专利名称：痛风相关尿酸浓度检测试剂盒的制作方法
技术领域：
本实用新型涉及分子生物学和医学领域，具体涉及检测痛风相关尿酸浓度的试剂盒，通过同时检测与痛风密切相关的葡萄糖易化转运蛋白-9 (SLC2A9)和三磷酸腺苷结合盒转运蛋白G2 (ABCG2)的单核苷酸多态性位点基因型来评估个体患痛风的风险。
背景技术：
血尿酸增高(高尿酸血症)导致痛风，当尿酸达超饱和状态时，可在关节内形成单钠尿酸盐结晶。对某些人来说，这些晶体可诱发疼痛性自限性炎性反应，即急性痛风性关节炎。高尿酸血症最重要的原因是尿酸从尿中排泄減少，而尿酸的排泄是由表达在肾集合管上的尿酸转运分子来调节的，这是痛风发生的关键病理生理。发生痛风其他的关键点是肝脏尿酸盐生成、单钠尿酸结晶形成和急性炎症反应触发。调节尿酸浓度的全基因组相关扫描证实有2种主要的高尿酸调节分子——肾脏尿酸转运子SLC2A9和ABCG2。葡萄糖易化转运蛋白-9(Facilitated Glucose Transporter 9, SLC2A9,GLUT-9)是溶质运载蛋白家族成员(Solute Carrier Family)之一,在维持体内葡萄糖代谢的相对稳定和平衡中具有重要作用，还可能參与软骨基质中成骨细胞的生长发育的调控，其表达异常或变异还可能与尿酸转运异常有夫。SLC2A9基因定位于5号染色体(5B3)，有2个变体，分别由540aa和511aa组成，在小鼠阴道，结缔组织，肺和脾脏等组织表达丰富，而人类只在正常肾脏有效高的表达，在卵巢肿瘤，子宫和软骨肉瘤时呈现高表达。之前对于尿酸转运蛋白的研究，主要集中于尿酸如何由肾小管转运至上皮细胞内部，而对其如何从细胞内进入血液的过程，研究甚少。最近Promsuk等发现GLUT9是ー种果糖转运蛋白，属于SLC2A9家族，在肾脏中固定在肾小管上皮细胞基地外侧膜上，主要负责将尿酸分泌到细胞外。该蛋白的转运功能并不依赖于Na+，而当细胞外K+浓度升高时，其转运功能增强。Promsuk等将其命名为电势驱动尿酸转运蛋白I (voltagedriven uratetransporter I, URATvl)。肾脏低尿酸血症患者证实了该蛋白在人体内对尿酸的转运作用，该患者编码URATl的SL22A12的基因序列正常，而编码GLUT9的SLC2A9上P412R基因序列发生了缺失型突变。同事，Veronique等通过对克罗地亚人基因组研究发现，尿酸浓度变化的I. 7% 5. 3%与SLC2A9基因序列有关，同时该基因序列的多样性与英国人群，克罗埃西亚人群，德国人群样本的尿酸分级排泄減少有关，该蛋白尿酸转运功能通过爪蟾卵模型(Xenopus laevis oocytes)得到验证。Dinour等研究了两个患者有严重遗传性低尿酸血症的家庭，其中ー个家庭6个成员SLC2A9上的L75R发生错义突变，另ー个发生36kb的缺失突变，蛋白合成不完整。结果说明，L75R基因突变严重影响尿酸的正常重吸收。目前通过基因组多样性研究，已经发现有6个SLC2A9单核苷酸多态性(rs6855911，rs7442295，rs6449213, rsl2510549, rs737267, rsl014290)与血清尿酸浓度有夫。1998年Doyle等首先在乳腺癌细胞株MCF-7/AdrVp中检测到一种跨膜转运蛋白，成为乳腺癌耐药蛋白(breast cancer resistance protein, BCRP),系统发育分析该基因为 ABC 转运蛋白超家族(ATP-binding cassette transporter superfamily, ABCtransporter superfamily)G亚家族第2成员，命名为ABCG2。ABCG2定位于细胞膜，在正常组织中分布广泛，主要分布于具有分泌和排泄功能的组织如胎盘合体滋养层、小肠和结肠上皮、肝脏小管膜、胆小管膜、乳腺小叶及血管内皮细胞中。人类ABCG2基因位于4q22 23，编码655个氨基酸残基。