1,5-脱水葡萄糖醇检测试剂盒及检测方法

专利名称：：1,5-脱水葡萄糖醇检测试剂盒及检测方法
技术领域：
：本发明属临床生化检测领域，具体涉及一种用液相色谱串联质谱技术测定1，5-脱水葡萄糖醇的检测试剂盒。
背景技术：
：美国糖尿病控制与并发症研究小组(DCCT)指出预防糖尿病并发症的重要性在于严格的血糖控制。当前血糖控制的有效指标主要包括糖化血红蛋白、糖化血清蛋白、空腹血糖及餐后血糖，这些指标在反映血糖水平上各有特点。糖化血红蛋白是测定长期血糖水平(23月)的金标准，作为糖尿病并发症风险预测因子，在临床上广泛应用。但是该指标受红细胞寿命影响，不能反映近期血糖控制情况。糖化血清蛋白反映l-2周前的平均血糖水平，它受白蛋白量的影响，每天的波动较大。空腹和餐后2h血糖反映瞬间血糖水平，是糖尿病诊断筛选的常用指标，但对一段时间的血糖控制情况则无法提供信息。临床研究证实，1，5-脱水葡萄糖醇(1，5-anhydroglucito1，简称1,5_AG)能快速、灵敏地反映数天内血糖波动情况和餐后高血糖的变化情况，可作为短期血糖控制的指标。1，5-AG是吡喃葡萄糖的Cl-脱氧形式，又称l，5-脱水山梨醇，是存在于人脑脊液、血清和血浆中的多元醇糖类物质的一种，含量仅次于葡萄糖，在肾小管重吸收时被葡萄糖竞争性抑制，故在糖尿病人血中l，5-AG含量明显下降。有研究表明，在糖尿病时血中1，5-AG浓度下降，是一种可靠的、不受检测条件的影响、单项结果可以作为诊断糖尿病血糖控制的有效指标。日本已将l，5-AG检测列为糖尿病管理的常规指标，而美国近年来的临床试验也证实了1,5-AG在短期血糖控制方面的可行性。本研究显示l,5-AG与现有的血糖指标均呈现显著的负相关，血浆1，5-AG的减少程度与糖尿病严重程度显著相关。1，5-AG与其他指标最显著的区别是反应血糖变化的周期不同，而目前在糖尿病血糖监测指标中缺少短期的血糖监测指标，l，5-AG则弥补了血糖监测指标的不足，它可反映近几天至l周的血糖水平。有文献报道在短时期内1，5-AG的敏感性明显高于HbAlC。1，5-AG水平变化范围较大，特别在血糖接近正常血糖水平时。当HbAlC控制良好时，而1，5-AG不一定控制良好。如果出现1，5-AG单独偏低说明糖尿病控制程度出现急骤恶化，或者血浆葡萄糖水平的波动加大，这种现象尤见于I型糖尿病人。1，5-AG作为糖尿病血糖控制的新指标，能灵敏、准确地反映短期血糖控制水平，其测定不受采样条件影响(全血、血清或血浆标本均可，这三者呈显著相关，相关系数r>0.98)，标本可长期保存集中测定，并且不受年龄、饮食、肥胖、运动、应激及服用各种药物等影响，具有良好的临床应用价值。有研究表明1，5-AG能有效的监测餐后高血糖，可作为诊断糖尿病情好转与恶化趋势的敏锐指标，是对糖尿病全面监测的有效补充。因此选择l，5-AG作为血糖监测指标，结合HbAlC、PPG等其他监测指标，评估血糖控制情况，将有利于对糖尿病患者更全面地血糖监测，使血糖控制在理想的范围。目前国内外主要采用全酶法测定l,5-AG，，基于该原理的GlycoMark检测试剂盒2003年获得了美国FDA的批准。全酶法检测过程中，需要一系列的酶参与以消除葡萄糖干扰和生成有色物质进行检测，主要的吡喃糖氧化酶(PROD)来源困难,且试剂价格昂贵，检测容易受到内源性物质如葡萄糖、结合型胆红素、血红蛋白等干扰，其特异性有待进一步提高。在尿毒症病人中，血清肌酐的浓度明显升高，利用全酶法测定，导致过高的评价血清l，5-AG的浓度。
