 物的上游引物FIP，具有如SEQ No. 3所示的核苷酸序列；内引物的下游引物BIP，具有如SEQ No. 4所示的核苷酸序列。2. 2、LAMP 反应体系分别应用不同的Mg2+浓度分别建立6组LAMP反应体系。反应体系的总体积为 25 μ L，各反应体系均包含外引物F3和Β3各0. 2 μ Μ、内引物FIP和BIP 0. 8 μ Μ、甜菜碱溶 液 0. 65MU0% (体积)IOXBstDNA 聚合酶缓冲液、dATP、dTTP、dGTP、dCTP 各 0. 8mM,BstDNA 聚合酶0. 3U/yL，模板DNA 1 μ L ；在6组反应体系中，MgSO4浓度分别采用2. 4mM、3. 2mM、 4mM、4. 8mM、5. 6mM、6. 4mM ；反应体系的剩余体积以无菌超纯水补充。2. 3、LAMP 反应条件应用恒温水浴器，反应条件为反应温度为61°C，反应时间为60min ；终止反应的 温度为80°C，反应时间为6min。2. 4、反应结果观察将反应产物进行电泳分析，电泳条件为0. 5XTBE、2. 0%琼脂糖凝胶、150V电压条 件下电泳30min。图 2 中，泳道 M 为 DNA Marker,泳道 1-6 的 Mg2+ 浓度分别为2. 4mM、3. 2mM、4mM、 4. 8mM、5. 6mM、6. 4mM。从图2中可发现，当Mg2+浓度为4. 8-6. 4mM时，反应结果较为明亮，因 此本发明方法中，Mg2+最优反应浓度为4. 8-6. 4mM。2. 5、结果验证采用常规平板检测方法对样品进行检测，检出产气荚膜梭菌，与LAMP检测结果一 致。实施例3产气荚膜梭菌LAMP快速检测灵敏度测试本实施例采用灌溉用水作为检测样品，具体检测步骤为1、样品DNA的提取1. 1、取ImL待检测水样至9mL疱肉液体培养基，封口后应用Mart II厌氧系统 360C 士 1°C培养M小时。1. 2、应用细菌基因组DNA提取试剂盒提取培养产物中细菌DNA。2、LAMP快速检测2. 1、人工合成产气荚膜梭菌LAMP检测引物组，外引物的上游引物F3，具有如SEQ No. 1所示的核苷酸序列；外引物的下游引物B3，具有如SEQ No. 2所示的核苷酸序列；内引 物的上游引物FIP，具有如SEQ No. 3所示的核苷酸序列；内引物的下游引物BIP，具有如SEQ No. 4所示的核苷酸序列。2. 2、LAMP 反应体系建立9个反应管，反应体系总体积为25 μ L，体系的组成及浓度为外引物F3和Β3 各 0. 2 μ Μ、内引物FIP 和 BIP 0. 8 μ M,MgS04 5. 6mM、甜菜碱 0. 65M、10% (体积)IOXBstDNA 聚合酶缓冲液、dATP、dTTP、dGTP、dCTP各0. 8mM、BstDNA聚合酶0. 3U/ μ L。各反应管还需加入模板DNA液1 μ L，所用模板DNA液浓度分别为IOng/ μ L、lng/ μ L、IOOpg/ μ L、IOpg/ μ L、lpg/ μ L、IOOfg/ μ L、IOfg/ μ L、lfg/ μ L、0. Ifg/ μ L，以测试该检测方法的灵敏度。2. 3、LAMP 反应条件应用恒温水浴器，反应条件为反应温度为61°C，反应时间为60min ；终止反应的 温度为80°C，反应时间为6min。2. 4、反应结果观察将反应产物进行电泳分析，电泳条件为0. 5XTBE、2. 0%琼脂糖凝胶、150V电压条 件下电泳30min。通过对反应产物的电泳分析，当模板DNA液的浓度降至IOfg/ μ L时，仍可见较为 明亮的反应产物。