检测乳样中乳铁蛋白含量的方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及乳品检测技术领域，具体地说，涉及一种检测乳样中乳铁蛋白含量的 方法。
【背景技术】
[0002] 乳铁蛋白（lactoferrin，LF)是乳汁中一种重要的非血红素铁结合糖蛋白，在中性 粒细胞颗粒中具有杀菌活性的单体糖蛋白。其分子量为80kDa，主要由乳腺上皮细胞表达和 分泌。乳铁蛋白不仅参与铁的转运，而且具有广谱抗菌、抗氧化、抗癌、调节免疫系统等强大 生物功能，被认为是一种新型抗菌、抗癌药物和极具开发潜力的食品和饲料添加剂。
[0003] 目前，测定乳制品中乳铁蛋白含量的方法包括免疫酶联吸附法(ELISA法）、高效毛 细管电泳法、紫外分光光度法、高效液相色谱法、凝胶色谱法等多种方法。ZL201410482589 公开了将乳样离心处理得到含有乳铁蛋白粗提物的乳清，再通过过滤得到乳铁蛋白精提 物;最后进行高效液相色谱测定确定样品中乳铁蛋白的含量。ZL201310567858公开了将待 测乳制品离心除去上浮的脂肪;然后将除去脂肪的样品溶液的pH值调节到乳铁蛋白的等电 点使样品中的乳铁蛋白沉淀，离心后弃去上清液;将乳铁蛋白沉淀用三氟乙酸溶液溶解，进 行高效液相色谱分析检测乳铁蛋白的含量。ZL201310187213公开了一种适于大批量样本的 快速检测，可以满足各类乳制品中牛乳铁蛋白的准确定量的试剂盒;US20140308749公开了 一种使用电泳和红外荧光在婴幼儿配方奶粉中检测乳铁蛋白的方法。以上方法步骤繁琐， 价格昂贵，检测结果差异较大，不适合工业规模检测。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的是提供一种快速、准确、样品预处理简单的检测乳样中乳铁蛋白含 量的方法。
[0005] 为了实现本发明目的，本发明提供的检测乳样中乳铁蛋白含量的方法，包括对乳 样离心脱脂，过滤，亲和层析纯化以及用C4或C8色谱柱进行高效液相色谱检测等步骤。
[0006] 其中，对乳样离心脱脂的具体操作为:将乳样以2000-4000rpm离心5-20min，得到 脱脂乳。然后，将脱脂乳用〇. 22μπι滤器过滤，收集滤液。
[0007] 亲和层析具体操作为:将滤液上样到经2-10ms/cm，pH6.0-8.0的磷酸盐缓冲液或 Tris缓冲液平衡的含有亲和固相吸附剂的亲和层析柱(优选HiTrap Heparin HP)上，流速 为1-51111/111；[11，用电导为1701118/0]1以下的氯化钠或氯化钾缓冲液4!16.〇-8.0的磷酸盐缓冲 液或Tris缓冲液洗脱，收集富含乳铁蛋白的洗脱液。
[0008] 高效液相色谱检测具体操作为:将收集的富含乳铁蛋白的洗脱液用0.22μπι滤器过 滤，收集滤液，上样到粒径为3.5μηι，规格为4.6mm X 25cm的04柱（优选Waters X Bridge BH1300 C4色谱柱），进行高效液相色谱检测。本发明还可以采用由不同公司提供的各种型 号和规格的反相柱进行高效液相色谱检测。
[0009] 流动相A为含有0.1 %三氟乙酸的20%乙腈水溶液，流动相B为含有0.1 %三氟乙酸 的80%乙腈水溶液，柱温为20-35°(3，检测波长为214-28011111，流速为0.3-11111/1^11。具体过程 见表1。
[0010]表1高效液相色谱检测条件
[0012] 本发明所述乳铁蛋白包括重组人乳铁蛋白和牛内源乳铁蛋白。所述乳样优选转基 因牛乳。
[0013] 本发明提供了一种成本低廉、检测简便、准确性高，可从乳样中同时测定重组人乳 铁蛋白和牛内源乳铁蛋白含量的方法，特别适用于转基因乳样中重组人乳铁蛋白及牛内源 乳铁蛋白的检测，本方法重复性好，具有较强的可操作性。
【附图说明】
[0014] 图1为本发明实施例1中人乳铁蛋白的HPLC图谱。
[0015]图2为本发明实施例1中牛乳铁蛋白标准品的HPLC图谱。
[0016]图3为本发明实施例3中亲和色谱纯化色谱图，其中，FT为杂蛋白穿透组分;P为含 有乳铁蛋白（重组人乳铁蛋白和牛内源乳铁蛋白）组分。
[0017]图4为本发明实施例4中分离重组人乳铁蛋白与牛内源乳铁蛋白的HPLC图谱，其 中，P1为重组人乳铁蛋白分离峰;P2为牛内源乳铁蛋白分离峰。
【具体实施方式】
[0018] 以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例 中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，所用原料均为市售商品。
[0019] 实施例中所用的主要试剂如下：人、牛乳铁蛋白标准品购自Sigma公司；乙腈购自 赛默飞世尔科技有限公司；三氟乙酸购自Sigma公司；95%乙醇购自国药集团化学试剂有限 公司；二水合磷酸二氢钠、氯化钠、氢氧化钠购自西陇化工股份有限公司。
[0020] 实施例中所用的主要试验仪器如下：高效液相色谱1260Infinity购自安捷伦科技 有限公司；Waters X Bridge BEH300C4色谱柱购自沃特世公司；AKTA Purifier快速蛋白液 相层析系统、HiTrap Heparin HP购自GE公司；台式高速离心机5810R购自Eppendorf公司。 [0021]实施例1人乳铁蛋白和牛乳铁蛋白标准曲线的绘制