发明内容本发明的目的是提供一种能快速、灵敏地反映数天内血糖波动情况和餐后高血糖的变化情况指标1，5-AG的检测试剂盒及检测方法。本发明公开的l，5-AG检测试剂盒组成包括1.对照品:含0.02100Pg/ml1，5-AG和0.44(Hig/ml内标([UL_13C6]1，5-AG)的80%甲醇溶液。(相当于血样浓度O.1500Pg/ml1，5-AG)。2.质控品:含O.0680Pg/ml1，5_AG和0.440Hg/ml内标([UL_13C6]1，5-AG)的80%甲醇溶液。(相当于血样浓度O.3400Pg/ml1，5-AG)。3.蛋白沉淀剂:0.5-50Pg/ml内标([UL-13C6]1，5-AG)的甲醇或乙腈。采用本发明试剂盒进行l，5-AG检测的步骤包括l.血样采集采集静脉血至样品管中，室温放置，8小时内离心分离血浆。2.血样预处理取待测血浆于1.5ml离心管中，加210体积蛋白沉淀剂旋涡振荡IOsec，离心(15000gX3min)沉淀蛋白，取上清液进样测定。3.标准曲线的制备取对照品和质控品直接进样。4.液相色谱串联质谱(LC-MS/MS)测定条件4.1色谱条件高效液相色谱仪(HPLC)，包括泵、进样器、柱温箱和在线脱气仪等模块。分析柱采用硅胶键合相填料柱，包括氨基柱、硅胶柱、糖柱、氰基柱等类型分析柱，柱内径为1.05.0mm，柱长为30250mra。流动相由A相+8相组成A相为乙腈或甲醇，B相为水，A:B体积比为(20-90%):(10-80%)，采用等度洗脱，流速0.3mL/min，采用等度洗脱；或者梯度洗脱(随洗脱时间梯度变化，根据不同类型的分析柱进行设计和调整)，对于氨基柱，当A为乙腈，B水为时，可参考表l配比进行表1梯度洗脱时流动相啊A和B体积比时间(min)A(%)B(%)095533070430704.19554.2质谱条件电喷雾电离源(ESI)，负离子多反应监测扫描(MRM)。电喷雾电压-4500V，离子源温度450。C。离子选择通道(Ql/Q3):1，5-AG/z/zl63>101，IStz/z169〉105。离子通道范围可为土l.Oamu。5.浓度计算方法和检测限按内标法以峰面积或峰高法，计算l，5-AG在血中的含量。与现有技术相比，本发明具有以下有益结果本发明1，5-AG检测试剂盒，配备了用于测定含量的对照品和检验方法稳定性的质控品，配制的对照品和质控品溶剂，无需处理可直接进样，采用蛋白沉淀剂合并内标的方案，既简化了操作步骤，又保证了测定结果的正确性。本发明还对液相条件和质谱条件进行了优化，以氨基柱为分析柱，乙腈-水为流动相，等度洗脱，在负离子模式下，以多反应监测(MRM)进行定量，可获得较好的峰形、灵敏度和特异性。在150Pg/ml范围内1，5-AG线性关系良好(r〉0.999)，批内、批间精密度(RSD%)分别《6.37%和《8.75%，准确度为96.2103.1%。本方法简便、准确、快速、稳定、特异性强、灵敏度高，对待测物进行直接检测，无需衍生化、酶转化等复杂步骤，检测结果不受内源性物质的干扰，且试剂成本低廉，适用于临床大量样本的检测要求。具体实施例方式下面结合具体实施方式对本发明作进一步阐述，但并不限制本发明。实施例1试剂盒在临床样品测定上的应用用本试剂盒测定了159例2型糖尿病患者和290例对照人群血浆的1，5-AG含量，对照组包括267例体检人群和23例老年非糖尿病患者，其年龄、性别和1，5-AG测定结果见表2。糖尿病患者血浆l，5-AG按性别及总体水平显著低于青年和老年对照组(尸<0.001)。由于2型糖尿病是老年人群的常见病，在青年人群比较少见。在青年对照组和老年对照组中，1，5-AG含量存在明显的性别差异，男性显著高于女性(,<0.05)，而在糖尿病组则未显示性别上的统计差异。提示l，5-AG含量与糖尿病、性别有关，与年龄无关。合并青年对照组与老年对照组为正常对照组，正常对照组男女性别间1，5-AG的测定结果均呈正态分布，男女性别间呈显著统计差异，分别为28.80±7.91(ig/ml和19.03±5.77ng/ml(尸<0.001),故男性的正常参考值范围为13.3044.30)ag/ml，女性为7.7230.34吗/ml(正常参考值范围的计算为平均值土1.96SD)。