用于检测nk细胞活性的试剂盒的制作方法
【专利摘要】本实用新型公开了一种用于检测NK细胞活性的试剂盒，包括盒体、盒盖和设置在盒体内的衬垫，所述衬垫上设有小孔，装有荧光标记CD69单克隆抗体的试剂管、装有荧光标记CD56单克隆抗体的试剂管、装有荧光标记CD3单克隆抗体的试剂管、装有荧光标记HLA-DR单克隆抗体的试剂管、装有荧光标记CD45单克隆抗体的试剂管、装有红细胞裂解液的试剂管和装有PBS缓冲液的试剂管被设置在所述小孔内。该试剂盒结构简单、设计合理，使用程序简单，对实验室条件要求不高，便于技术广泛推广。
【专利说明】用于检测NK细胞活性的试剂盒
【技术领域】
[0001]本实用新型属于免疫学【技术领域】，涉及一种用于检测NK细胞活性的试剂盒。
【背景技术】
[0002]人的免疫系统中，T淋巴细胞担负着免疫的主要功能，细胞毒性T淋巴细胞是一种特异的T淋巴细胞，它在抵御肿瘤形成、病毒疾病感染过程中发挥着重要的作用。细胞毒性T淋巴细胞在发挥杀伤作用时，T细胞受体要识别抗原提呈细胞或者靶细胞上的MHC分子所提成的抗原肽，在这个过程中，T细胞受体不仅需要识别抗原肽，还需要识别与抗原肽结合的MHC分子类型，此现象即MHC限制。但是，多数的肿瘤细胞以及部分病毒感染细胞为了逃逸机体的免疫监视，其细胞表面的MHC分子表达通常都明显下调甚至消失(被称为“缺失自己”)，这时T淋巴细胞就无法发挥作用。
[0003]20世纪70年代初学者在研究T细胞对靶细胞特异性杀伤时发现了 NK细胞(自然杀伤细胞)，NK细胞的主要活性也是杀伤肿瘤细胞和病毒感染细胞，但它介导天然免疫应答，不依赖抗体和补体，就能立即杀灭肿瘤细胞和病毒感染细胞。NK细胞活性可作为判断机体抗肿瘤和抗病毒感染的指标之一，检测NK细胞活性可以协助一些疾病的诊断，监测患者的免疫状态。
[0004]目前检测NK细胞活性的方法主要有:
[0005]一、LDH释放法:活细胞的胞浆内含有LDH。正常情况下，LDH不能透过细胞膜，当细胞受到NK细胞的杀伤后，LDH释放到细胞外。LDH可使乳酸锂脱氢，进而使NAD还原成NADH，后者再经递氢体吩嗪二甲酯硫酸盐(PMS)还原碘硝基氯化四氮唑(INT)，INT接受H +被还原成紫红色甲月赞类化合物，在酶标仪上用490nm比色测定；
[0006]二、MTT还原法:本法根据细胞代谢活动与活细胞数直接成比例的原理，通过测定靶细胞代谢活性的减少来反映效应细胞所致靶细胞的死亡。氧化型MTT进入细胞后被线粒体脱氢酶还原生成蓝色formazan颗粒，经溶剂溶解后比色定量，其颜色深浅直接与活细胞数有关，与靶细胞对照孔比较可计算效应细胞杀伤靶细胞的百分比；
[0007]三、同位素释放法:将用同位素3H_TdR标记的靶细胞与淋巴细胞共同培养时，靶细胞可被NK细胞杀伤。同位素便从被杀伤的靶细胞中释放出来，其释放的量与NK细胞活性成正比。通过测定靶细胞3H-TdR的释放率即可反应NK细胞的活性；
[0008]四、流式细胞术:将pEGFP-Nl质粒转染人NK细胞的天然靶细胞K562，经过G418筛选后进一步单克隆，得到稳定、均一表达绿色荧光蛋白的EGFP-K562细胞，将EGFP-K562细胞与人外周血单个核细胞按10: I的比例混合孵育2小时后，用碘化丙啶(PI)标记，用流式细胞仪分析呈红、绿色荧光的细胞数，最后计算NK细胞的杀伤效率。
[0009]以上几种方法均涉及细胞培养，程序复杂、操作时间长，不能在第一时间提供临床所需资料，并且同位素释放法涉及放射性物质的使用，实验条件苛刻，大多数实验室无法常规开展。实用新型内容
[0010]为了解决上述技术问题，本实用新型的目的在于提供一种用于检测NK细胞活性的试剂盒，可以快速、准确地检测活化的NK细胞数量，从而对NK细胞活性进行评估。
[0011]为实现上述目的，本实用新型采取的技术方案是:一种用于检测NK细胞活性的试剂盒，包括盒体(I)、盒盖(2)和设置在盒体(I)内的衬垫(3)，所述衬垫(3)上设有小孔，装有荧光标记CD69单克隆抗体的试剂管(4)、装有荧光标记CD56单克隆抗体的试剂管(5)、装有荧光标记CD3单克隆抗体的试剂管(6)、装有荧光标记HLA-DR单克隆抗体的试剂管