说明本方法的检测灵敏度为10fg/yL。2. 5、结果验证采用常规平板检测方法对样品进行检测，检出产气荚膜梭菌，与LAMP检测结果一 致。实施例4产气荚膜梭菌LAMP快速检测本实施例采用灌溉用水作为检测样品，具体检测步骤为1、样品DNA的提取1. 1、取ImL待检测水样至9mL疱肉液体培养基，封口后应用Mart II厌氧系统 360C 士 1°C培养M小时。1. 2、应用细菌基因组DNA提取试剂盒提取培养产物中细菌DNA。1. 3、同时准备12种非产气荚膜梭菌菌种DNA作为阴性对照。2、LAMP快速检测2. 1、人工合成产气荚膜梭菌LAMP检测引物组，外引物的上游引物F3，具有如SEQ No. 1所示的核苷酸序列；外引物的下游引物B3，具有如SEQ No. 2所示的核苷酸序列；内引 物的上游引物FIP，具有如SEQ No. 3所示的核苷酸序列；内引物的下游引物BIP，具有如SEQ No. 4所示的核苷酸序列。2. 2、LAMP 反应体系反应体系总体积为25 μ L，体系的组成及浓度为外引物F3和Β3各为0. 15μΜ、内 引物 FIP 和 BIP 各为 0·6μΜ、MgSO4 4. 8mM、甜菜碱 0· 6Μ、10 % (体积)IOXBstDNA 聚合酶 缓冲液、dATP、dTTP、dGTP、dCTP 各为 0. 6mM、BstDNA 聚合酶为 0. 2U/ μ L,模板 DNA 为 1 μ L ； 剩余体积以无菌超纯水补充。2. 3、LAMP 反应条件应用恒温水浴器，反应分别采用以下条件进行。2. 3. 1反应温度为59. 5°C，反应时间为50min ；终止反应的温度为80°C，反应时间 为 6min。2. 4、反应结果观察将反应液在6000rpm条件下离心5min，样品管底部呈现明显沉淀，说明本实施例
样品中存在产气荚膜梭菌。图1显示各反应管离心后沉淀情况。其中1号和9号管为待测样品DNA的反应管， 其余12个反应管为非产气荚膜梭菌菌种DNA的反应管。在肉眼观察下，1号和9号管底部呈现明显沉淀，说明本实施例样品中存在产气荚膜梭菌。其余12管底部未呈现沉淀，证明 该方法检测特异性良好。2. 5、结果验证采用常规平板检测方法对样品进行检测，检出产气荚膜梭菌，与LAMP检测结果一 致。 实施例5产气荚膜梭菌LAMP快速检测本实施例采用灌溉用水作为检测样品，具体检测步骤为1、样品DNA的提取1. 1、取ImL待检测水样至9mL疱肉液体培养基，封口后应用Mart II厌氧系统 360C 士 1°C培养M小时。1. 2、应用细菌基因组DNA提取试剂盒提取培养产物中细菌DNA。1. 3、同时准备12种非产气荚膜梭菌菌种DNA作为阴性对照。2、LAMP快速检测2. 1、人工合成产气荚膜梭菌LAMP检测引物组，外引物的上游引物F3，具有如SEQ No. 1所示的核苷酸序列；外引物的下游引物B3，具有如SEQ No. 2所示的核苷酸序列；内引 物的上游引物FIP，具有如SEQ No. 3所示的核苷酸序列；内引物的下游引物BIP，具有如SEQ No. 4所示的核苷酸序列。2. 2、LAMP 反应体系反应体系总体积为25 μ L，体系的组成及浓度为外引物F3和Β3的浓度各为 0. 2 μ Μ、内引物 FIP 和 BIP 为 0. 8 μ M、MgS04 5. 6mM、甜菜碱 0. 65MU0% (体积)IOXBstDNA 聚合酶缓冲液、dATP、dTTP、dGTP、dCTP的浓度各为0. 8mM、BstDNA聚合酶0. 3υ/μ L，模板 DNA IyL;剩余体积以无菌超纯水补充。