专利名称：一种转录因子活性检测方法及试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明属于生化与分子生物学科领域，更具体地说它是一种转录因子活性检测方法，本发明还涉及该转录因子活性检测方法所用的试剂盒。
背景技术：
在同一条核酸链上起调控基因表达作用的核酸序列称为顺式作用元件，包括启动子、增强子、衰减子等；转录因子也称反式作用因子，是指作用于顺式作用元件从而能够对不同核酸链上的基因表达起调控作用的蛋白质。转录因子要发挥作用，必须具有一定的活性，这依赖于转录因子的数量及其与顺式作用元件结合的亲和力。检测转录因子的活性，对于阐明某个基因的表达调控机制，具有重要意义，因而被广泛应用于生物学和医学研究中。
目前，用于检测转录因子活性的常用方法主要有四种一，凝胶电泳迁移率改变分析，(electrophoretic mobility shift assay，EMSA)，又称凝胶滞留分析(gel retarding assay，gel shift assay)。在这种实验中，细胞提取物与放射性标记的含有某转录因子特定结合序列的双链寡核苷酸探针共孵育，活化的转录因子可与对应的探针在体外结合后，上样到非变性聚丙烯酰胺凝胶中电泳，最后进行放射自显影显色。结果会出现两条带，一条是迁移得快的，对应于游离探针，一条是滞留条带，对应于活化转录因子与探针形成的复合体。当然，其反应的特异性需要另外通过抗体和突变型寡核苷酸探针的竞争实验来验证；这种方法虽然敏感，但不适于大规模检测，而且需要接触放射性元素；二，报告基因分析(reporter gene assay)，将报告基因(一般是荧光素酶或β-半乳糖苷酶)构建在特定的转录因子结合的启动子下，通过报告基因的表达水平间接反映转录因子的活性。只要细胞转染的效率高，这种方法还是比较敏感的，借助于荧光酶标仪，还可同时进行大规模检测；但是在这种情况下，其他转录因子也可能影响报告基因的表达水平，反应的特异性受到影响；而且，由于是通过表达的荧光素酶的活性来间接反映转录因子的活性，势必会受到下游过程如转录、翻译等的影响。三、用抗体原位检测转录因子的核转位，但这是一种定性的方法，不适于大规模检测。四，对某些转录因子，如NF-κB，还可用western blot检测其胞浆抑制蛋白(IκB)的降解情况，间接反映转录因子的活性，也不适于大规模检测。
以上方法虽然在基因转录调控的研究中发挥了十分重要的作用，但由于都不具备快速、简便、高通量的特点，转录调控的研究依然开展的十分有限。
基于ELISA技术的转录因子活性检测方法，是近几年发展起来的一种全新的转录因子活性检测技术。该方法首先被Gubler，M.L等建立，随后被Patricia Renard等改进。该方法利用了传统ELISA的原理，与之不同的是，被检测蛋白质不是被抗体俘获，而是被固定在酶标板上的包含转录因子特定结合序列的双链寡核苷酸探针俘获。用于检测转录因子的一抗识别活化的与靶DNA连接的转录因子。再通过二抗IgG耦联物和显色反应，得到定量的结果。
在这个技术中，双链寡核苷酸探针的设计构建是个关键。这个探针通常是生物素标记的，需要固定在亲和素包被的酶标板上。在这个探针序列中，转录因子特定的结合序列(转录因子为双链DNA结合蛋白，一般在20个碱基对左右)自然是必不可少的，但仅仅有这个结合序列是远远不够的，因为不能够给转录因子复合物与探针的作用留下足够的空间，这会降低检测的灵敏度甚至导致不能检测。因此在探针的非转录因子作用端加上一段序列(连接序列，linker)是必要的。但加上的这段双链序列却很有可能与原有的转录因子特定结合序列之间构成新的转录因子结合元件，增加某些其他未知转录因子的结合机会，也会增加所要检测的目的转录因子与连接序列之间的非特异性结合，干扰特异性的检测，降低检测的灵敏度，甚至导致检测失败；为了解决这个问题，Patricia Renard等的处理方法是把连接序列设计成随机序列，使每一种特定序列的探针浓度都非常低，即使存在某些其他未知转录因子结合的干扰，也达不到影响检测的水平。