(7)、装有荧光标记CD45单克隆抗体的试剂管(8)、装有红细胞裂解液的试剂管(9)和装有PBS缓冲液的试剂管(10)被设置在所述小孔内。
[0012]其中，每个单克隆抗体的荧光标记不同；优选地，⑶69单克隆抗体使用FITC标记，CD56单克隆抗体使用PE标记，CD3单克隆抗体使用APC标记，CD45单克隆抗体使用PerCP
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[0013]其中，所述红细胞裂解液和PBS缓冲液为本领域常规试剂。
[0014]其中，所述衬垫(3)上设有7个小孔，所述小孔在所述衬垫(3)上分成两排平行排列。
[0015]通过以上技术方案，本实用新型的有益效果如下:
[0016](I)本实用新型的试剂盒结构简单、设计合理，方便携带、保存，不易受污染。
[0017](2)本实用新型的试剂盒在检测NK细胞活性时，不涉及细胞培养，程序简单，降低了检测工作的强度；对实验室条件要求不高，只要有流式细胞仪的实验室即可开展检测，便于技术广泛推广，检测操作时间短、检测精度高，上机操作和数据分析方法简单，可以在第一时间得到临床所需资料。
【专利附图】
【附图说明】
[0018]图1为本实用新型的结构示意图；
[0019]图中，1-盒体，2-盒盖，3-衬垫，4-装有荧光标记⑶69单克隆抗体的试剂管，5_装有荧光标记CD56单克隆抗体的试剂管，6-装有荧光标记CD3单克隆抗体的试剂管，7-装有荧光标记HLA-DR单克隆抗体的试剂管，8-装有荧光标记CD45单克隆抗体的试剂管，9-装有红细胞裂解液的试剂管，10-装有PBS缓冲液的试剂管。
[0020]图2为正常人外周血检测NK细胞活性的示意图；
[0021]图3为淋巴瘤患者外周血检测NK细胞活性的示意图。
【具体实施方式】
[0022]下面结合实施例对本实用新型的【具体实施方式】作进一步描述，本实用新型的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本实用新型的范围构成任何限制。
[0023]下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
[0024]下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
[0025]如图1所示，本实用新型提供了一种用于检测NK细胞活性的试剂盒，包括盒体1、盒盖2和设置在盒体I内的衬垫3，所述衬垫3上设有7个小孔，所述小孔在所述衬垫3上分成两排平行排列，装有荧光标记CD69单克隆抗体的试剂管4、装有荧光标记CD56单克隆抗体的试剂管5、装有荧光标记CD3单克隆抗体的试剂管6、装有荧光标记HLA-DR单克隆抗体的试剂管7、装有荧光标记CD45单克隆抗体的试剂管8和装有红细胞裂解液的试剂管9和装有PBS缓冲液的试剂管10被设置在所述小孔内。
[0026]其中，⑶69单克隆抗体使用FITC标记，⑶56单克隆抗体使用PE标记，⑶3单克隆抗体使用APC标记，⑶45单克隆抗体使用PerCP标记。
[0027]其中，所述红细胞裂解液购自美国BD公司，所述PBS缓冲液购自北京中杉金桥生物技术有限公司。
[0028]检测步骤如下:
[0029](I)取患者的外周血样品，使用计数板对待检标本进行细胞计数，然后调节白细胞浓度至5 X IO6个/ml ；
[0030](2)取70μl待测标本，加入FITC标记CD69单克隆抗体20μl/test、PE标记CD56单克隆抗体20 μ 1/test、APC标记CD3单克隆抗体5 μ 1/test、APC-CY7标记HLA-DR单克隆抗体5 μ L/test和PerCP标记CD45单克隆抗体20 μ L/test，混匀后室温避光孵育20分钟；