ABCG2全长66kb，由16个外显子和15个内含子组成，外显子为6(T332bp不等。ABCG2在人体内承担着一定的生理功能，如维持细胞稳态、血脑屏障、胎血屏障等，同时与疾病的易感性及药动学等相关。三磷酸腺苷结合盒转运蛋白G2 (ABCG2)作为ー种转运蛋白定位于细胞膜，广泛分布在具有分泌和排泄功能的组织，在肾脏中，该蛋白表达在肾小管上皮细胞刷状缘侧。在机体内负责维持细胞稳态，对细胞低氧的保护，及在药代动力学中的作用等，目前是临床治疗肿瘤(化疗)的靶点之一。最近，Owen等通过爪蟾卵表达人ABCG2蛋白的方法和LLC-PKl细胞实验证实了 ABCG2是ー种尿酸分泌蛋白。同时在14783名受试者中，进行ABCG2单核苷酸基因多态性分析，发现rs2231142 (Q141K)功能缺失与血清尿酸浓度密切相关。约有10%的白人痛风病案与该缺失突变相关。Hirotaka Matsuo等对739名日本人受试者数量性状遗传位点分析显示，该功能缺失能够阻碍尿酸排泄，使血清尿酸浓度上升，引发高尿酸血症。同样，Kazumasa等在3923名年龄在40 90岁的日本人中，分析了 rs2231142单核苷酸多态性与血清尿酸浓度及高尿酸血症和痛风的关系，证明两者具有密切相关性。
发明内容本实用新型针对目的是提供ー种采用荧光定量PCR技术同时检测两个尿酸浓度相关基因SNP位点的试剂盒。该试剂盒由包装盒体、衬垫、装有检测两个SNP位点的荧光定量PCR反应液的两个试管、装有阳性对照品的ー个试管、装有阴性对照品的ー个试管组成，衬垫上设有容器孔，分别放置两管荧光定量PCR反应液、阳性对照品和阴性对照品。其中荧光定量PCR反应液的成分包含PCR缓冲液、MgCl2、dNTPs、SNP位点检测用上游引物、SNP位点检测用下游引物、SNP位点基因型ー荧光探针、SNP位点基因型ニ荧光探针、Taq DNA聚合酶。其中，葡萄糖易化转运蛋白-9 (SLC2A9)上的SNP位点检测引物和探针为上游引物序列5’- GTACCACTCCACCTGG -3’下游引物序列5’- TGTCTTCATCTACTTG -3’基因型ー荧光探针序列5’-FAM - AAGCACAaAAATGA - TAMRA -3’基因型ニ荧光探针序列5’-VIC- AAGCACAgAAATGA -TAMRA -3’三磷酸腺苷结合盒转运蛋白G2 (ABCG2)上的SNP位点检测引物和探针为上游引物序列5’- GCAAGCCGAAGAGCTG -3’下游引物序列5’- CACTCTGACGGTGAGA -3’基因型ー荧光探针序列5’-FAM - TGAGAACTgTAAGTTT - TAMRA -3’基因型ニ荧光探针序列5’-VIC - TGAGAACTtTAAGTTT -TAMRA -3’对照品分为阳性对照品和阴性对照品，阴性对照品为无菌双蒸水样品，阳性对照品为ロ腔粘膜细胞DNA样品。 本试剂盒保存于-20°C，尽量减少反复冻融。[0022]本实用新型试剂盒使用方法毎次检测均应设立阳性对照和阴性对照。扩增检测在荧光定量PCR仪上进行，分为6个反应管，每ー个SNP位点检测使用3个反应管，其中I个反应管为被检测样品，阳性对照和阴性对照各使用I个反应管，每管中总体积 ομ 1，其中8μ I PCR反应液，2 μ I检测样品(基因组DNA、阳性对照或阴性对照)。反应条件为50°C、2分钟，95°C、10分钟，再进行60个循 环的95°C、30秒，60°C、I分钟。反应完成后在荧光定量PCR仪上进行終点荧光读取，根据得到的ニ维荧光图和实时扩增曲线读取被检测样品的SNP位点基因型。本实用新型提供的该试剂盒主要用于检测尿酸浓度相关基因SNP位点，从而告知被检者患病风险数值，提前预防和控制，指导医师选择正确的临床治疗方案，有利于患者迸行针对性治疗。本实用新型的特点是该试剂盒运用荧光定量PCR技术实现了同时检测两个尿酸浓度相关基因SNP位点基因型的目的，相对于现有的荧光定量PCR试剂盒只检测ー个SNP位点，本实用新型试剂盒将同一疾病的所有SNP位点检测整合在ー个试剂盒内，使用更方便而且成本更低，对个体患痛风风险性的评估也更便捷。