但这时候，因为人工合成的单链探针序列是随机的，无法直接与某一特定序列的互补单链褪火聚合成双链，因此，还需要设计一对引物，通过PCR反应扩增得到双链探针，再经纯化，得到检测所需的双链DNA探针。整个探针的制备过程比较复杂，价格昂贵(因为短链PCR反应的困难性，随机序列的长度一般在100bp左右，整个探针序列长度在140bp左右，长链寡核苷酸探针的合成不仅昂贵得多，而且国内许多DNA合成公司不能保证质量，短链DNA探针的纯化还需一些进口的专用纯化装置)，国外开发的试剂盒(如Active Motif公司)昂贵，限制了在国内开展、普及这个技术用于科学研究。即便如此，这种探针还并不能有效减少所要检测的目的转录因子与连接序列之间的非特异性结合，这可导致检测的背景加深。
发明内容
本发明的目的在于克服上述ELISA技术中转录因子活性检测方法的不足之处而提供一种转录因子活性检测方法。该方法是基于ELISA检测方法的改进，其特别之处是采用一种新的双链寡核苷酸探针构建，以克服ELISA检测方法双链寡核苷酸探针的设计构建所带来的不足。
本发明的另一个目的是提供一种含有上述双链寡核苷酸探针检测的试剂盒。
本发明的目的是通过如下措施来达到的一种转录因子活性检测方法，它至少包括以下步骤①细胞培养、细胞总蛋白的提取；②将双链寡核苷酸探针1或2固定在亲和素包被的酶标板上将2pmol双链寡核苷酸探针1或2溶解在50ulPBS中，加入到亲和素包被的酶标板小孔中，37℃，孵育1小时后，PBS+0.1％Tween-20洗涤2次，PBS洗1次；③将提取的总蛋白与双链寡核苷酸探针1或2结合每孔加入20μl总蛋白及30μl binding buffer[4mM HEPES pH7.5，100mM KCl，8％glycerol，5mM DTT，0.2％BSA，40μg/ml鲑精DNA]，室温振荡80rpm，孵育1小时后，PBS+0.1％Tween-20洗涤3次；④将转录因子特异性第一抗体，结合到转录因子-探针复合物上每孔加入用PBS+0.1％BSA作1∶1000稀释的转录因子特异性第一100μl，室温孵育1小时后，PBS+0.1％Tween-20洗涤3次；⑤将HRP标记的二抗IgG结合到转录因子特异性第一抗体-转录因子-探针DNA复合物上每孔加入用PBS+0.1％BSA作1∶10000稀释的HRP标记的二抗Ig-G100μl，室温孵育1小时后，PBS+0.1％Tween-20洗涤4次；⑥显色反应每孔加入四甲基联苯胺(tetramethylbenzidine，TMB)使用液100μl，10分钟后加入终止液2MH2SO450μl，450nm处读数，655nm作参照；⑦空白对照设置在第③步中，每孔不加入20μl总蛋白，而是加入20μl裂解缓冲液Lysis Buffer，其余过程完全相同。所有最后的结果表达为酶标仪上读数(OD值)减去空白对照所得的差值；所述双链寡核苷酸探针1或2是按以下方法制备的第一链含转录因子特定结合序列2个拷贝，5’-转录因子特定结合序列-转录因子特定结合序列-C-(C)N-C-3’，此链3’端作生物素标记，N为正整数；第二链含转录因子特定结合序列1个拷贝，5’-转录因子特定结合序列-C-(C)N-C-3’，此链3’端作生物素标记，N为正整数；第三链转录因子特定结合序列反义链，5’-转录因子特定结合序列-3’；以上三条链中，第二链与第三链、第一链与第三链分别按1∶1、1∶2摩尔数比进行混合，置94℃水浴锅变性10分钟后取出，使其褪火过夜，聚合成双链即为探针1、探针2。
在上述技术方案中，所述第一链、第二链长链的单链部分可为单一碱基“A”、“T”、“G”、“C”中的一种。