[0022] 准确称取人和牛乳铁蛋白标准品，分别配制成浓度为4mg/ml、3.5mg/ml、3mg/ml、 2 · 5mg/ml、2mg/ml、lmg/ml的人乳铁蛋白溶液以及浓度为1 · 5mg/ml、lmg/ml、0 · 8mg/ml、 0 · 5mg/ml、0 · 3mg/ml、0mg/ml的牛乳铁蛋白溶液，使用高效液相色谱Waters X Bridge BEH300C4色谱柱测定，选择波长为280nm，绘制人乳铁蛋白标准曲线为y = 2108.9x-39.216 (R2 = 0.9998)，牛乳铁蛋白标准曲线为7=1990.91+16.219(1?2 = 0.9997)。图1为人乳铁蛋白 的HPLC图谱，图2为牛乳铁蛋白标准品的HPLC图谱。
[0023]实施例2含重组人乳铁蛋白乳样的预处理
[0024]收集含有重组人乳铁蛋白的转基因哺乳动物奶样，以转基因牛奶为优选。将上述 奶样分装于50ml离心管中，配平后置于台式高速离心机中，以2000rpm离心10min，离心结束 后，弃去乳脂，得到脱脂乳。
[0025]实施例3亲和色谱纯化重组人乳铁蛋白与牛内源乳铁蛋白 [0026] 实施例2得到的脱脂乳用0.22μπι滤器过滤，上样到用3mS/cm，pH7.0磷酸盐缓冲液 平衡的HiTrap Heparin HP层析柱上，流速为5ml/min，上样结束后，使用84ms/cm的氯化钠， PH7.0的磷酸盐缓冲液洗脱含有乳铁蛋白的纯化液(洗脱液）。图3为亲和色谱纯化色谱图， FT为杂蛋白穿透组分;P为含有乳铁蛋白（重组人乳铁蛋白和牛内源乳铁蛋白）组分。
[0027]实施例4高效液相色谱测定重组人乳铁蛋白与牛内源乳铁蛋白的含量 [0028] 实施例3得到的富含乳铁蛋白的纯化液用0.22μπι滤器过滤，取100μΙ溶液上机进 样，在高效液相色谱Waters X Bridge BEH300C4色谱柱中进行梯度洗脱，方法如表2所示： [0029]表2梯度洗脱条件
[0031]结果表明，转基因奶样中重组人乳铁蛋白浓度为3.3mg/ml，牛乳铁蛋白浓度为 0.3mg/ml，图4为分离重组人乳铁蛋白与牛内源乳铁蛋白的HPLC图谱，P1为重组人乳铁蛋白 分离峰;P2为牛内源乳铁蛋白分离峰。
[0032]虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在 本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因 此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
【主权项】
1. 检测乳样中乳铁蛋白含量的方法，其特征在于，包括对乳样离屯、脱脂，过滤，亲和层 析纯化W及用C4或C8色谱柱进行高效液相色谱检测的步骤。2. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，对乳样离屯、脱脂的具体操作为:将乳样W 2000-4000巧m离屯、5-20min，得到脱脂乳。3. 根据权利要求2所述的方法，其特征在于，将脱脂乳用0.22μπι滤器过滤，收集滤液。4. 根据权利要求3所述的方法，其特征在于，亲和层析具体操作为:将滤液上样到经2- 10ms/cm，p册.0-8.0的憐酸盐缓冲液或Tris缓冲液平衡的含有亲和固相吸附剂的亲和层析 柱上，流速为l-5ml/min，用电导为170ms/cmW下的氯化钢或氯化钟缓冲液，P册.0-8.0的憐 酸盐缓冲液或Tris缓冲液洗脱，收集富含乳铁蛋白的洗脱液。5. 根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述亲和层析柱为化化ap Heparin HP。6. 根据权利要求4所述的方法，其特征在于，高效液相色谱检测具体操作为:将收集的 富含乳铁蛋白的洗脱液用0.22μπι滤器过滤，收集滤液，上样到粒径为3.5μπι，规格为4.6mm X 25cm的C4色谱柱，进行高效液相色谱检测。7. 根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述C4柱为Waters X化idge B邸300 C4 色谱柱。8. 根据权利要求6所述的方法，其特征在于，流动相A为含有0.1 %Ξ氣乙酸的20 %乙腊 水溶液，流动相B为含有0.1 % Ξ氣乙酸的80 %乙腊水溶液，柱溫为20-35°C，检测波长为 214-28〇11111，流速为0.3-11111/111；[]1;具体过程如下：9. 根据权利要求1-8任一项所述的方法，其特征在于，所述乳铁蛋白包括重组人乳铁蛋 白和牛内源乳铁蛋白。10. 根据权利要求1-8任一项所述的方法，其特征在于，所述乳样为转基因牛乳。
【专利摘要】本发明提供一种检测乳样中乳铁蛋白含量的方法，包括对乳样离心脱脂，过滤，亲和层析纯化以及用C4或C8色谱柱进行高效液相色谱检测等步骤。本方法成本低廉、检测简便、准确性高，可从乳样中同时测定重组人乳铁蛋白和牛内源乳铁蛋白含量的方法，特别适用于转基因乳样中重组人乳铁蛋白及牛内源乳铁蛋白的检测，本方法重复性好，具有较强的可操作性。
【IPC分类】G01N30/02
【公开号】CN105572246
【申请号】CN201510917468
【发明人】赵建敏, 王建武, 王曦
【申请人】无锡科捷诺生物科技有限责任公司, 北京济普霖生物技术有限公司
【公开日】2016年5月11日
【申请日】2015年12月10日