一种α?甘草次酸含量的检测方法
【专利摘要】本发明公开了一种α?甘草次酸含量的检测方法，包括（1）设定高效液相色谱条件；（2）制备对照品溶液；（3）制备供试品溶液；（4）含量测定：分别取对照品溶液和供试品溶液各5μl，注入液相色谱仪，进行高效液相色谱仪的操作，并记录色谱图，然后，利用色谱图计算α?甘草次酸的含量。本发明实现了对α?甘草次酸的质量检测，经过试验表明，该方法线性关系、重现性、精密度、稳定性、回收率均较好，且本发明所述方法准确、简便、快捷，能够更有效、全面的控制α?甘草次酸的质量。
【专利说明】
一种a-甘草次酸含量的检测方法
技术领域
[0001] 本发明涉及一种a-甘草次酸含量的检测方法，属于医药化工技术领域。
【背景技术】
[0002] 甘草为豆科植物甘草的干燥根及根茎，具有补脾益气、清热解毒、润肺止咳、调和 诸药之功效，素有"十药九草"、"无草不药"之称。甘草中主要含有甘草酸、甘草次酸、黄酮、 生物碱、氨基酸等化学成分，具有广泛的生理活性。甘草酸是甘草中最为重要的化学成分， 具有消毒、消炎、抗过敏、治疗溃疡、镇咳、抗肿瘤和防治病毒肝炎、高血脂症和抗癌症等疾 病的作用，引起药理学家和化学家的极大重视。
[0003] 天然甘草中的甘草酸存在两种差向异构体18a体和1邪体，其中以1邪体为主。由于 构型上的差异，18a体的位阻效应，使其亲脂性大于18例本，在体内易与受体蛋白结合。甘草 次酸是从天然植物药甘草(Glycyrrhiza Uralensis)的根中提取的甘草酸经过水解后精制 而得。药理实验证明，甘草次酸作为甘草酸在体内代谢的产物，在血液中能够得到很好的吸 收，其药理应用因而也比较广泛。甘草次酸通过诱导肿瘤细胞的凋亡和分化、阻滞细胞周 期、抑制肿瘤多药耐药性以及抑制促癌剂的诱癌作用等方式，对肝癌、肺癌、胃癌及白血病 等多种肿瘤细胞系的体外生长具有广泛的抑制作用，同时对正常体细胞的毒性较小。目前 市场上的a构型的甘草酸类成分药品多以a-甘草酸二铵盐或异甘草酸镁等为主要成分，其 疗效已经得到广泛的证实，而以甘草次酸，尤其是甘草次酸为主要成分的药品则未见上 市或报道，因此，对于其进行的相关研究则显得更为重要。药品的研究必然需要有高效可行 的检测方法来进行分析处理，因而，开发研究一种甘草次酸的检测方法则成为必然，也为 其质量控制提供了保障。
【发明内容】
[0004] 为了解决上述问题，本发明的目的在于提供一种操作简单，具有良好的精密度、重 现性和可靠性，可用于甘草次酸的质量控制的甘草次酸含量的检测方法。
[0005] 本发明的技术方案为： 一种a-甘草次酸含量的检测方法，其特征在于，包括以下步骤： (1)设定高效液相色谱条件:色谱柱为Agilent TC-C18:4.6 mmX250 mm，5 um，以水为 流动相A，以乙腈为流动相B，溶剂为甲醇，洗脱方式为梯度洗脱，流速为l.OmL ? min-1，柱 温为30°C，检测波长为244nm，进样量5yl; 所述的梯度洗脱中流动相A和流动相B在不同的时间段的浓度关系如下表所示：
[0006] (2)制备对照品溶液：称取a-甘草次酸对照品，置于容量瓶中，加入质量比为1:1 的流动相A和流动相B，稀释至刻度，摇匀，制成浓度为0.980mg ? ml-1的溶液，得到对照品 溶液； (3) 制备供试品溶液：称取a_甘草次酸供试品粉末，置于容量瓶中，加入甲醇溶解a_甘 草次酸供试品粉末，超声提取30min，静置，再用甲醇稀释至刻度，摇匀，用0.45wii微孔滤膜 滤过，即得供试品溶液； (4) 含量测定：分别取对照品溶液和供试品溶液各5iU，注入液相色谱仪，进行高效液 相色谱仪的操作，并记录色谱图，然后，利用色谱图计算甘草次酸的含量。
[0007] 上述的步骤（1)中，优选，洗脱时的流速为l.OmL ^化―S柱温为30°C，检测波长为 244nm〇
[0008] 此外，a-甘草次酸含量的检测方法还包括对a-甘草次酸对照品溶液浓度和峰面积 积分值A进行线性回归的步骤。
[0009] 具体方法为:取不同浓度的a-甘草次酸对照品溶液，注入液相色谱仪，进行高效液 相色谱仪的操作，并记录色谱图，得到线性回归方程为：A = 8.20 X 106C+11350.2，R = 0.9999，且所述的A为峰面积积分值，而所述的C为a-甘草次酸对照品溶液浓度。