实施例2检测条件与方法实例1.试剂盒的配制(1)对照品浓度为0.2，0.5，1，5，舰g/ml1，5-AG和分别加扭g/ml内标([UL-13C6]1，5-AG)的80%甲醇溶液，5个浓度点，每个200W。(2)质控品:浓度为0.6，3，84g/ml1，5-AG和分别加扭g/ml内标([UL-13Ce]1，5-AG)的80%甲醇溶液，3个浓度点，每个IOOOW。(3)蛋白沉淀剂5Pg/ml内标([UL_13C6]1，5-AG)的甲醇，总体积20ml。表2对照组和糖尿病组血浆1，5-AG含量组别性别例数年龄(岁)1,5-AG(ng/ml)青年对照组女18529.59±6.12##18.96±5.71男8231.11±8.46##28.97±7.57vv总体26730.06±6.94##22.03±7.84老年对照组女1481.71±11.8719.98±6.73男970.89±14.1527.26±10.92v总体2377.48±13.6122.83±9.13糖尿病组女10471.54±9.907.62±5.52**男5575.53±9.086.59±5.20**总体15972.92±9.787.26±5.42**注##尸<0.001，与老年对照组和糖尿病组比较；，<0.05，▽▽,<().01，组内性别比较；**尸<0.001，与青年对照组和老年对照组比较。2.血样采集釆集静脉血至样品管中，室温放置，8小时内离心分离血浆。3.样品处理取待测血浆50W于1.5ml离心管中，加200W蛋白沉淀剂旋涡振荡10sec，离心(15000gX3min)沉淀蛋白，取20W上清液进样测定。4.标准曲线的制备取对照品和质控品直接进样，相当于血样l，5-脱水葡萄糖醇浓度l，2.5，5，25，50和3，15，40Pg/ml。液相色谱串联质谱(LC-MS/MS)测定条件Shimadzu系列液相色谱仪(日本岛津公司)，包括LC20ADvp泵、SIL-HTc自动进样器和DGU-20A3在线脱气仪。分析柱CAPCELLPAKNH2UG80S5column(150mmX2.Ommi.d.，5um，Shiseido)。保护柱PhenomenexNH2(4.0mmX3.0腿i.d.5um)。流动相乙腈水(80:20，v/v)。流速0.3mL/min。总分析时间5min。7电喷雾电离源，负离子多反应监测扫描。电喷雾电压-4500V，离子源温度450°C。离子选择通道(Ql/Q3):1，5-AG163>101贝/z，IS169>105历/z。离子通道范围可为士l.Oamu。5.浓度计算方法按内标法以峰面积或峰高法，计算l，5-AG在血中的含量。实施例3浓度选择本实施例选择了不同的试剂浓度，按实施例2的检测条件和方法，测定了1，5-AG检测试剂盒的线性关系，准确度和精密度。对照品的浓度为0.05，0.5，5，50和1004g/ml1，5-AG和分别加30Pg/ml内标([UL-13C6]1，5-AG)的80%甲醇溶液。5个浓度点，每个200W。质控品的浓度为O.1，5，80PgMl，5-AG和分别加30Pg/ml内标([UL-13C6]1，5-AG)的80%甲醇溶液。3个浓度点，每个1000W。蛋白沉淀剂为37.5Pg/ml内标([UL-13C6]1，5-AG)的甲醇。总体积20ml。测定结果显示l，5-AG的线性关系为Y=0.0662X+1.216，相关系数r值为0.9993，准确度96.3-102.5%，精密度。/。CV为1.35-6.43%。获得准确、可靠的测定结果。实施例4色谱柱选择试剂盒、血样的采集及处理的方法，以及质谱条件与实施例2同，色谱条件中柱采用氨基柱CAPCELLPAKNH2UG80S5column(150mmX2.0咖i.d.