专利名称：乙醇浓度检测试剂盒及其制备方法
技术领域：
本发明涉及医学检验技术领域，具体涉及一种乙醇浓度检测试剂盒，以及该试剂盒的制备方法。
背景技术：
近年来，酒后引起的刑事案件和酒后驾车引起的交通事故案不断上升，2011年5 月1日《中华人民共和国刑法修正案(八)》正式实施，醉酒驾驶作为危险驾驶罪被追究驾驶人刑事责任，有关酒驾的话题再次成为人们关注的焦点。目前，许多国家都制定了血液中乙醇浓度与交通事故责任认定的关系，建立了多种能够检测血液中乙醇含量的方法，如GM/ MS法等，虽然这些方法可以准确定量，但是存在着购买仪器价格昂贵，检测成本高，需专门培训，无法在案发现场快速检测的缺点。在我国，对醉酒驾驶的现场检测主要使用呼气式乙醇测定仪，根据国家相关规定， 气体中酒精含量的检测设备有燃料电池式和半导体气敏元件式。由于检测驾驶员是否饮酒，是根据驾驶员呼出气体来测量的，呼气压力的大小直接影响测量结果，此外，呼出气体酒精含量探测器是靠空气中酒精标准气体来校准的，空气中酒精标准气体量值的准确性决定了检定结果的准确性，由于乙醇在常温下是液体，且沸点较高(78. 5°C )，因挥发及汽化不完全使配制较高浓度的乙醇标准气体均勻性不太理想，这使呼出气体酒精含量探测器的检定重复性难于保证，两次检定结果相差很大，同时其价格也十分昂贵，而且不卫生，容易发生交叉感染疾病。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种乙醇浓度检测试剂盒，用该试剂盒进行检测醉酒者的乙醇浓度时简便卫生、速度快、灵敏度高、稳定性高，且该试剂盒易携带、尤其适合现场检测。一种乙醇浓度检测试剂盒，由试剂条和标准比对卡组成，其中试剂条为宽0. 5-lcm 的滤纸条，滤纸条上含有固相化的乙醇脱氢酶、黄递酶、氧化型INT及辅酶，标准比对卡包括不同乙醇浓度的显色比对区。该乙醇浓度检测试剂盒的反应原理为采用循环酶法进行测定乙醇浓度。具体为 辅酶和乙醇在乙醇脱氢酶的作用下生成乙醛和还原型辅酶，生成的还原型辅酶在黄递酶的作用下，与色原物质氧化型INT (硝基四氮唑蓝)发生显色反应，生成红色的还原型INT和
辅酶。反应步骤如下
乙解脱氧酷
(1)乙醇+辅酶乙醛+还原型辅酶1
(2)还原型辅酶1 +氧化型INT 趙, ”辅酶+还原型INT
生成的红色还原型INT的颜色深浅和显色速度的快慢与样品中乙醇的浓度成线性关系。将试剂条直接放入嘴中，或蘸取少量已吐入器皿的唾液，等待10秒钟后，与标准比对卡进行比对，半定量测定醉酒者唾液中的乙醇浓度。而根据人体唾液和血液中乙醇浓度一致性的实验基础，人体唾液中乙醇浓度即人体血液中乙醇浓度。
所述辅酶为NAD (烟酰胺腺嘌呤二核苷酸)、NADP (烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸)、 thio-NAD (硫代氧化型辅酶I)中的一种。
作为优选，所述标准比对卡包括乙醇浓度分别为Omg/ml、0. 2mg/ml、0. 8mg/ml、 1. 5mg/ml、3. Omg/ml的五个显色比对区。