2. 3、LAMP 反应条件应用恒温水浴器，反应温度为61°C，反应时间为60min ；终止反应的温度为80°C， 反应时间为9min。2. 4、反应结果观察在反应液中加入染料STOR Green I，样品反应管在紫外灯下呈现明显荧光。说明 本实施例样品中存在产气荚膜梭菌。图2显示各反应管在加入STOR Green I后荧光情况。其中1号和2号管为待测 样品DNA的反应管，其余12管为非产气荚膜梭菌菌种DNA的反应管。在肉眼观察下，1号 和2号管呈现明显荧光，说明本实施例样品中存在产气荚膜梭菌。其余12管未呈现明显荧 光，证明该方法检测特异性良好。2. 5、结果验证采用常规平板检测方法对样品进行检测，检出产气荚膜梭菌，与LAMP检测结果一 致。实施例6产气荚膜梭菌LAMP快速检测本实施例采用灌溉用水作为检测样品，具体检测步骤为1、样品DNA的提取1. 1、取ImL待检测水样至9mL疱肉液体培养基，封口后应用Mart II厌氧系统360C 士 1°C培养M小时。1. 2、应用细菌基因组DNA提取试剂盒提取培养产物中细菌DNA。2、LAMP快速检测2. 1、人工合成产气荚膜梭菌LAMP检测引物组，外引物的上游引物F3，具有如SEQ No. 1所示的核苷酸序列；外引物的下游引物B3，具有如SEQ No. 2所示的核苷酸序列；内引 物的上游引物FIP，具有如SEQ No. 3所示的核苷酸序列；内引物的下游引物BIP，具有如SEQ No. 4所示的核苷酸序列。2. 2、LAMP 反应体系反应体系总体积为25 μ L，体系的组成及浓度为外引物F3和Β3各0. 25 μ Μ、内引 物 FIP 和 BIP 1. OyM^MgSO4 6. 4mM、甜菜碱 0. 7Μ、10% (体积)IOXBstDNA 聚合酶缓冲液、 dATP、dTTP、dGTP、dCTP 各 1. OmM, BstDNA 聚合酶 0. 4U/ μ L,模板 DNAl μ L ；剩余体积以无菌 超纯水补充。2. 3、LAMP 反应条件应用恒温水浴器，反应温度为62. 5°C，反应时间为70min ；终止反应的温度为 80°C，反应时间为12min。2. 4、反应结果观察在反应液中加入染料STOR Green I，样品反应管在紫外灯下呈现明显荧光。说明 本实施例样品中存在产气荚膜梭菌。2. 5、结果验证采用常规平板检测方法对样品进行检测，检出产气荚膜梭菌，与LAMP检测结果一 致。实施例7产气荚膜梭菌LAMP快速检测本实施例采用灌溉用水作为检测样品，具体检测步骤为1、样品DNA的提取1. 1、取ImL待检测水样至9mL疱肉液体培养基，封口后应用Mart II厌氧系统 360C 士 1°C培养M小时。1. 2、应用细菌基因组DNA提取试剂盒提取培养产物中细菌DNA。2、LAMP快速检测2. 1、人工合成产气荚膜梭菌LAMP检测引物组，外引物的上游引物F3，具有如SEQ No. 1所示的核苷酸序列；外引物的下游引物B3，具有如SEQ No. 2所示的核苷酸序列；内引 物的上游引物FIP，具有如SEQ No. 3所示的核苷酸序列；内引物的下游引物BIP，具有如SEQ No. 4所示的核苷酸序列。2. 2、LAMP 反应体系反应体系总体积为25 μ L，体系的组成及浓度为外引物F3和Β3各0. 15μΜ、内引 物 FIP 和 BIP 0. 6 μ M^MgSO4 4. 8mM、甜菜碱 0. 6Μ、10% (体积)IOXBstDNA 聚合酶缓冲液、 dATP、dTTP、dGTP、dCTP 各 0. 6mM,BstDNA 聚合酶 0. 2U/ μ L,模板 DNAl μ L。剩余体积以无菌 超纯水补充。2. 3、LAMP 反应条件应用恒温水浴器，反应温度为59. 50C，反应时间为50min。
