奶粉中三种脂溶性维生素a,e和k1的检测方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及脂溶性维生素的检测方法，尤其涉及奶粉中三种脂溶性维生素A，E和 I的检测方法。
【背景技术】
[0002] 脂溶性维生素A，E，&通常作为营养强化剂添加到配方奶粉中。维生素A又称视 黄醇，主要生理功能是维持视觉和骨骼健康、参与细胞分裂和细胞识别、参与生长、生殖及 维持免疫系统的完整性等。维生素E又称生育酚，自然界中共有8种：α_，β_，γ_，δ-生 育酚和α-，β-，γ-，δ-三烯生育酚，其中以α-生育酚的生物学活性最强。维生素&别 名植物甲萘醌，控制血液凝结，是凝血蛋白在肝内合成必不可少的物质。这几种脂溶性维生 素在外界环境中不稳定，很容易受光、氧等影响而被氧化破坏。目前配方奶粉中脂溶性维生 素的测定方法通常是：样品经过酶解和皂化处理后，用非极性有机溶剂（常用的有石油醚、 正己烷、乙醚等）液液萃取，然后用反相色谱法进行分离检测，前处理过程溶剂消耗量大、 操作繁琐且测定结果不稳定。
[0003] 配方奶粉中通常不直接添加维生素Α和维生素Ε，而是添加维生素Α酯和维生素 E酯，因此需先将样品通过皂化处理后，将待测维生素游离出来后再进行检测，方法复杂繁 琐。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的在于提供一种简便、快速、高灵敏的奶粉中脂溶性维生素A、E和Ki 的检测方法。
[0005] 为实现上述目的，本发明提供一种奶粉中脂溶性维生素A，E和&的检测方法，其 特征在于，步骤为，
[0006] 样品制备：称取样品于比色管中，加入温水溶解定容至刻度后，取部分定容后的样 品溶液于离心管中，加入无水乙醇沉淀蛋白，再加入正己烷提取，加入饱和氯化钠溶液抑制 乳化，混匀后高速离心分层，取最上面的正己烷层氮气吹干后，用甲醇溶解定容，经0. 22μm 滤膜过滤后即可；
[0007] 样品检测：将待测样品和标准工作溶液在液相色谱-串联质谱仪检测，分别进样， 获得以标准溶液中维生素A、维生素A醋酸酯、维生素A棕榈酸酯、维生素E、维生素E醋酸 酯、维生素1这6种脂溶性维生素的浓度为横坐标，再以标准溶液中维生素A、维生素A醋 酸酯、维生素A棕榈酸酯、维生素E、维生素E醋酸酯、维生素&这6种脂溶性维生素的峰面 积为纵坐标的工作曲线；用工作曲线对定量离子进行定量计算获得待测样品溶液中6种脂 溶性维生素的浓度；维生素A以维生素A、维生素A醋酸酯、维生素A棕榈酸酯换算成维生 素A的总量计算，维生素E以维生素E、维生素E醋酸酯换算成维生素E的总量计算；具体 换算方法如下：
[0008]
[0009]
[0010] C维生素K1 =C维生素K1 ;
[0011] 其中表示维生素A的浓度，C 表示维生素A醋酸酯的浓度，以此类 推；
[0012] 即得到待测样品的维生素A、维生素E、维生素&的浓度。
[0013] 进一步，所述样品制备为称取0· 5~2. 0g左右样品于5~20mL比色管中，加入 40~60°C温水溶解定容至刻度，优选45°C温水；，分取1~2mL于20mL离心管中，加入 2~10mL无水乙醇沉淀蛋白，然后加入1~5mL正己烧提取，并加入2~10mL饱和氯化钠 溶液抑制乳化，混匀后5000rpm高速离心，取正己烷层氮气吹干后，用甲醇溶解定容至lmL 或2mL，经0. 22μm滤膜过滤后即可。
[0014] 进一步，所述标准工作溶液为10. 0μg/mL的维生素A、维生素A醋酸酯、维生素A 棕榈酸酯、维生素E、维生素E醋酸酯和维生素&的乙醇溶剂的标准工作溶液。
[0015] 进一步，所述液相色谱-串联质谱仪的检测为，选用水-乙腈为流动相，反相液相 色谱柱分离，采用大气压化学电离串联质谱进行检测，正离子扫描模式，多反应监测MRM扫 描检测，外标法定量；
[0016] 色谱条件：PhenomenexKinetexC18色谱柱（100X4. 6mmi.d.，粒径 2. 6μm); 柱温35°C;流速l.OmL/min;进样量5yL;流动相为水（A)和乙腈（B)，梯度洗脱程序： 0-4. 0min,90%B；4. 1-18.Omin, 100%B；18. 1-22. 0min,90%B；