本发明结合循环酶法、酶比色法和酶偶联法，解决了酶比色法检测需要加入反应促进剂使反应尽快达终，但反应促进剂又对乙醇脱氢酶有抑制作用的问题，并且乙醇脱氢酶的运用保证了反应的专一性和测定的高特异性，使其灵敏度较现有技术的酶比色法大大提高。由于该试剂盒为试剂条，一人一条，非常卫生，且10秒钟即可判断检测结果，检测速度快。由试剂条和标准比对卡组成的试剂盒携带方便，尤其适合现场检测。
本发明还提供该乙醇浓度检测试剂盒的制备方法，用该制备方法制得的试剂盒在保证检测精确和准确性的同时，成本低廉。
该乙醇浓度检测试剂盒的制备方法包括试剂条的制备和标准比对卡的制备，其中
试剂条的制备包括以下步骤
(1)配制乙醇脱氢酶和黄递酶的酶混合液将乙醇脱氢酶与黄递酶溶于pH 7. 0-9.0的0. 05-2M三羟甲基氨基缓冲液中，使每毫升缓冲液中每个酶的总活性为 100-1000U ；
(2)配制氧化型INT溶液将I-IOg INT溶于50_500ml乙二醇中；
(3)配制辅酶溶液将I-IOg辅酶溶于50_500ml水中；
(4)酶和底物的固相化将滤纸浸入步骤(1)配制的酶混合液中，取出滤纸干燥； 接着将步骤( 配制的氧化型INT溶液滴在已干燥的滤纸上，干燥；然后将步骤C3)配制的辅酶溶液滴在已干燥的滤纸上，干燥；
(5)制备试剂条将步骤⑷中干燥后的滤纸贴在单面含胶的白色聚酯板的前端， 用切纸机切成宽0. 5-lcm的长条，即成检测试剂条。
标准比对卡的制备步骤为
将浓度为0mg/ml、0. 2mg/ml,0. 8mg/ml、l. 5mg/ml、3. Omg/ml 的乙醇分别滴加到上述制备成的试纸条上，30°C热风、避光下干燥lOmin，用扫描仪输入电脑中，用photoshop软件吸管测量颜色信息(RGB模式)，根据每个浓度梯度颜色值用Photoshope. 0软件制成5个梯度(Omg/ml,0. 2mg/ml、0. 8mg/ml、l. 5mg/ml、3. Omg/ml)的标准比色卡，即成标准比对卡。
该试剂盒的制备方法按照上述循环酶法的原理进行制备，保证了试剂盒检测的灵敏度和准确性，所用试剂全部进行固相化于滤纸，故易于保存、稳定性好。另外，该试剂盒用常规的实验手段进行制备，且无需用到价格昂贵的仪器，故该试剂盒的制备方法成本低。
具体实施方式
以下结合实施例对本发明作进一步具体描述，但不局限于此。
实施例1
本实施例乙醇浓度检测试剂盒由试剂条和标准比对卡组成，其中试剂条为宽 0. 5cm的滤纸条，滤纸条上含有固相化的乙醇脱氢酶、黄递酶、氧化型INT溶液及辅酶，标准比对卡包括不同乙醇浓度的显色比对区。所述辅酶为NAD。所述标准比对卡包括乙醇浓度分别为 0mg/ml、0. 2mg/ml、0. 8mg/ml、l. 5mg/ml、3. Omg/ml 的五个显色比对区。
该乙醇浓度检测试剂盒的制备方法包括试剂条的制备和标准比对卡的制备，其中
试剂条的制备包括以下步骤
(1)配制乙醇脱氢酶和黄递酶溶液将乙醇脱氢酶与黄递酶溶于pH 7. O的0. IM 三羟甲基氨基缓冲液中，使每毫升缓冲液中每个酶的总活性为IOOU ；
(2)配制INT溶液将Ig INT溶于IOOml乙二醇中。
(3)配制NAD溶液将Ig NAD溶于50ml水中。
(4)酶和底物的固相化将滤纸浸入步骤(1)配制的酶混合液中，取出滤纸在30°C 热风、避光下干燥30min;将步骤(2)配制的INT溶液均勻地滴在已干燥的滤纸上，再经 30°C热风、避光下干燥30min ；将步骤(；3)配制的NAD溶液均勻地滴在已干燥的滤纸上，再经30°C热风、避光下干燥30min。