，5um，Shiseido)。在此条件下，1，5-AG和内标的保留时间为3.6min，从代表性的等度洗脱条件下色谱图可见，在该保留时间处有一图形相同的波峰，无明显的内源性物质干扰。实施例5方法学验证采用实施例2所列的检测条件和方法，用试剂盒对测定方法进行了方法学验证。在血浆添加150Pg/ml浓度范围内，1，5-AG呈现良好的线性关系(r》0.9990)，最低检测限可达0.1Pg/ml。批内、批间精密度RSD分别《6.37%和《8.75%，准确度为96.2103.1%。回收率为98.0103.8%，RSD《3.3%，介质效应为94.5100.9%，1，5-AG贮备液在fC下放置2个月，样品处理后在室温下放置24h，血浆样品经过3次反复冻融，在室温下放置6h，和在-2(TC下保存3个月，稳定性考察结果表明，1，5-AG在上述条件是稳定的。方法学验证的结果说明LC-MS/MS可灵敏、准确、快速地对大批量临床样品进行检测。1.标准曲线和定量范围按实施例2方法配制成浓度分别为1，2.5，5，10，25，50Pg/ml的1，5-AG标准曲线，重复进样3次，共得3套标准曲线。以l，5-AG浓度为x轴，1，5-AG与内标峰面积之比为y轴，进行线性回归，建立回归方程。结果表明标准曲线方程为Y=0.0553X+0.197，3批次测定标准曲线的r值分别为0.9998，0.9997，0.9991。详见表3。本法的最低检测限为O.1Pg/ml。表31，5-AG标准曲线测定结果(3批次，每批11=2)理论浓度测定浓度(Pg/mL)Bias-均值CV(%)(Pg/mL)批次1批次2批次3(%)11.040.981.051.023.662.302.52.432.552.492.492.410.3554.855.155.095.033.150.591010.149.829.349.774.112.332525.124.3524.1324.532.081.905049.9350.6550.9650.511.051.03斜率0.05470.05430.05690.05532.53截距0.3290.1520.1090.197相关系数(r)0.99980.99970.99910.9995注CV:变异系数；Bias::偏倚。2.准确度与精密度按实施例2方法配制成浓度分别为1，3，15，40^g/ml的1，5-AG质控品。每种浓度配制6份，在同一天内按上述样品处理方法及液相色谱串联质谱条件进行处理和分析，计算批内精密度和准确度。按上述方法，分3天配制3批样品处理和分析，计算批间精密度和准确度。结果见表4，批内、批间精密度CV%《10%,准确度90110%之间。表4准确度和精密度结果(3批次，每批『6)<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>3.回收率和基质效应样品浓度、处理方法和进样条件都同精密度和正确度项下，测得回收率结果见表5，回收率均在90110%之间。基质效应影响很小。表5回收率和基质效应结果(n=6)<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>表6稳定性结果<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>(表6续)血样室温下短期稳定性(室温下6h)33.07.099.71515.36.6101.94039.74.899.3长期稳定性(-加。C下存放3个月)33.04.9鳳11515.83.7105.34038.03.794.94.稳定性样品浓度、处理方法和进样条件都同精密度和准确度项下，考察自动进样器中24小时、冻融3次、室温放置6小时、-20°。放置3个月，测得精密度和准确度结果见表6，精密度CVy。《10%，准确度90110%之间。