[0010] 当然，还可以包括对高效液相色谱仪进行精密度检测的步骤、对供试品溶液的稳 定性进行检测的步骤、检验甘草次酸的含量检测方法的重复性的步骤、进行加样回收率 实验的步骤或进行a-甘草次酸最低检测浓度测定的步骤。
[0011]且所述的a-甘草次酸最低检测浓度为0.0261lig ? mL-工。
[0012] 本发明的有益效果为:本发明所述检测方法以纯的甲醇作提取溶剂，较之于稀乙 醇、稀甲醇、流动相等其他溶剂，提取效率更高更完全;且本发明所述检测方法以乙腈和水 的二元高压梯度为流动相，该方法简便，灵敏度高，重现性好，样品分离度、对称性及峰形均 较好，且保留时间适中，更加适合于常规检测。
【附图说明】
[0013] 图1为a-甘草次酸对照品溶液的高效液相色谱图； 图2为某一批次的a_甘草次酸对照品溶液的高效液相色谱图； 图3为另一批次的a_甘草次酸对照品溶液的高效液相色谱图。
【具体实施方式】
[0014] 下面结合具体实施例对本发明进行详细的说明。
[0015] 实施例1:设定高效液相色谱条件 色谱柱为Agilent TC_C18:4.6 mmX250 mm，5 um，以水为流动相A，以乙腈为流动相 B，溶剂为甲醇，洗脱方式为梯度洗脱，流速为1 .OmL ? mirT1，柱温为30°C，检测波长为 244nm，进样量 5yl， 所述的梯度洗脱中流动相A和流动相B在不同的时间段的浓度关系如下表所示：
[0016]实施例2:制备对照品溶液 称取a-甘草次酸对照品49. Omg，精密称定，置于50ml容量瓶中，加入流动相稀释至刻 度，摇匀，制成浓度为0.980mg ? mr1的溶液，得到对照品溶液(储备液）。
[0017] 实施例3:制备供试品溶液 称取a-甘草次酸供试品粉末30mg，精密称定，置于50ml容量瓶中，加入甲醇溶解a-甘草 次酸供试品粉末，超声提取30min，静置，再用甲醇稀释至刻度，摇匀，用0.45wii微孔滤膜滤 过，即得供试品溶液。
[0018] 实施例4:对a-甘草次酸对照品溶液浓度和峰面积积分值A进行线性回归 精密量取对照品贮备液〇.2、0.6、1.0、1.4、1.8 mL，置于10 mL容量瓶中，加质量比为1: 1的流动相A和流动相B稀释至刻度，摇匀，得到含a-甘草次酸分别为〇. 0196、0.0588、0.098、 0.1372、0.1764 mg ? ml/1的对照品溶液，分别精密吸取上述各对照品溶液5此，按上述色谱 条件进行测定，以峰面积积分值(A)对对照品溶液浓度(C)进行线性回归，得回归方程为A = 8.20X 106C+11350.2(R=0.9999)〇
[0019] 图1为a-甘草次酸对照品溶液的高效液相色谱图。
[0020] 如图1所示:a-甘草次酸检测浓度在0.0196-0.1764 mg ? mL-1范围内与峰面积积 分值呈良好的线性关系。
[0021] 实施例5:对高效液相色谱仪进行精密度检测 精密吸取浓度为0.098 mg ?ml/1的对照品溶液5此，按上述色谱条件连续进样6次，测 定峰面积积分值分别为：819797、818425、810797、823438、821032、819467。结果，RSD = 0.52 %，表明仪器精密度良好。
[0022] 实施例6:对供试品溶液的稳定性进行检测 精密量取同一供试品溶液5yL，分别在0、1、2、3、4、24h进样测定，测得峰面积积分值分 别为：1546674、1568425、1540797、1536771、1547698、1572801，均值为 1552194 ? 3，结果：RSD = 0.96%，表明供试品溶液在24 h内稳定。
[0023] 实施例7:检验a-甘草次酸的含量检测方法的重复性 称取同一甘草样品粉末约30 mg，平行6份，精密称定，按实施例3所述方法制备供试品 溶液，精密吸取5yL，按上述色谱条件测定，测得峰面积积分值分别为：787463、802338、 799935、785958、780341、786885，均值为790486.7;结果，RSD= 1.10%，表明本发明所述方 法重复性较好。
[0024]实施例8:加样回收率实验 取已知含量的a-甘草次酸供试品9份，每份约30 mg，精密称定，加入相应量的对照品， 按上述方法制备供试品溶液，按上述色谱条件测定，计算加样回收率，结果见表1。