2. 4、反应结果观察将反应液在6000rpm条件下离心5min，样品管底部呈现明显沉淀。说明本实施例 样品中存在产气荚膜梭菌。2. 5、结果验证采用常规平板检测方法对样品进行检测，检出产气荚膜梭菌，与LAMP检测结果一 致。实施例8产气荚膜梭菌LAMP快速检测本实施例采用灌溉用水作为检测样品，具体检测步骤为1、样品DNA的提取1. 1、取ImL待检测水样至9mL疱肉液体培养基，封口后应用Mart II厌氧系统 360C 士 1°C培养M小时。1. 2、应用细菌基因组DNA提取试剂盒提取培养产物中细菌DNA。2、LAMP快速检测2. 1、人工合成产气荚膜梭菌LAMP检测引物组，外引物的上游引物F3，具有如SEQ No. 1所示的核苷酸序列；外引物的下游引物B3，具有如SEQ No.2所示的核苷酸序列；内引 物的上游引物FIP，具有如SEQ No. 3所示的核苷酸序列；内引物的下游引物BIP，具有如SEQ No. 4所示的核苷酸序列。2. 2、LAMP 反应体系反应体系总体积为25 μ L，体系的组成及浓度为外引物F3和Β3各0. 2μΜ、内引 物 FIP 和 BIP 0. 8 μ M^MgSO4 5. 6mM、甜菜碱 0. 65Μ、10% (体积)10 X BstDNA 聚合酶缓冲液、 dATP、dTTP、dGTP、dCTP 各 0. 8mM、BstDNA 聚合酶 0. 3U/ μ L,模板 DNAl μ L ；剩余体积以无菌 超纯水补充。2. 3、LAMP 反应条件应用恒温水浴器，反应温度为61°C，反应时间为60min。2. 4、反应结果观察在反应液中加入染料STOR Green I，样品反应管在紫外灯下呈现明显荧光。说明 本实施例样品中存在产气荚膜梭菌。2. 5、结果验证采用常规平板检测方法对样品进行检测，检出产气荚膜梭菌，与LAMP检测结果一 致。实施例9产气荚膜梭菌LAMP快速检测本实施例采用灌溉用水作为检测样品，具体检测步骤为1、样品DNA的提取1. 1、取ImL待检测水样至9mL疱肉液体培养基，封口后应用Mart II厌氧系统 360C 士 1°C培养M小时。1. 2、应用细菌基因组DNA提取试剂盒提取培养产物中细菌DNA。2、LAMP快速检测2. 1、人工合成产气荚膜梭菌LAMP检测引物组，外引物的上游引物F3，具有如SEQ No. 1所示的核苷酸序列；外引物的下游引物B3，具有如SEQ No. 2所示的核苷酸序列；内引物的上游引物FIP，具有如SEQ No. 3所示的核苷酸序列；内引物的下游引物BIP，具有如SEQ No. 4所示的核苷酸序列。2. 2、LAMP 反应体系反应体系总体积为25 μ L，体系的组成及浓度为外引物F3和Β3各0. 25 μ Μ、内引 物 FIP 和 BIP 1. OyM^MgSO4 6. 4mM、甜菜碱 0. 7Μ、10% (体积)IOXBstDNA 聚合酶缓冲液、 dATP、dTTP、dGTP、dCTP 各 1. OmM, BstDNA 聚合酶 0. 4U/ μ L,模板 DNAl μ L ；剩余体积以无菌 超纯水补充。2. 3、LAMP 反应条件应用恒温水浴器，反应温度为62. 50C，反应时间为70min2. 4、反应结果观察在反应液中加入染料STOR Green I，样品反应管在紫外灯下呈现明显荧光。