图I为本实用新型的结构示意图。
具体实施方式
本实用新型结合附图和具体实施例作进ー步说明。应该理解，这些实施例仅用于说明目的，而不用于限制本实用新型范围。实施例I參见图1，本实用新型试剂盒由包装盒体I、衬垫2、装有检测两个SNP位点的荧光定量PCR反应液的两个试管3、装有阳性对照品的一个试管4、装有阴性对照品的一个试管5组成，衬垫上设有容器孔、分别放置两管荧光定量PCR反应液3、阳性对照品4和阴性对照品5。其中荧光定量PCR反应液的成分包含PCR缓冲液、MgCl2、dNTPs、SNP位点检测用上游引物、SNP位点检测用下游引物、SNP位点基因型ー荧光探针、SNP位点基因型ニ荧光探针、Taq DNA聚合酶。本试剂盒保存于_20°C，尽量减少反复冻融。实施例2I.材料血样总DNA提取试剂盒购于美国Qiagen公司，Taq DNA聚合酶、dNTPs等PCR相关试剂购于美国Promega公司，7900型荧光定量PCR仪为美国ABI公司产品。2.引物及探针葡萄糖易化转运蛋白-9 (SLC2A9)上的SNP位点检测引物和探针为上游引物序列5’- GTACCACTCCACCTGG -3’下游引物序列5’- TGTCTTCATCTACTTG -3’[0040]基因型ー荧光探针序列5’-FAM - AAGCACAaAAATGA - TAMRA -3’基因型ニ荧光探针序列5’-VIC- AAGCACAgAAATGA -TAMRA -3’三磷酸腺苷结合盒转运蛋白G2 (ABCG2)上的SNP位点检测引物和探针为上游引物序列5’- GCAAGCCGAAGAGCTG -3’下游引物序列5’- CACTCTGACGGTGAGA -3’基因型ー荧光探针序列5’-FAM - TGAGAACTgTAAGTTT - TAMRA -3’基因型ニ荧光探针序列5’-VIC - TGAGAACTtTAAGTTT -TAMRA _3’ 3.样本检测选取30例血液样本，其中已确定患痛风的为18例。样本用血样总DNA提取试剂盒提取总DNA。姆一例检测为12个反应管,姆管中总体积10μ I,其中8μ I PCR反应液,姆ー个SNP位点检测使用3个反应管，I个反应管中加入2 μ I被检测DNA,另外2个反应管中加入2 μ I阳性对照和阴性对照，在ΑΒΙ7900荧光定量PCR仪上进行扩增。反应条件为50°C、2分钟，95°C、10分钟，再进行60个循环的95°C、30秒，60°C、I分钟。反应完成后在荧光定量PCR仪上进行终点荧光读取。
权利要求1.ー种痛风相关尿酸浓度检测试剂盒，其特征是由包装盒体(I)、衬垫(2)、装有检测两个SNP位点的荧光定量PCR反应液的两个试管(3)、装有阳性对照品的一个试管(4)、装有阴性对照品的一个试管(5)组成，衬垫(2)上设有容器孔，分别放置两管荧光定量PCR反应液(3 )、阳性对照品(4 )和阴性对照品(5 )。
专利摘要本实用新型提供了一种检测尿酸浓度相关基因位点是否发生突变从而评估个体患痛风风险性的试剂盒，由包装盒体1、衬垫2、装有检测两个SNP位点的荧光定量PCR反应液的两个试管3、装有阳性对照品的一个试管4、装有阴性对照品的一个试管5组成，衬垫上设有容器孔，分别放置两管荧光定量PCR反应液3、阳性对照品4和阴性对照品5。本实用新型试剂盒运用荧光定量PCR技术实现了同时检测两个尿酸浓度相关基因SNP位点基因型的目的，相对于现有的荧光定量PCR试剂盒只检测一个SNP位点，本实用新型试剂盒将与同一疾病的两个SNP位点检测整合在一个试剂盒内，使用更方便而且成本更低，对个体患痛风风险性的评估也更便捷。
文档编号C12M1/34GK202401060SQ2011205694
公开日2012年8月29日 申请日期2011年12月31日 优先权日2011年12月31日
发明者任峻, 张华忠 申请人:浙江爱易生物医学科技有限公司