(5)制备试纸条把干燥后的滤纸贴在单面含胶的白色聚酯板的前端，用切纸机切成宽0. 5cm的长条，即制成检测试剂条。
标准比对卡的制备步骤为将浓度为Omg/ml、0. 2mg/ml、0. 8mg/ml、l. 5mg/ml、 3. Omg/ml的乙醇分别滴加到上述制备成的试纸条上，30°C热风、避光下干燥lOmin，用扫描仪输入电脑中，用photoshop软件吸管测量颜色信息(RGB模式)，根据每个浓度梯度颜色值用 Photoshop6. 0 软件制成 5 个梯度(0mg/ml、0. 2mg/ml、0. 8mg/ml、l. 5mg/ml、3. Omg/ml)的标准比色卡，即成标准比对卡。
实施例2
本实施例乙醇浓度检测试剂盒由试剂条和标准比对卡组成，其中试剂条为宽 0. 5cm的滤纸条，滤纸条上含有固相化的乙醇脱氢酶、黄递酶、氧化型INT溶液及辅酶，标准比对卡包括不同乙醇浓度的显色比对区。所述辅酶为thio-NAD。所述标准比对卡包括乙醇浓度分别为 0mg/ml、0. 2mg/ml、0. 8mg/ml、l. 5mg/ml、3. Omg/ml 的五个显色比对区。
该乙醇浓度检测试剂盒的制备方法包括试剂条的制备和标准比对卡的制备，其中
试剂条的制备包括以下步骤
(1)配制乙醇脱氢酶和黄递酶溶液将乙醇脱氢酶与黄递酶溶于PH 8. 0的0. 2M 三羟甲基氨基缓冲液中，使每毫升缓冲液中每个酶的总活性为500U ；
(2)配制INT溶液将5g INT溶于50ml乙二醇中。
(3)配制 thio-NAD 溶液将 2g thio-NAD 溶于 50ml 水中。
(4)酶和底物的固相化将滤纸浸入步骤(1)配制的酶混合液中，取出滤纸在30°C 热风、避光下干燥60min ；将步骤( 配制的INT溶液均勻地滴在已干燥的滤纸上，再经 30°C热风、避光下干燥60min;将步骤(3)配制的NAD溶液均勻地滴在已干燥的滤纸上，再经30°C热风、避光下干燥60min。
(5)制备试纸条把干燥后的滤纸贴在单面含胶的白色聚酯板的前端，用切纸机切成宽0. 5cm的长条，即制成检测试剂条。
标准比对卡的制备步骤同实施例1。
实施例3
本实施例乙醇浓度检测试剂盒由试剂条和标准比对卡组成，其中试剂条为宽 0. 5cm的滤纸条，滤纸条上含有固相化的乙醇脱氢酶、黄递酶、氧化型INT溶液及辅酶，标准比对卡包括不同乙醇浓度的显色比对区。所述辅酶为NADP。所述标准比对卡包括乙醇浓度分别为 0mg/ml、0. 2mg/ml、0. 8mg/ml、l. 5mg/ml、3. Omg/ml 的五个显色比对区。
该乙醇浓度检测试剂盒的制备方法包括试剂条的制备和标准比对卡的制备，其中
试剂条的制备包括以下步骤
(1)配制乙醇脱氢酶和黄递酶溶液将乙醇脱氢酶与黄递酶溶于pH 9. O的0. IM 三羟甲基氨基缓冲液中，使每毫升缓冲液中每个酶的总活性为IOOOU ；
(2)配制INT溶液将IOg INT溶于50ml乙二醇中。
(3)配制NADP溶液将IOg NADP溶于50ml水中。
