多重pcr检测试剂盒的制作方法
【专利摘要】本实用新型适用于生物医学【技术领域】，提供了一种多重PCR检测试剂盒，包括盒体、盒盖、支撑座、阴性对照液管、阳性对照液管、96孔PCR板，该支撑座位于盒体上方，支撑座上设置有阴性对照液管孔、阳性对照液管孔、96孔PCR板孔，阴性对照液管孔和阳性对照液管孔位于96孔PCR板孔同一侧，且阴性对照液管、阳性对照液管和96孔PCR板分别可分离地位于阴性对照液管孔、阳性对照液管孔和96孔PCR板孔中。使用本实用新型的试剂盒进行检测具有周期短、多重检测、避免污染等优点。
【专利说明】多重PCR检测试剂盒
【技术领域】
[0001]本实用新型属于生物医学【技术领域】，尤其涉及一种多重PCR检测试剂盒。
【背景技术】
[0002]PCR (聚合酶链式反应)检测技术是分子生物学常用检测手段，通常用于检测某段目的核酸序列的存在，而荧光定量PCR检测由于灵敏度高，检测周期短，自动化程度高等优势被广泛使用。荧光定量PCR检测通常利用荧光定量PCR仪进行，将各种反应试剂在PCR反应管中混合，然后将PCR反应管置于荧光定量PCR仪中开始反应。在PCR检测过程中最繁琐的步骤就是将各种样品在PCR反应管中混合，因为要加入PCR缓冲液、DNA聚合酶、引物、MgCl2、dNTP和水等，而这些试剂通常处于分散状态，即购得的这些试剂都是分开储存的。为了避免试剂污染，每次加入不同试剂时都要换移液枪头，这些枪头的损耗也增加了检测成本。这种加样流程消耗了时间增加了检测成本。由此有必要提供一种缩短检测流程同时降低检测成本的检测试剂盒。
实用新型内容
[0003]本实用新型的目的在于提供一种多重PCR检测试剂盒，旨在解决现有技术中多重荧光定量PCR检测操作中加样周期长，移液枪头损耗多的问题。
[0004]本实用新型是这样实现的，一种多重PCR检测试剂盒，包括盒体、盒盖、支撑座、阴性对照液管、阳性对照液管、96孔PCR板，该支撑座位于该盒体上方，该支撑座上设置有阴性对照液管孔、阳性对照液管孔、96孔PCR板孔，该阴性对照液管孔和阳性对照液管孔位于96孔PCR板孔同一侧，且该阴性对照液管、阳性对照液管和96孔PCR板分别可分离地位于该阴性对照液管孔、阳性对照液管孔和96孔PCR板孔中。
[0005]具体地，该96孔PCR板的结构为一体成型结构或可拆卸结构。
[0006]具体地，所述可拆卸结构由支架及12个八联管组成。
[0007]具体地，该多重PCR检测试剂盒还包括扩增增强剂管，并且在该支撑座上设置有扩增增强剂管孔，该扩增增强剂管孔与该阴性对照液管孔位于96孔PCR板孔同一侧，且该扩增增强剂管可分离地位于该扩增增强剂管孔中。
[0008]具体地，该96孔PCR板包括96个PCR反应管，该PCR反应管中均装有PCR反应液。
[0009]具体地，该阴性对照液管中装有阴性对照液，阳性对照液管中装有阳性对照液。
[0010]具体地，该阴性对照液管与该阳性对照液管规格不同。
[0011]具体地，该扩增增强剂管中装有扩增增强剂。
[0012]本实用新型与现有技术相比，有益效果在于:使用本实用新型的试剂盒对临床样本的检测，可以在1.5个小时内完成PCR检测，检测周期短；96孔PCR板中的各PCR管可容纳不同的PCR反应试剂，使多个PCR检测反应同时进行，使得检测的通量更高；试剂盒包含阳性对照和阴性对照，避免出现由于试剂受到污染等原因而出现的假阳性信号或者由于试剂失活等原因而出现的假阴性信号；该检测试剂盒的PCR检测过程采用全封闭式的检测，能有效的避免PCR产物的环境污染。
【专利附图】
【附图说明】
[0013]图1是本实用新型实施例的检测试剂盒的结构示意图；
[0014]图2是本实用新型实施例的单个PCR反应管示意图；
[0015]图3是本实用新型实施例的阴性对照液管/阳性对照液管示意图；
[0016]图4是本实用新型实施例的检测试剂盒进行PCR检测的灵敏度分析结果示意图。
【具体实施方式】
[0017]为了使本实用新型的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本实用新型进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本实用新型，并不用于限定本实用新型。