[0025]表1加样回收率试验结果(n = 9)
[0026 ]实施例9: a -甘草次酸最低检测浓度测定 将对照品溶液稀释测定，测得信噪比为3:1时，甘草酸的最低检测浓度为0.0261 yg* mL_1〇
[0027] 实施例10:样品含量测定 取5个不同批次的a-甘草次酸样品各30 mg，精密称定，按照实施例3的方法制成供试品 溶液，分别取供试品溶液各5iU，注入液相色谱仪，进行高效液相色谱仪的操作，并记录色谱 图，然后，利用色谱图计算a-甘草次酸的含量。
[0028] 图2为某一批次的a_甘草次酸对照品溶液的高效液相色谱图；图3为另一批次的a_ 甘草次酸对照品溶液的高效液相色谱图。
[0029] 根据图2和图3的高效液相色谱图，得到各批次的a-甘草次酸样品含量测定结果如 表2所示： 表2不同批次的a-甘草次酸样品含量测定结果
上述a-甘草次酸含量测定方法实现了对a-甘草次酸的质量检测，经过试验表明，该方 法线性关系、重现性、精密度、稳定性、回收率均较好，且本发明所述方法准确、简便、快捷， 能够更有效、全面的控制甘草次酸的质量。
[0030] 以上【具体实施方式】不以任何形式限制本发明，凡是以等同替换或等效变换的方式 所获得的技术方案，均落在本发明的保护范围内。
【主权项】
1. 一种a-甘草次酸含量的检测方法，其特征在于，包括以下步骤： (1) 设定高效液相色谱条件:色谱柱为Agilent TC-C18:4.6 mmX 250 mm，5 um，以水为 流动相A，以乙腈为流动相B，溶剂为甲醇，洗脱方式为梯度洗脱，流速为l.OmL ?mirT1，柱 温为30°C，检测波长为244nm，进样量5yl， 所述的梯度洗脱中流动相A和流动相B在不同的时间段的浓度关系如下表所示：(2) 制备对照品溶液：称取a-甘草次酸对照品，置于容量瓶中，加入质量比为1:1的流 动相A和流动相B，稀释至刻度，摇匀，制成浓度为0.980mg ? ml-1的溶液，得到对照品溶 液； (3) 制备供试品溶液：称取a_甘草次酸供试品粉末，置于容量瓶中，加入甲醇溶解a_甘 草次酸供试品粉末，超声提取30min，静置，再用甲醇稀释至刻度，摇匀，用0.45wii微孔滤膜 滤过，即得供试品溶液； (4) 含量测定：分别取对照品溶液和供试品溶液各5iU，注入液相色谱仪，进行高效液 相色谱仪的操作，并记录色谱图，然后，利用色谱图计算甘草次酸的含量。2. 根据权利要求1所述的一种a_甘草次酸含量的检测方法，其特征在于，步骤（1) 中，洗脱时的流速为1 .OmL ? min-、柱温为30°C，检测波长为244nm。3. 根据权利要求1所述的一种a_甘草次酸含量的检测方法，其特征在于，还包括对a_甘 草次酸对照品溶液浓度和峰面积积分值A进行线性回归的步骤。4. 根据权利要求3所述的一种a-甘草次酸含量的检测方法，其特征在于，对a-甘草次酸 对照品溶液浓度和峰面积积分值A进行线性回归的方法为:取不同浓度的a-甘草次酸对照 品溶液，注入液相色谱仪，进行高效液相色谱仪的操作，并记录色谱图，得到线性回归方程 为:A = 8.20 X 106C+11350.2，R = 0.9999，且所述的A为峰面积积分值，而所述的C为a-甘草 次酸对照品溶液浓度。5. 根据权利要求1所述的一种a_甘草次酸含量的检测方法，其特征在于，还包括对高效 液相色谱仪进行精密度检测的步骤。6. 根据权利要求1所述的一种a_甘草次酸含量的检测方法，其特征在于，还包括对供试 品溶液的稳定性进行检测的步骤。7. 根据权利要求1所述的一种a_甘草次酸含量的检测方法，其特征在于，还包括检验a_ 甘草次酸的含量检测方法的重复性的步骤。8.根据权利要求1所述的一种a_甘草次酸含量的检测方法，其特征在于，还包括进行加 样回收率实验的步骤。 9 .根据权利要求1所述的一种a_甘草次酸含量的检测方法，其特征在于，还包括进行a_ 甘草次酸最低检测浓度测定的步骤。10.根据权利要求1所述的一种甘草次酸含量的检测方法，其特征在于，所述的a_甘 草次酸最低检测浓度为〇.〇261邱.1111/1。
【文档编号】G01N30/02GK106053649SQ201610406470
【公开日】2016年10月26日
【申请日】2016年6月12日
【发明人】季浩, 张宇, 于燕燕, 阚建伟, 刘佳, 徐娟
【申请人】江苏天晟药业股份有限公司