一种同时检测血清/血浆中多种维生素的方法和试剂盒与流程

本发明涉及维生素检测技术，尤其是一种可以同时检测血清/血浆中多种维生素的方法和试剂盒。
背景技术：
：维生素(vitamin)是人和动物为维持正常的生理功能而必需从食物中获得的一类有机物质，在人体生长、代谢过程中发挥着重要的作用。机体缺乏维生素将引起代谢障碍，并发生各种疾病,这类疾病统称为维生素缺乏症。目前，根据溶解性可将维生素分为脂溶性维生素和水溶性维生素两大类，水溶性维生素包括B族维生素、维生素C等；脂溶性维生素包括维生素A、D、E、K等。脂溶性维生素中，维生素A是视网膜中感光细胞的感光物质的主要成分，维生素A缺乏会导致干眼症，对于成人，维生素A缺乏时易导致夜盲症；维生素D(VitaminD，VitD)对人类健康特别是儿童健康具有重要意义,VitD缺乏性佝偻病是我国儿童重点防治的四病之一，临床发现VitD缺乏性佝偻病除骨骼病变外,同时可影响神经、肌肉、造血及免疫等组织器官的功能；维生素E有抗氧化的作用，能防止不饱和脂肪酸的自身氧化，因而有保护生物膜的功能，使生物膜中的不饱和脂肪酰不致于因氧化变硬，使膜遭到破坏；维生素K对正常的血液凝结有重要作用,缺乏维生素K会出现血凝缓慢，甚至可导致大出血。水溶性维生素主要包括B族维生素和维生素C等，比如B1(硫胺素)、B2(核黄素)、B5(泛酸)、B6(吡哆醛等)、B12(钴胺素)、烟酸(尼可酸)、生物素，叶酸等；B族维生素在生物体内通过构成辅酶而影响物质代谢，如在细胞呼吸中起重要作用。维生素最早期的检测用于一般的添加食品，如婴儿配方食品、谷类产品和果汁等。EuropeanDirective2002/46EC制定了一系列关于食品添加剂标识及检测添加过维生素的食品中标注的维生素含量的法规。我国国家标准GB5413～2010对婴幼儿配方食品与乳品中维生素含量也有明确的规定，标准中涉及的方法有微生物法及高效液相色谱法。关于维生素的检测，传统方法为微生物法，其灵敏度高、结果准确，但该方法有许多局限性：整个实验周期长，批次检测结果重复性差，检测结果误差较大，并且每次只能进行单一维生素种类的检测；而最近，液相串联质谱技术的发展使得维生素的检测进入了一个全新的领域，近几年来串联质谱技术在国内医疗市场的占有率愈来愈高，使得串联质谱在临床疾病的诊断中得到普及。技术实现要素：基于此，本发明的目的在于克服上述现有技术的不足之处而提供一种可以同时检测血清/血浆中多种维生素的方法和试剂盒，该方法具有更高的精密度和准确度，检测效率显著提升。为实现上述目的，本发明采取的技术方案为：一种同时检测血清/血浆中多种维生素的方法，包括如下步骤：(1)将待测血清或待测血浆与去蛋白液混匀后离心，取上清液；(2)将步骤(1)所得上清液和内标混合液混匀后采用串联质谱法进行检测，通过比较维生素和维生素的内标的离子强度来得出待测血清或待测血浆中维生素的含量。应当说明的是，本发明中的串联质谱法采用液相色谱串联质谱联用仪。优选地，所述步骤(1)中去蛋白液包括以下体积百分比的组分：84.75～98.95％的甲醇、1～15％的水和0.05～0.25％的甲酸；或者所述去蛋白液包括以下体积百分比的组分：84.75～98.95％的乙腈、1～15％的水和0.05～0.25％的甲酸；或者所述去蛋白液包括以下体积百分比的组分：19.95～79.75％的甲醇、20～80％的乙醇和0.05～0.25％的甲酸。优选地，所述步骤(1)中去蛋白液与所述待测血清或待测血浆的体积比为1:5～5:1。