[0031](3)加入红细胞裂解液，震荡混匀后室温避光10分钟，使用1500rpm离心5分钟后弃上清，再加入1000 μ I PBS缓冲液，震荡混匀后使用1500rpm离心5分钟，弃上清
[0032](4)加入 150 μ I PBS 缓冲液；
[0033](5 )使用BD Canto II流式细胞仪进行检测，计算HLA-DR+、⑶69+的NK细胞分别占NK细胞和有核细胞的比例，得出检测结果，检测方法具体如下:
[0034](a)上机获取 10000 个 CD3-CD56+ 的 NK 细胞；
[0035](b)在FSC-SSC点图上设Pl门，去除杂质，在CD45-SSC点图上设门圈出淋巴细胞、单核细胞、粒细胞等各群细胞；
[0036](c)在CD3-CD56点图上设门圈出CD3-CD56+的NK细胞；
[0037](d)检测数据主要以散点图的形式显示，在列表模式中将每个细胞的每个检测参量依次存储后，可以对数据进行计算分析，计算得出HLA-DR+、CD69+的NK细胞分别占NK细胞和有核细胞的比例。
[0038]图2为正常人外周血检测NK细胞活性，正常外周血活化的NK细胞的比例如下:
[0039]CD69+的NK细胞占NK细胞比例:范围:0?11.26%，均值:0.69%，标准差:2.505 ；
[0040]CD69+的NK细胞占有核细胞比例:范围:0?0.57%，均值:0.04%，标准差:0.128 ;[0041 ] HLA-DR+的NK细胞占NK细胞比例:范围:2.15%?14.18%，均值:5.63%，标准差:
3.272 ；
[0042]HLA-DR+的NK细胞占有核细胞比例:范围:0.05%?0.99%，均值:0.31%，标准差
0.267。
[0043]图3为淋巴瘤患者外周血检测NK细胞活性，⑶3-⑶56+的NK细胞约占有核细胞的
1.53%，CD69+的NK细胞约占NK细胞的1.62%，约占有核细胞的0.03% ；HLA-DR+的NK细胞约占NK细胞的42.47%，约占有核细胞的0.65% ;其HLA-DR+的NK细胞比例明显升高，CD69+的NK细胞比例升高。
[0044]上面已经举例说明了本实用新型的实施例，本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本实用新型的精神和范围下可以对本实用新型技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本实用新型的保护范围内。
【权利要求】
1.一种用于检测NK细胞活性的试剂盒，其特征在于:所述试剂盒包括盒体(I)、盒盖(2)和设置在盒体(I)内的衬垫(3)，所述衬垫(3)上设有小孔，装有荧光标记⑶69单克隆抗体的试剂管(4)、装有荧光标记CD56单克隆抗体的试剂管(5)、装有荧光标记CD3单克隆抗体的试剂管(6)、装有荧光标记HLA-DR单克隆抗体的试剂管(7)、装有荧光标记CD45单克隆抗体的试剂管(8 )、装有红细胞裂解液的试剂管(9 )和装有PBS缓冲液的试剂管(10 )被设置在所述小孔内。
2.按照权利要求1所述的一种用于检测NK细胞活性的试剂盒，其特征在于:每个单克隆抗体的荧光标记不同。
3.按照权利要求2所述的一种用于检测NK细胞活性的试剂盒，其特征在于:CD69单克隆抗体使用FITC标记，CD56单克隆抗体使用PE标记，CD3单克隆抗体使用APC标记，CD45单克隆抗体使用PerCP标记。
4.按照权利要求1所述的一种用于检测NK细胞活性的试剂盒，其特征在于:所述衬垫(3)上设有7个小孔，所述小孔在所述衬垫(3)上分成两排平行排列。
【文档编号】G01N33/577GK203535053SQ201320687858
【公开日】2014年4月9日 申请日期:2013年11月4日 优先权日:2013年11月4日
【发明者】刘丽媛, 吴纯斌, 秦晓明, 王显凤, 王绪华, 梁超, 方国伟, 黄士昂, 陈忠 申请人:北京海思特临床检验所有限公司