[0017] 质谱条件：离子源为大气压化学电离源（APCI);扫描方式为正离子扫描；检测方 式为多反应监测（MRM);喷雾气65psi，气帘气30psi，碰撞气medium，离子源温度350°C， 电流3. 0μA,入口电压和出口电压均为10V，驻留时间50ms ;监测离子对：维生素A为 269. 2/92. 9和269. 2/213. 1、维生素A醋酸酯为269. 2/92. 9和269. 2/213. 1、维生素A棕榈 酸酯为269. 2/92. 9和269. 2/213. 1、维生素E为431. 4/137. 1和431. 4/165. 1、维生素E醋 酸酯为473. 4/165. 1和473. 4/207. 1，维生素 &为451. 4/171. 1和451. 4/187. 1;化合物保 留时间：维生素A为2. 33min、维生素A醋酸酯为3. 48min、维生素A棕榈酸酯为16. 50min、 维生素E为8.Olmin、维生素E醋酸酯为8.77min,维生素1为9. 70min;去簇电压：维生素 A为98V、维生素A醋酸酯为62V、维生素A棕榈酸酯为82V、维生素E为168V、维生素E醋 酸酯为201V，维生素&为227V ;碰撞能量：维生素A为26V和17V、维生素A醋酸酯为26V 和17V、维生素A棕榈酸酯为26V和17V、维生素E为61V和27V、维生素E醋酸酯为50V和 24V，维生素KiS41V和32V。
[0018] 标准储备液的配制：
[0019] 维生素A(视黄醇，纯度95. 5 % )、维生素A醋酸酯（视黄醇醋酸酯，纯度98. 8 % )、 维生素A棕榈酸酯（视黄醇棕榈酸酯，纯度92.5% )、维生素E(DL-a-生育酚，纯度 95. 8% )、维生素E醋酸酯（DL-α-生育酚醋酸酯，纯度97. 4% )和维生素& (叶绿醌，纯 度99. 3%)标准品均购自美国ChromaDex公司。
[0020] 取维生素A、维生素A醋酸酯、维生素A棕榈酸酯、维生素E、维生素E醋酸酯、维生 素I六种脂溶性维生素标准品各10mg，分别用无水乙醇溶解并定容至100mL棕色容量瓶中 制备得到各维生素标准储备液。各维生素标准储备液配制后需要通过紫外吸光值进行浓度 校正，具体操作如下：
[0021] 分别取各维生素标准储备液若干微升，分别注入至含有3.OOmL乙醇的比色皿 中，根据给定波长测定各维生素的吸光值，按表1给定的条件进行测定（参考文献：The Vitamins-FundamentalAspectsinNutritionandHealth,FourthEdition.Gerald F.Combs,Jr.，ElsevierInc. 2012.)，通过下列公式计算出该维生素的实际浓度。
[0022] 表1各维生素吸光值的测定条件表
[0023]
[0026] 式中：C为各维生素的浓度，单位为g/mL;A为各维生素的紫外吸光值；V为加入标 准储备液的量，单位为μL;E为各维生素的1%比吸光系数。
[0027] 标准工作液的配制：移取各标准储备溶液，用乙醇稀释成浓度为10. 0μg/mL的混 合标准中间溶液，_18°C下避光保存。根据需要用乙醇逐级稀释配成适当浓度的混合标准工 作液，现配现用。
[0028]色谱条件：色谱柱：PhenomenexKinetexC18色谱柱（100X4. 6mmi.d.，粒径 2· 6μm);柱温35。。；流速1.OmL/min;进样量5μL;流动相为水（A)和乙腈（B)，梯度洗脱 程序：0-4.Omin，90%Β;4· 1-18.Omin，100%Β;18· 1-22.Omin，90%B。
[0029] 质谱条件：离子源为大气压化学电离源（APCI);扫描方式为正离子扫描；检测方 式为多反应监测（MRM);喷雾气（GSl)65psi，气帘气（CUR)30psi，碰撞气（CAD)medium，离 子源温度：350°C，电流（NC)3. 0 入口电压（EP)和出口电压（CXP)均为10V，驻留时间 (dwelltime) 50ms;MRM监测离子对、化合物保留时间、去簇电压（DP)和碰撞能量（CE)等 参数见表2。
[0030] 表2的数据通过质谱优化得到：采用针栗连续进样，在ESI正离子模式下，分别对 0. 1μg/mL各种维生素的标准溶液进行一级质谱图扫描，确定较强的峰为其母离子，其中维 生素A的[Μ-Η20+Η]+峰较强，维生素A醋酸酯的[M-CH2C0-H20+H]+峰较强，维生素A棕榈酸 酯的[M-C15H3(]C0-H20+H]+峰较强，维生素