[0018]本实用新型实施例提供一种多重PCR检测试剂盒，包括盒体、盒盖、支撑座、阴性对照液管、阳性对照液管、96孔PCR板，该支撑座位于该盒体上方，该支撑座上设置有阴性对照液管孔、阳性对照液管孔、96孔PCR板孔，该阴性对照液管孔和阳性对照液管孔位于96孔PCR板孔同一侧，且该阴性对照液管、阳性对照液管和96孔PCR板分别可分离地位于该阴性对照液管孔、阳性对照液管孔和96孔PCR板孔中。
[0019]具体地，上述阴性对照液管可分离地设置于对应的阴性对照液管孔中，阳性对照液管可分离地设置于对应的阳性对照液管孔中、96孔PCR板设置于对应的96孔PCR板孔中。其中阴性对照液管孔设置为圆形，并与阴性对照液管配合，阳性对照液管孔也设置为圆形并与阳性对照液管配合。在具体实施例中阴性对照液管与阳性对照液管可以是相同规格的试剂瓶，也可以是不同规格的试剂瓶，阴性对照液管和阳性对照液管可以为，但不限于，
0.5ml、l.5ml、2ml和5ml螺口管/离心管中的一种或两种。优选的实施例中阴性对照液管与阳性对照液管大小不同以便识别并可防止加样错误等误操作。
[0020]具体地，上述96孔PCR板孔为矩形结构并与96孔PCR板配合以使其固定。该96孔板包括96个PCR反应管，该96孔板的结构可为一体成型结构，也可为可拆卸结构，优选为一体成型结构以便于把全部检测PCR反应管同时放入荧光定量PCR仪中，该一体成型结构中96个PCR反应管与荧光定量PCR仪中PCR反应管插入孔相对应。对于可拆卸结构，该96孔板由支架及12个八联管组成，此种情况下可以取出其中部分八联管进行PCR检测而将其他八联管保留用于以后的检测。该96孔板中，用于检测一种或多种病原体/微生物的PCR管可以用不同颜色或不同标记表示，以避免错误加样，提高加样效率。
[0021]图1显示了本实用新型的多重PCR检测试剂盒结构的一个具体实施例，其中该检测试剂盒整体为长方体形状，其包括盒体1、盒盖2、支撑座3、阴性对照液管4、阳性对照液管5、扩增增强剂管6、96孔PCR板7。其中，盒盖2位于盒体I上方，盒盖2相对于盒体I的一侧有开口以便盖合在盒体I上。该支撑座3位于盒体I顶部，其与盒体I 一体成型，并且该支撑座3上设置有阴性对照液管孔、阳性对照液管孔、扩增增强剂管孔和96孔PCR板孔分别对应于阴性对照液管4、阳性对照液管5、扩增增强剂管6和96孔PCR板7。阴性对照液管4、阳性对照液管5和扩增增强剂管6可以有相同的规格，也可有不同的规格，图1中阴性对照液管4、阳性对照液管5和扩增增强剂管6规格相同。具体实施例中为便于区分，防止错误加样，优选将阴性对照液管4、阳性对照液管5和扩增增强剂管6设置为不同规格。本实用新型中使用的扩增增强剂主要用于提高PCR扩增产物含量，可以提高PCR检测灵敏度，由于扩增增强剂用量较少，因此优选扩增增强剂管6的规格比阴性对照液管4和阳性对照液管5小。
[0022]图2显示了本实用新型实施例中单个PCR反应管，其容积为200μ I。在使用时，可将八个此种PCR反应管在一条直线上联在一起，或者以8x12的方式将96个PCR反应管联
在一起。
[0023]图3显示了本实用新型的阴性对照液管/阳性对照液管的一个实施例，该实施例中该阴性对照液管/阳性对照液管为EP管，为1.5ml规格，在具体实施例中不限于上述规格。
[0024]具体实施例中，上述阴性对照液管4、阳性对照液管5、扩增增强剂管6大小及排列顺序不限于图1所示，可以采用其他方便使用的组合方式。
[0025]具体地，上述阴性对照液管4、阳性对照液管5、96孔PCR板7的PCR反应管中均装有对应的试剂，即，阴性对照液管4中装有阴性对照液，阳性对照液管5中装有阳性对照液，96孔PCR板7的PCR反应管中装有PCR反应液，该PCR反应液包含PCR缓冲液、MgCl2、dNTPs、至少一种荧光探针、至少一对PCR引物和DNA聚合酶。上述阳性对照液中含有目标检测物的DNA序列，阴性对照液中不含有该引物序列，该阳性对照液和阴性对照液用于避免出现由于试剂受到污染等原因而出现的假阳性信号或者由于试剂失活等原因而出现的假阴性信号。由于上述PCR反应管中预装有用于检测的PCR反应液，因此使用者直接加入待测样品后即可进行检测，这样缩短了加样流程，节约了时间，提高检测效率，同时也避免了使用者反复加样可能引起的污染问题。
[0026]具体地，本实用新型实施例的多重PCR检测试剂盒的每个PCR反应管中可包含多对用于检测不同病原体的PCR引物，即，在每个PCR反应管中继续多重PCR反应，另一方面，也可以在96孔板的不同PCR反应管中进行不同PCR反应，使得检测的通量更高。例如在用于呼吸道病原体检测时，该多重PCR检测试剂盒可同时检测10-12个样本，每个样本检测15-23种呼吸道病原体。