在上述技术方案中，所述第一链、第二链为58个碱基，第三链为22个碱基；在上述技术方案中，所述检测NF-κB双链寡核苷酸探针1或2的制备方法为第一链含NF-κB结合序列2个拷贝，共58个碱基，5’-AGTTGAGGGGACTTTCCCAGGC-AGTTGAGGGGACTTTCCCAGGC-C-(C)12-C-3’，此链3’端作生物素标记；第二链含NF-κB结合序列1个拷贝，58个碱基，5’-AGTTGAGGGGACTTTCCCAGGC-C-(C)34-C-3’，此链3’端作生物素标记；第三链NF-κB结合序列反义链，22个碱基，5’-GCCTGGGAAAGTCCCCTCAACT-3’；上述三条链中，第二链与第三链、第一链与第三链分别按1∶1、1∶2摩尔数比进行混合，置94℃水浴锅变性10分钟后取出，使其褪火过夜，聚合成双链即为探针1(D1W，含1个拷贝双链探针)、探针2(D2W，含2个拷贝双链探针)。
上述转录因子活性检测方法所用的试剂盒，它包括亲和素包被的酶表板、生物素标记的探针、磷酸盐缓冲液(PPS)、结合缓冲液(bindingbuffer)、一抗、HPR标记的二抗、显色剂、终止液、洗剂缓冲液，所述探针为上述方法合成的探针1或2。
上述转录因子活性检测方法所用的试剂盒，所述结合缓冲液(bindingbuffer)的包括4mM HEPES pH7.5，100mM KCl，8％ glycerol，5mMDTT，0.2％BSA，40μg/ml鲑精DNA。
本发明方法的这种探针设计中，没有采取随机序列，全部为已知序列，可以直接与互补链褪火生成双链探针，而不需经PCR反应得到，褪火生成的双链探针也不需纯化，可直接用于检测用，转录因子与探针的结合以及转录因子与抗体的结合藕连在一起，一步到位，不需要另外进行转录因子的特异性鉴定；整个过程简便、廉价，并且得到的是定量的结果，适于大规模推广和应用。
本发明长链的单链部分设计为单一碱基“C”，只是单链中的一种，实际上可为任意单链序列，但为了检测的统一性和稳定性，设定为多聚“C”序列。
本发明方法灵敏、特异性高，不仅适于NF-κB活性的检测，也同样适于其他转录因子活性的大批量检测，无需接触放射性物质。该方法可直接应用于科学研究；以该方法为基础，可开发出转录因子活性检测试剂盒，作为商品。
图1为本发明所述探针1的模式图；图2为本发明所述探针2的模式图；图3基于ELISA技术的转录因子活性传统检测方法模式图；
图4为本发明转录因子活性检测方法模式图；图5为野生型(D1W)与突变型双链探针(D1M)检测结果比较(n＝3)；图6为图5中蛋白浓度梯度下NF-κB活性的线性关系图(n＝3)；图7为一个拷贝(D1W)与两个拷贝(D2W)野生型双链探针检测结果及比较(n＝3)。
具体实施例方式
下面结合附图详细说明本发明的实施情况本发明以NF-κB为突破点，采用一种新的双链寡核苷酸探针构建，即合成一长一短两条寡核苷酸片断，长片断除包含转录因子的特异结合序列外，另还加上足够的单链DNA序列，短链就是转录因子的特异结合序列的互补序列，将这一长一短两条寡核苷酸片断等量混合，加热褪火后可聚合成一种既有单链DNA部分，又有双链DNA部分的寡核苷酸探针，可直接用于检测。其中，双链DNA部分为转录因子的特异结合序列，单链DNA部分为连接序列；已知细胞内转录因子为双链DNA结合蛋白，单链连接序列不会增加其他未知转录因子的干扰；增殖期细胞核内存在的极少量单链DNA结合蛋白只可能与单链DNA部分结合，不会影响到探针的双链部分与所要检测的目的转录因子之间的结合；而且，因为连接序列为单链DNA，有效避免了目的转录因子与连接序列之间的非特异性结合，也大大降低了其他未知转录因子干扰的机会和非特异性结合。经实践证明，其检测的灵敏性和特异性很高，而且整个过程简单，廉价得多，适于大规模开展和推广。
具体实施技术方案一、主要试剂和材料人脐静脉内皮细胞株(ECV304)，购自武汉大学中国典型培养物保藏中心(CCTCC，China Center for Type Culture Collection)；