优选地，所述步骤(2)中色谱条件：流动相包括以下体积百分比的组分：79.64～97.989％的甲醇、2～20％的水、0.01～0.35％的甲酸，以及0.001～0.01％的全氟丁酸和三氟乙酸中的至少一种；或者流动相包括以下体积百分比的组分：79.64～97.989％的乙腈、2～20％的水、0.01～0.35％的甲酸，以及0.001～0.01％的全氟丁酸和三氟乙酸中的至少一种；或者流动相包括以下体积百分比的组分：49.71～84.989％的甲醇、15～50％的乙腈、0.01～0.28％的甲酸，以及0.001～0.01％的全氟丁酸和三氟乙酸中的至少一种；探针洗液是体积浓度为50～80％的乙腈水溶液，或者探针洗液是体积浓度为50～80％的甲醇水溶液。应当说明的是，探针洗液的作用在于平衡测定前后流动相、辅助测定、清洗探针、以及避免前样本对后样本测定的影响。优选地，所述步骤(2)中内标混合液包括维生素B1内标、叶酸内标、维生素A内标、25羟基维生素D2内标、25羟基维生素D3内标、维生素E内标和维生素K1内标。同时，本发明还提供了一种同时检测血清/血浆中多种维生素的试剂盒，包括：内标混合液、去蛋白液、流动相和探针洗液。优选地，所述去蛋白液包括以下体积百分比的组分：84.75～98.95％的甲醇、1～15％的水和0.05～0.25％的甲酸；或者所述去蛋白液包括以下体积百分比的组分：84.75～98.95％的乙腈、1～15％的水和0.05～0.25％的甲酸；或者所述去蛋白液包括以下体积百分比的组分：19.95～79.75％的甲醇、20～80％的乙醇和0.05～0.25％的甲酸。优选地，所述流动相包括以下体积百分比的组分：79.64～97.989％的甲醇、2～20％的水、0.01～0.35％的甲酸，以及0.001～0.01％的全氟丁酸和三氟乙酸中的至少一种；或者所述流动相包括以下体积百分比的组分：79.64～97.989％的乙腈、2～20％的水、0.01～0.35％的甲酸，以及0.001～0.01％的全氟丁酸和三氟乙酸中的至少一种；或者所述流动相包括以下体积百分比的组分：49.71～84.989％的甲醇、15～50％的乙腈、0.01～0.28％的甲酸，以及0.001～0.01％的全氟丁酸和三氟乙酸中的至少一种。优选地，所述探针洗液是体积浓度为50～80％的乙腈水溶液，或者所述探针洗液是体积浓度为50～80％的甲醇水溶液。优选地，所述内标混合液包括维生素B1内标、叶酸内标、维生素A内标、25羟基维生素D2内标、25羟基维生素D3内标、维生素E内标和维生素K1内标。综上所述，本发明的有益效果为：(1)本发明的方法通过电压将维生素分子裂解成不同质荷比的子离子，扫描不同质荷比的子离子数量，参考已知维生素内标的浓度，计算出待测维生素浓度，能同时检测血清或血浆中水溶性维生素和脂溶性维生素的含量，为国内首例，采用本发明的方法和试剂盒检测维生素，精密度和准确度更高；(2)本发明的方法可从血清/血浆将多种水溶性和脂溶性维生素提取出来，利用串联质谱仪在2～3min内对1个标本中十余种维生素同时进行定量，通过分析可以对人体内维生素水平进行评价和监测，从而对维生素相关疾病进行诊断和治疗效果评估，检测周期显著缩短。附图说明图1为实施例1所得总离子图；图2为实施例1所得扫描后各成分的质谱图。具体实施方式为更好的说明本发明的目的、技术方案和优点，下面将结合具体实施例对本发明作进一步说明。实施例1同时检测血清/血浆中多种维生素的方法一、主要实验步骤：(1)准备内标工作液：采用美国剑桥同位素实验室提供的各种维生素的同位素内标及浓度；依据当次实验标本量计算内标标准工作溶液的量。将上述各种内标混合得到高浓度内标混合液，使用时，按1:100比例采用流动相将高浓度内标混合液稀释，注意充分混匀即可得到内标工作液。(2)分析过程：1、将充分凝固的全血或者抗凝全血离心，3000转/分钟离心5分钟，提取上层血清或血浆；2、取100～500微升血清/血浆加入离心管，再加入去蛋白液100～500微升，漩涡震荡充分混匀，静止10分钟后离心，10000转/分钟离心3～5分钟，提取上清液；3、取上述上清液100微升并加内标工作液50微升，充分混匀后加入96孔微孔板，覆上铝箔封膜减少挥发；4、将96孔微孔板放入串联质谱系统自动进样器中，启用应用软件，建立样品列表，选择正确的内标浓度文件和采集方法，以检测血清/血浆中多种维生素的含量。