[0027]以下以呼吸道病原体检测为例，通过具体实施例对本实用新型进一步阐述。
[0028]实施例1PCR特异性检测
[0029]1.待检测的病原微生物包括如下:实验组:呼吸道合胞病毒A、偏肺病毒MPV、肺炎支原体、军团菌；对照组:甲型肝炎病毒、轮状病毒、人巨细胞病毒和乙型肝炎病毒。
[0030]2.呼吸道病原体的荧光PCR检测
[0031]( I)临床标本米集、保存及运输
[0032]对受试者进行咽拭子标本采集。采集时以清晨为宜。用清水漱口，由检查者用压舌板辅助，将咽拭子越过舌根，到达咽峡部的病变处，反复涂抹数次，取出时避免接触舌及口腔粘膜等处，将取样后的棉拭子放入约Iml的生理盐水中充分洗涤，然后贴壁挤干，丢弃棉拭子。
[0033](2)标本处理:
[0034]采集患者的咽拭子的分离培养物，从分离培养物中提取核酸。
[0035](3)以患者核酸为模板进行RT-PCR反应[0036]向96孔PCR板的每个PCR反应管中加入核酸样品，这些PCR反应管中预装有PCR反应液。将该96孔PCR板置于全自动荧光PCR检测仪中，参照仪器操作说明设定阴阳性对照、待测样品参数进行PCR反应，记录样品摆放顺序。
[0037]其中，反应程序设定为:第一步:37°C45min，94°C Imin ;第二步:94 °C 15sec，55°C 15sec,72°C 20sec，40 个循环。
[0038](4)结果判定:
[0039]阴性对照Ct值为none，阳性对照Ct值小于或等于30。待测样本的Ct值小于等于35为阳性，Ct值大于35为阴性。结果表明试剂盒特异性比较好，对甲型肝炎病毒、轮状病毒、人巨细胞病毒和乙型肝炎病毒无扩增。检测样品中呼吸道合胞病毒A、偏肺病毒MPV、肺炎支原体、军团菌一部分为阳性，结果未显示。
[0040]上述检测过程可以在1.5个小时内完成。
[0041]实施例2试剂盒检测灵敏度分析
[0042]将阳性对照按一定拷贝数倍比稀释后，经PCR扩增检测直至检测不到信号，该拷贝数即为最低检测限，也就是试剂盒的灵敏度。使用本实用新型的试剂盒的最高灵敏度可达100拷贝，见图4。
[0043]以上所述仅为本实用新型的较佳实施例而已，并不用以限制本实用新型，凡在本实用新型的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本实用新型的保护范围之内。
【权利要求】
1.一种多重PCR检测试剂盒，包括盒体、盒盖、支撑座、阴性对照液管、阳性对照液管、96孔PCR板，所述支撑座位于所述盒体上方，所述支撑座上设置有阴性对照液管孔、阳性对照液管孔、96孔PCR板孔，所述阴性对照液管孔和阳性对照液管孔位于96孔PCR板孔同一侦牝且所述阴性对照液管、阳性对照液管和96孔PCR板分别可分离地位于所述阴性对照液管孔、阳性对照液管孔和96孔PCR板孔中。
2.如权利要求1所述的多重PCR检测试剂盒，其特征在于，所述96孔PCR板的结构为一体成型结构或可拆卸结构。
3.如权利要求2所述的多重PCR检测试剂盒，其特征在于，所述可拆卸结构由支架及12个八联管组成。
4.如权利要求1所述的多重PCR检测试剂盒，其特征在于，还包括扩增增强剂管，并且在所述支撑座上设置有扩增增强剂管孔，所述扩增增强剂管孔与所述阴性对照液管孔位于96孔PCR板孔同一侧，且所述扩增增强剂管可分离地位于所述扩增增强剂管孔中。
5.如权利要求1-4中任一项所述的多重PCR检测试剂盒，其特征在于，所述96孔PCR板包括96个PCR反应管，所述PCR反应管中均装有PCR反应液。
6.如权利要求5所述的多重PCR检测试剂盒，其特征在于，所述阴性对照液管中装有阴性对照液，阳性对照液管中装有阳性对照液。
7.如权利要求5所述的多重PCR检测试剂盒，其特征在于，所述阴性对照液管与所述阳性对照液管规格不同。
8.如权利要求4所述的多重PCR检测试剂盒，其特征在于，所述扩增增强剂管中装有扩增增强剂。
【文档编号】G01N21/64GK203569116SQ201320686173
【公开日】2014年4月30日 申请日期:2013年10月31日 优先权日:2013年10月31日
【发明者】卢柳燕, 罗晓腾, 郭永超, 廖玉声 申请人:深圳联合医学科技有限公司