BCA试剂(pierce公司)人重组IL-1β，Calbiochem-Novabiochem Corporation La Jolla，CA92039-2087；高速冷冻离心机，3K18，Sigma Laborzentrifugen GmbH，Postfach1713-D-37507 Osterode am Harz；单链寡核苷酸片段由上海生工生物工程技术有限公司合成；小鼠NF-κB P65单克隆抗体，Santa Cruz；HRP标记的羊抗小鼠IgG，Santa Cruz；链亲和素包被的96孔板，streptavidin-coated 96-well plate，Roche Diagnostics GmbH，Manheim，Germany；Roche DiagnosticsCorporation，Indianapolis，IN，USA；四甲基联苯胺(tetramethylbenzidine，TMB，上海丽珠东风生物技术有限公司)；酶标仪(TECAN，Sunrise Remote/Touch Screen，Austria)；二、实验程序1.细胞培养人脐静脉内皮细胞株(ECV304)采用含10％FBS的M199培养基进行培养，取处于对数生长期的细胞用于实验；实验组于终止培养前30分钟加入人重组IL-1β，终浓度为5ng/ml，对照组不加入人重组IL-1β。
2.细胞总蛋白的提取参照(Patricia Renard，Isabelle Ernest，Andrée Houbion，Muriel Art，Hervé Le Calvez，Martine Raes and JoséRemacle，Development of a sensitive multi-well colorimetric assayfor active NFκB，Nucleic Acids Research，2001，Vol.29，No.4 e21)等的方法提取细胞总蛋白。具体为IL-1β处理30分钟后，弃去培养基，预冷PBS洗2次后收集细胞，1000rpm离心10分钟，弃上清，将细胞团重悬在Lysis Buffer(20mM HEPES pH7.5，0.35M NaCl，20％ glycerol，1％NP-40，1nM MgCl2·6H2O，0.5mM EDTA，0.1mM EGTA)，临用时加入蛋白酶抑制剂(cocktail)；置冰上10分钟后，14000rpm，离心20分钟，收集上清，取少量以BCA法进行蛋白定量，余置-85℃保存。
3.双链寡核苷酸探针的制备单链寡核苷酸片段由上海生工生物工程技术有限公司合成，共5条链，依此为第一链含NF-κB结合序列2个拷贝，共58个碱基，5’-AGTTGAGGGGACTTTCCCAGGC-AGTTGAGGGGACTTTCCCAGGC-C-(C)12-C-3’，此链3’端作生物素标记；第二链含NF-κB结合序列1个拷贝，58个碱基，5’-AGTTGAGGGGACTTTCCCAGGC-C-(C)34-C-3’，此链3’端作生物素标记；第三链NF-κB结合序列反义链，22个碱基，5’-GCCTGGGAAAGTCCCCTCAACT-3’；第四链突变链，将NF-κB结合序列中“GGG”突变为“CTC”，共58个碱基，5’-AGTTGAGCTCACTTTCCCAGGC-C-(C)34-C-3’，此链3’端作生物素标记；第五链突变链反义链，22个碱基，5’-GCCTGGGAAAGTGAGCTCAACT-3’；以上5条链中，第二链与第三链、第一链与第三链、第四链与第五链分别按1∶1、1∶2、1∶1摩尔数比进行混合，置94℃水浴锅变性10分钟后取出，使其褪火过夜，聚合成双链，分别作为探针1(D1W，含1个拷贝双链探针)、探针2(D2W，含2个拷贝双链探针)、突变探针(D1M)，其对应的单链探针分别记为S1W(第二链)，S2W(第一链)，S1M(第四链)；4.