实施例61，5-AG与其他血糖指标相关性分析本研究同时测定了空腹血糖(FBG)、餐后血糖(PPG)、糖化血红蛋白(HbAlc)、糖化血清蛋白(FA)等其他血糖检测指标，分析l，5-AG与这些指标的相关性。作为一个新的血糖检测指标，1，5-AG与上述传统的指标均显示出明显的相关性。1，5-AG与FBG、PPG、HbAlc和FA的相关系数r分别为-0.351(n=77，7°<0.005)、—0.408(n=81，P<0.001)、—0.635(n=166，尸<0.001)、—0.539(n=63，尸<0.001)。由于临床血糖监测大多数情况下，采用比较简便的手指取血进行血糖测定，用于糖尿病人诊断和治疗效果评价。临床样本常见的有血清和血浆样本，本研究同时釆集44例糖尿病患者的血清、血浆和手指血，测定样品中的l，5-AG含量，分析三者之间的相关性。结果显示三种血样1，5-AG无统计差异(,<0.05)，但呈显著相关(尸<0.001)，相关系数r分别为0.994(血清与血浆)、0.984(血清与手指血)、0.980(血浆与手指血)。1权利要求1、1，5-脱水葡萄糖醇检测试剂盒，其特征在于组成包括(1)对照品含0.02—100μg/ml1，5脱水葡萄糖醇和0.4—40μg/ml内标([UL-13C6]1，5脱水葡萄糖醇)的80％甲醇溶液；(2)质控品含0.06—80μg/ml1，5-AG和0.4—40μg/ml内标([UL-13C6]1，5脱水葡萄糖醇)的80％甲醇溶液；(3)蛋白沉淀剂0.5-50μg/ml内标([UL-13C6]1，5脱水葡萄糖醇)的甲醇或乙腈。2、1，5-脱水葡萄糖醇检测试剂盒的检测方法包括以下步骤(1)血样采集采集静脉血至样品管中，室温放置，8小时内离心分离血浆；(2)血样预处理取待测血浆于1.5ml离心管中，加2-10体积蛋白沉淀剂旋涡振荡IOsec，离心15000gX3min沉淀蛋白，取上清液进样测定；(3)标准曲线的制备取对照品和质控品直接进样；(4)液相色谱串联质谱测定；(4.1)色谱条件采用硅胶键合相填料柱，流动相由八相+B相组成A相为乙腈或甲醇，B相为水，A:B体积比为(20-90%):(10-80%)，采用等度洗脱；或者梯度洗脱，流动相组成配比随洗脱时间梯度变化；(4.2)质谱条件电喷雾电离源ESI，负离子多反应监测扫描MRM，离子选择通道Q1/Q3:1，5脱水葡萄糖醇w/zl63〉101，ISw/z169>105。离子通道范围可为±1.0amu;(5)浓度计算方法和检测限按内标法以峰面积或峰高法，计算l，5脱水葡萄全文摘要1，5-脱水葡萄糖醇检测试剂盒，包括(1)对照品含0.02-100μg/ml1，5-AG和0.4-40μg/ml内标([UL-¹³C₆]1，5-AG)的80％甲醇溶液；(2)质控品含0.06-80μg/ml1，5-AG和0.4-40μg/ml内标([UL-¹³C₆]1，5-AG)的80％甲醇溶液；(3)蛋白沉淀剂0.5-50μg/ml内标([UL-¹³C₆]1，5-AG)的甲醇或乙腈。采用液相色谱串联质谱测定法检测。本发明的优点是配制的对照品和质控品溶剂，无需处理可直接进样，采用蛋白沉淀剂合并内标的方案，既简化了操作步骤，又保证了测定结果的正确性。本发明还对液相条件和质谱条件进行了优化，可获得较好的峰形、灵敏度和特异性。方法简便、准确、快速、稳定，无需衍生化、酶转化等复杂步骤，检测结果不受内源性物质的干扰，且试剂成本低廉，适用于临床大量样本的检测要求。文档编号G01N33/48GK101446582SQ200810202009公开日2009年6月3日申请日期2008年10月30日优先权日2008年10月30日发明者琛余,刘罡一,周菊珍,张梦琪,李水军,盛宏光,怡缪,衡晓香,贾晶莹,川陆申请人:上海市徐汇区中心医院;余琛;盛宏光