说明 本实施例样品中存在产气荚膜梭菌。2. 5、结果验证采用常规平板检测方法对样品进行检测，检出产气荚膜梭菌，与LAMP检测结果一 致。实施例10产气荚膜梭菌LAMP快速检测试剂盒本实施例试剂盒由如下试剂组成1、产气荚膜梭菌LAMP检测引物，包括外引物的上游引物F3，具有如SEQ No. 1所示的核苷酸序列；外引物的下游引物B3，具有如SEQ No. 2所示的核苷酸序列；内引物的上游引物FIP，具有如SEQ No. 3所示的核苷酸序列；内引物的下游引物BIP，具有如SEQ No. 4所示的核苷酸序列；2、BstDNA 聚合酶；3、阳性对照品产气荚膜梭菌的标准菌株的基因组；4、空白对照品无菌超纯水；5、10 X BstDNA聚合酶缓冲液；6、MgSO4 溶液；7、甜菜碱溶液。8、显色剂SYBR Green I ；实施例11产气荚膜梭菌LAMP快速检测试剂盒本实施例试剂盒由如下试剂组成1、产气荚膜梭菌LAMP检测反应液，其具体组成及浓度为外引物F3和B3均0.2 μ M，内引物FIP和BIP 0. 8 μ M, MgSO4 5. 6mM，甜菜碱溶液 0. 65M, 10% (体积)IOXBstDNA 聚合酶缓冲液，dATP、dTTP、dGTP、dCTP 均 0. 8mM,BstDNA 聚 合酶0. 3U/yL;其中，外引物的上游引物F3具有如SEQ No. 1所示的核苷酸序列；外引物的下游引物B3具有如SEQ No. 2所示的核苷酸序列；内引物的上游引物FIP具有如SEQ No. 3所示的核苷酸序列；内引物的下游引物BIP具有如SEQ No. 4所示的核苷酸序列；
2、阳性对照品产气荚膜梭菌基因组DNA ；3、空白对照品无菌超纯水；4、显色剂SYBR Green I。实施例12产气荚膜梭菌LAMP快速检测试剂盒本实施例的试剂盒由如下试剂组成1、产气荚膜梭菌LAMP检测反应液，其具体组成及浓度为外引物F3和B3均0. 15 μ M，内引物FIP和BIP 0. 6 μ MjMgSO4 4. 8mM，甜菜碱溶液 0. 6M, 10% (体积)IOXBstDNA 聚合酶缓冲液，dATP、dTTP、dGTP、dCTP 均 0. 6mM、BstDNA 聚 合酶0. 2U/yL;其中，外引物的上游引物F3具有如SEQ No. 1所示的核苷酸序列；外引物的下游引物B3具有如SEQ No. 2所示的核苷酸序列；内引物的上游引物FIP具有如SEQ No. 3所示的核苷酸序列；内引物的下游引物BIP具有如SEQ No. 4所示的核苷酸序列；2、阳性对照品产气荚膜梭菌基因组DNA ；3、空白对照品无菌超纯水；实施例13产气荚膜梭菌LAMP快速检测试剂盒本实施例的试剂盒由如下试剂组成1、产气荚膜梭菌LAMP检测反应液，其具体组成及浓度为外引物F3禾口 B3均0.25 μ M，内引物FIP禾口 BIP 1. OyMjMgSO4 6. 4mM，甜菜碱溶液 0. 7M, 10% (体积)IOXBstDNA 聚合酶缓冲液，dATP、dTTP、dGTP、dCTP 均 1. OmM, BstDNA 聚 合酶0. 4U/yL;其中，外引物的上游引物F3具有如SEQ No. 1所示的核苷酸序列；外引物的下游引物B3具有如SEQ No. 2所示的核苷酸序列；内引物的上游引物FIP具有如SEQ No. 3所示的核苷酸序列；内引物的下游引物BIP具有如SEQ No. 4所示的核苷酸序列；2、阳性对照品产气荚膜梭菌基因组DNA ；3、空白对照品无菌超纯水。
权利要求