将探针固定在亲和素包被的酶标板上将2pmol探针溶解在50ulPBS中，加入到亲和素包被的酶标板小孔中，37℃，孵育1小时后，PBS+0.1％Tween-20洗涤2次，PBS洗1次；5.将提取的总蛋白与探针结合每孔加入20μl总蛋白及30μlbinding buffer[4mM HEPES pH7.5，100mM KCl，8％ glycerol，5mMDTT，0.2％BSA，40μg/ml鲑精DNA]，室温振荡80rpm孵育1小时后，PBS+0.1％Tween-20洗涤3次；6.将一抗(anti-NFκBp65)结合到NF-κB-DNA复合物上每孔加入用PBS+0.1％BSA作1∶200稀释的anti-NF-κBp65 100μl，室温孵育1小时后，PBS+0.1％Tween-20洗涤3次；7.将HRP标记的二抗(Ig-G)结合到anti-NF-κBp65-NF-κB-DNA复合物上每孔加入用PBS+0.1％BSA作1∶10000稀释的HRP标记的二抗(Ig-G)100μl，室温孵育1小时后，PBS+0.1％Tween-20洗涤4次；8.显色反应每孔加入四甲基联苯胺(tetramethylbenzidine，TMB)使用液100μl，10分钟后加入终止液(2MH2SO4)50μl，450nm处读数，655nm作参照；9.空白对照设置在第5步中，每孔不加入20μl总蛋白，而是加入20μl裂解缓冲液(Lysis Buffer)，其余过程完全相同。所有最后的结果表达为酶标仪上读数(OD值)减去空白对照所得的差值。
实验结果1.野生型(D1W)与突变型双链探针(D1M)检测结果比较以野生型双链探针D1W检测时，与对照组相比，在各浓度下，从IL-1β刺激组检测到的NF-κB活性显著性升高(P＜0.01，n＝3)，并呈梯度增加；将活化NF-κB结合序列中的核心序列“GGG”突变成“CTC”后，对照组与IL-1β刺激组的OD值均在一个极低的水平，在各个蛋白浓度水平，两者之间没有显著性差异(P＞0.05，n＝3)；(如图5)对以上结果作线性图如下(如图6)经线性相关分析，当蛋白浓度在2μg--10μg/well时，无论是对照组，还是IL-1β刺激组，所测得的NF-κB活性都表现出很好的直线线性拟合关系，当蛋白浓度高于10μg/well时，所测得的NF-κB活性逐渐趋于饱和状态，达到一个平台。
2.一个拷贝(D1W)与两个拷贝(D2W)野生型双链探针检测结果及比较与对照组相比，在各浓度下，IL-1β刺激组均使检测到的NF-κB活性显著升高(P＜0.01，n＝3)，并呈梯度增加；探针D1W与D2W检测的结果相比，无显著性差异(P＞0.05，n＝3)；(见图7)在基于ELISA技术的转录因子活性检测中，本研究对之进行了改进，首次将探针设计成一长一短两条在一端互补的单链，经褪火而得到；以野生型双链探针检测时，在各浓度下，从IL-1β刺激组检测到的NF-κB活性显著性升高，并呈梯度增加；将活化NF-κB结合序列中的核心序列“GGG”突变成“CTC”后，从对照组与IL-1β刺激组检测到的NF-κB活性均在一个极低的水平，在各个蛋白浓度水平，两者之间没有显著性差异，这些都表明这种检测具有很高的灵敏度和检测特异性，与酶标板相连的连接序列保持单链，有效避免了非特异性结合的干扰，说明这种设计的探针是可以用于转录因子活性检测的。含一个拷贝与两个拷贝结合序列的探针的检测效果是相同的。线性相关分析显示，当蛋白浓度在2μg--10μg/well时，所检测到的NF-κB活性表现出很好的直线线性关系，说明，在此蛋白浓度范围内检测NF-κB活性能够做到准确定量，结果是有可比性的，其中以蛋白浓度为5μg/well为最佳；当蛋白浓度高于10μg/well时，所测得的NF-κB活性逐渐趋于饱和状态，达到一个平台，说明，在此蛋白浓度范围内检测NF-κB活性不够准确，不宜进行定量比较。