(4)酶和底物的固相化将滤纸浸入步骤(1)配制的酶混合液中，取出滤纸在30°C 热风、避光下干燥60min ；将步骤( 配制的INT溶液均勻地滴在已干燥的滤纸上，再经 30°C热风、避光下干燥60min;将步骤(3)配制的NAD溶液均勻地滴在已干燥的滤纸上，再经30°C热风、避光下干燥60min。
(5)制备试纸条把干燥后的滤纸贴在单面含胶的白色聚酯板的前端，用切纸机切成宽0. 5cm的长条，即制成检测试剂条。
标准比对卡的制备步骤同实施例1。
实施例所用的原料，除另有说明外，均为市售工业品。
本发明的上述实施例是对本发明的说明而不能用于限制本发明，与本发明的权利要求书相当的含义和范围内的任何改变，都应认为是包括在权利要求书的范围内。
权利要求
1.一种乙醇浓度检测试剂盒，其特征在于由试剂条和标准比对卡组成，其中试剂条为宽0. 5-lcm的滤纸条，滤纸条上含有固相化的乙醇脱氢酶、黄递酶、氧化型INT及辅酶，标准比对卡包括不同乙醇浓度的显色比对区。
2.根据权利要求1所述的乙醇浓度检测试剂盒，其特征在于所述辅酶为NAD、NADP, thio-NAD 中的一种。
3.根据权利要求1所述的乙醇浓度检测试剂盒，其特征在于所述标准比对卡包括乙醇浓度分别为 0mg/ml、0. 2mg/ml、0. 8mg/ml、l. 5mg/ml、3. Omg/ml 的五个显色比对区。
4.权利要求1所述的乙醇浓度检测试剂盒的制备方法，其特征在于包括试剂条的制备和标准比对卡的制备，其中试剂条的制备包括以下步骤(1)配制乙醇脱氢酶和黄递酶的酶混合液将乙醇脱氢酶与黄递酶溶于PH7. 0-9. O的 0. 05-2M三羟甲基氨基缓冲液中，使每毫升缓冲液中每个酶的总活性为100-1000U，(2)配制氧化型INT溶液将I-IOgINT溶于50-500ml乙二醇中，(3)配制辅酶溶液将I-IOg辅酶溶于50-500ml水中，(4)酶和底物的固相化将滤纸浸入步骤(1)配制的酶混合液中，取出滤纸干燥；接着将步骤( 配制的氧化型INT溶液滴在已干燥的滤纸上，干燥；然后将步骤C3)配制的辅酶溶液滴在已干燥的滤纸上，干燥，(5)制备试剂条将步骤⑷中干燥后的滤纸贴在单面含胶的白色聚酯板的前端，用切纸机切成宽0. 5-lcm的长条，即成检测试剂条；标准比对卡的制备步骤为将浓度为0mg/ml、0. 2mg/ml、0. 8mg/ml、l. 5mg/ml、3. Omg/ml的乙醇分别滴加到制备成的试纸条上，30°C热风、避光下干燥lOmin，用扫描仪输入电脑中，用photoshop软件吸管测量颜色信息，根据每个浓度梯度颜色值用Photoshope. O软件制成5个梯度的标准比色卡， 即成标准比对卡。
全文摘要
本发明提供了一种乙醇浓度检测试剂盒及其制备方法，该试剂盒由试剂条和标准比对卡组成，其中试剂条为宽0.5-1cm的滤纸条，滤纸条上含有固相化的乙醇脱氢酶、黄递酶、氧化型INT及辅酶，标准比对卡包括不同乙醇浓度的显色比对区。用该试剂盒进行检测醉酒者的乙醇浓度时简便卫生、速度快、灵敏度高、稳定性高，且该试剂盒易携带、尤其适合现场检测。
文档编号G01N33/98GK102520198SQ20111038212
公开日2012年6月27日 申请日期2011年11月21日 优先权日2011年11月21日
发明者沃燕波, 邹炳德 申请人:宁波美康生物科技股份有限公司