1.一种产气荚膜梭菌的检测引物组，其特征是其外引物的上游引物具有如SEQ No. 1 所示的序列，其外引物的下游引物具有如SEQ No. 2所示的序列；其内引物的上游引物具有 如SEQ No. 3所示的序列，其内引物的下游引物具有如SEQ No. 4所示的序列。
2.一种使用权利要求1所述的引物组对产气荚膜梭菌进行快速检测的方法，其特征 是利用所述引物组对待测样品的DNA进行LAMP反应，反应结束后对反应液进行阴阳性判 定。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征是所述LAMP反应按以下第一种方案或第二种 方案进行第一种方案所述LAMP反应在59. 5-62. 5°C下反应50_70min ；第二种方案所述LAMP反应包含以下步骤(1)先在59. 5-62. 5°C下反应 50_70min ；(2)后在80°C下反应6-12min。
4.根据权利要求2或3所述的方法，其特征是在进行所述LAMP反应的反应液中，包含 浓度均为0. 15-0. 25 μ M的所述外引物的上游引物和下游引物、浓度均为0. 6-1. 0μ M的所 述内引物的上游引物和下游引物，浓度为0. 6-0. 7Μ的甜菜碱，浓度为4. 8-6. 4mM的MgS04， 10% (体积)的IOXBstDNA聚合酶缓冲液，浓度为0. 2-0. 4U/ μ L的BstDNA聚合酶，各浓 度为0. 6-1. OmM的三磷酸鸟嘌呤脱氧核苷酸、三磷酸腺嘌呤脱氧核苷酸、三磷酸胸腺嘧啶 脱氧核苷酸和三磷酸胞嘧啶脱氧核苷酸。
5.一种使用权利要求1所述引物组的快速检测试剂盒，其特征在于包括所述引物组、 阳性对照品、BstDNA聚合酶、IOXBstDNA聚合酶缓冲液、MgSO4溶液和甜菜碱溶液和无菌超 纯水，所述阳性对照品为产气荚膜梭菌的基因组DNA。
6.一种使用权利要求1所述引物组的快速检测试剂盒，其特征在于在其LAMP反应液 中包含有所述引物组、BstDNA聚合酶、10 XBstDNA聚合酶缓冲液、MgSO4溶液、甜菜碱溶液 和无菌超纯水的混合液，所述外引物的上游引物和下游引物的度均为0. 15-0. 25μΜ，内引 物的上游引物和下游引物的浓度均为0. 6-1. 0 μ Μ,甜菜碱的浓度为0. 6-0. 7Μ，MgSO4的浓 度为4. 8-6. 4mM, IOXBstDNA聚合酶缓冲液与所述混合液的体积比为10%，BstDNA聚合酶 0. 2-0. 4U/μ L，三磷酸鸟嘌呤脱氧核苷酸、三磷酸腺嘌呤脱氧核苷酸、三磷酸胸腺嘧啶脱氧 核苷酸和三磷酸胞嘧啶脱氧核苷酸的浓度各为0. 6-1. OmM。
全文摘要
本发明公开一种产气荚膜梭菌检测方法及其引物组和检测试剂盒。该引物组是基于环介导等温扩增技术(LAMP)，根据产气荚膜梭菌特有的α毒素(C.perfringensalphatoxin，CPa)基因序列分析设计并人工合成获得，包含的核苷酸序列如SEQ No.1-4所示，该引物组对产气荚膜梭菌具有很高特异性。该产气荚膜梭菌快速检测方法利用上述检测引物组对样品中产气荚膜梭菌DNA进行LAMP反应，通过对反应产物的鉴定来判断样品中是否含有产气荚膜梭菌。本发明还依据上述检测方法设计了产气荚膜梭菌快速检测试剂盒，可对样品进行快速、简便、准确、高效的产气荚膜梭菌检测鉴定。
文档编号C12Q1/68GK102134590SQ20101059069
公开日2011年7月27日 申请日期2010年12月7日 优先权日2010年12月7日
发明者姜侃, 张东雷, 金燕飞, 陈小珍, 鲁燕骅 申请人:浙江省质量技术监督检测研究院