由于在这种探针的设计中，没有采取随机序列，全部为已知序列，可以直接与互补链褪火生成双链探针，而不需经PCR反应得到，褪火生成的双链探针也不需纯化，可直接用于检测用；转录因子与探针的结合以及转录因子与抗体的结合藕连在一起，一步到位，不象EMSA需要另外进行转录因子的特异性鉴定；整个过程简便、廉价得多，并且得到的是定量的结果，适于大规模推广和应用。
在本研究中，将长链的单链部分设计为单一碱基“C”，只是单链中的一种，实际上可为任意单链序列，但为了检测的统一性和稳定性，设定为多聚“C”序列。
本研究受国家自然科学基金项目No.30200099的资助。
需要说明的是对于所属领域的技术人员来说，在不改变本发明原理的前提下还可以对本发明作出若干的改变或变形，这同样属于发明的保护范围。
序列表<110>华中科技大学同济医学院<120>一种转录因子活性检测方法及试剂盒<150>优先权号CN200410012631.1<151>优先权日2004-01-08<160>5<210>1<211>58<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>Promoter<222>(1)…(22)<223>(23)…(58)之间的序列是根据大小和极性而设计，以用作转录因子特异结合序列与酶标板之间的接头，3’端作生物素标记。
<400>1agttgagggg actttcccag gccccccccc cccccccccc cccccccccc cccccccc 58<210>2<211>58<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>Promoter<222>(1)…(22)<220>
<221>Promoter<222>(23)…(44)<223>(45)…(58)之间的序列是根据大小和极性而设计，以用作转录因子特异结合序列与酶标板之间的接头，3’端作生物素标记。
<400>2agttgagggg actttcccag gcagttgagg ggactttccc aggccccccc cccccccc 58<210>3<211>22<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>Promoter<222>(1)…(22)<400>3gcctgggaaa gtcccctcaa ct22<210>4<211>58
<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>mutation<222>(8，9，10)<223>(23)…(58)之间的序列是根据大小和极性而设计，以用作转录因子特异结合序列与酶标板之间的接头，3’端作生物素标记。
<400>4agttgagctc actttcccag gccccccccc cccccccccc cccccccccc cccccccc58<210>5<211>22<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>mutation<222>(13，14，15)<400>5gcctgggaaa gtgagctcaa ct2权利要求
1.一种转录因子活性检测方法，它至少包括以下步骤①细胞培养、细胞总蛋白的提取，②将双链寡核苷酸探针1或2固定在亲和素包被的酶标板上将2pmol双链寡核苷酸探针1或2溶解在50ulPBS中，加入到亲和素包被的酶标板小孔中，37℃，孵育1小时后，PBS+0.1％Tween-20洗涤2次，PBS洗1次；③将提取的总蛋白与双链寡核苷酸探针1或2结合每孔加入20μl总蛋白及30μl binding buffer，室温振荡80rpm，孵育1小时后，PBS+0.1％Tween-20洗涤3次；④将一抗转录因子抗体，结合到转录因子-探针复合物上每孔加入用PBS+0.1％BSA作1∶200稀释的转录因子抗体100μl，室温孵育1小时后，PBS+0.1％ Tween-20洗涤3次；⑤将HRP标记的二抗Ig-G结合到转录因子抗体-转录因子-探针复合物上每孔加入用PBS+0.1％BSA作1∶10000稀释的HRP标记的二抗Ig-G100μl，室温孵育1小时后，PBS+0.1％Tween-20洗涤4次；⑥显色反应每孔加入四甲基联苯胺，使用液100μl，10分钟后加入终止液2MH2SO450μl，450nm处读数，655nm作参照；⑦空白对照设置在第③步中，每孔不加入20μl总蛋白，而是加入20μl裂解缓冲液Lysis Buffer，其余过程完全相同。所有最后的结果表达为酶标仪上读数OD值减去空白对照所得的差值；其特征在于所述双链寡核苷酸探针1或2是按以下方法制备的第一链含转录因子特定结合序列2个拷贝，5’-转录因子特定结合序列-转录因子特定结合序列-C-(C)N-C-3’，此链3’端作生物素标记；第二链含转录因子特定结合序列结合序列1个拷贝，58个碱基，5’-转录因子特定结合序列-C-(C)N-C-3’，此链3’端作生物素标记；第三链转录因子特定结合序列结合序列反义链，22个碱基，5’-转录因子特定结合序列-3’；以上三条链中，第二链与第三链、第一链与第三链分别按1∶1、1∶2摩尔数比进行混合，置94℃水浴锅变性10分钟后取出，使其褪火过夜，聚合成双链即为探针1、探针2。
2.根据权利要求1所述的一种转录因子活性检测方法，其特征在于所述第一链、第二链的长链的单链DNA部分可为单一碱基“A”、“T”、“G”、“C”中的一种。
3.根据权利要求1或2所述的一种转录因子活性检测方法，其特征在于所述第一链、第二链为58个碱基，第三链为22个碱基。
4.根据权利要求3所述的一种转录因子活性检测方法，其特征在于所述检测NF-κB双链寡核苷酸探针的制备方法为第一链含NF-κB结合序列2个拷贝，共58个碱基，5’-AGTTGAGGGGACTTTCCCAGGC-AGTTGAGGGGACTTTCCCAGGC-C-(C)12-C-3’，此链3’端作生物素标记；第二链含NF-κB结合序列1个拷贝，58个碱基，5’-AGTTGAGGGGACTTTCCCAGGC-C-(C)34-C-3’，此链3’端作生物素标记；第三链NF-κB结合序列反义链，22个碱基，5’-GCCTGGGAAAGTCCCCTCAACT-3’；上述三条链中，第二链与第三链、第一链与第三链分别按1∶1、1∶2摩尔数比进行混合，置94℃水浴锅变性10分钟后取出，使其褪火过夜，聚合成双链即为探针1、探针2。
5.上述转录因子活性检测方法所用的试剂盒，它包括亲和素包被的酶表板、生物素标记的探针、磷酸盐缓冲液(PPS)、结合缓冲液(bindingbuffer)、一抗、HPR标记的二抗、显色剂、终止液、洗剂缓冲液，其特征在于所述探针为上述方法合成的探针1或2。
6.根据权利要求5所述转录因子活性检测方法所用的试剂盒，其特征在于所述结合缓冲液(binding buffer)的包括4mM HEPES pH 7.5，100mM KCl，8％glycerol，5mM DTT，0.2％BSA，40μg/ml鲑精DNA。
全文摘要
一种转录因子活性检测方法及试剂盒，该方法是基于ELISA检测方法的改进，其特别之处是采用一种新的双链寡核苷酸探针构建，以克服ELISA检测方法双链寡核苷酸探针的设计构建所带来的不足。实验证明，本发明检测方法达到了很高的灵敏度和检测特异性，说明这种设计的探针是完全可以用于转录因子活性检测的，含一个拷贝与两个拷贝结合序列的探针的检测效果是相同的。本发明还涉及这种转录因子活性检测方法所用的试剂盒。
文档编号G01N33/531GK1637417SQ200410060138
公开日2005年7月13日 申请日期2004年7月2日 优先权日2004年1月8日
发明者金肆, 陆德琴, 叶仕桥, 叶红, 朱莉萍, 冯作化, 胡清华, 刘声远, 王迪浔 申请人:华中科技大学同济医学院