(3)结果计算：串联质谱系统中软件可以将检测结果通过比较分析物和内标的离子强度来进行计算，给出各维生素的浓度并生成数据报告。(4)注意事项：1、同位素标准品用完之后应立即放入2～8℃冰箱保存；2、使用铝箔包裹微孔板时，必须包紧；3、如果试剂已经从试剂瓶倒出，不能再次使用。二、主要试剂：本实施例用到的试剂包括去蛋白液，流动相和探针洗液，本实施例中的具体试剂配方为：(1)内标：选用美国剑桥同位素实验室提供的各维生素的同位素内标及浓度，如下表所示：名称商品英文名称浓度维生素B1内标Thiamine～d3Hydrochloride30nmol/L叶酸内标FolicAcid～d24nmol/L维生素A内标VitaminA～d5Acetate1.5μmol/L25羟基维生素D2内标25～HydroxyvitaminD2～[d6]10nmol/L25羟基维生素D3内标25～HydroxyvitaminD3～～[d6]30nmol/L维生素E内标α～Tocopherol～d66μg/mL维生素K1内标VitaminK1～[d7])1.5ng/mL(2)去蛋白液：本法的方法需要将血清/血浆标本去蛋白，去蛋白液的选择有以下三种配方，分别对应于流动相的三种不同配方，这三种不同配方对最后的检测结果的准确性和精密度没有影响。配方a：按照体积百分比包括84.75～98.95％的甲醇、1～15％的水和0.05～0.25％的甲酸；配方b：按照体积百分比包括84.75～98.95％的乙腈、1～15％的水和0.05～0.25％的甲酸；配方c：按照体积百分比包括19.95～79.75％的甲醇、20～80％的乙醇和0.05～0.25％的甲酸。(3)流动相：流动相的选择有三种配方，分别对应于去蛋白液的三种不同配方，这三种不同配方对最后的检测结果的准确性和精密度没有影响。配方一：按照体积百分比包括79.64～97.989％的甲醇、2～20％的水、0.01～0.35％的甲酸，以及0.001～0.01％的全氟丁酸和三氟乙酸中的至少一种，混合均匀后在常温下密闭超声脱气15～20分钟；配方二：按照体积百分比包括79.64～97.989％的乙腈、2～20％的水、0.01～0.35％的甲酸，以及0.001～0.01％的全氟丁酸和三氟乙酸中的至少一种，混合均匀后在常温下密闭超声脱气15～20分钟；配方三：按照体积百分比包括49.71～84.989％的甲醇、15～50％的乙腈、0.01～0.28％的甲酸，以及0.001～0.01％的全氟丁酸和三氟乙酸中的至少一种，混合均匀后在常温下密闭超声脱气15～20分钟。(4)探针洗液：1、50～80％的乙腈水溶液；2、50～80％的甲醇水溶液。(5)注意事项：1、公示的去蛋白液和流动相中乙腈，水，甲酸，及甲醇的比例可在相应范围内调节，同时须在质谱仪上进行相应参数的调整，这样，所检测的维生素含量结果的准确度和精密度不受影响；2、所有试剂均选用色谱级别；3、配置所用水选用三蒸水或纯水机过滤的超纯水，其电阻≥18MΩ或电导<5us/cm，PH值为7.0±0.2。三、质谱参数：根据去蛋白液和流动相配方,在串联质谱仪器watersTQD上的设置参考用质谱条件如下表:根据去蛋白液和流动相配方在串联质谱仪器AB3200上的设置的参考质谱条件如下表：需要注意的是，上述参数中母离子固定，针对不同的机器或同一品牌机器质谱参数变化时，子离子有可能会发生变化。其中，液相泵梯度及质谱仪条件如下表所示：需要注意的是，由于每台机器在装机调试时,机器的精密度等不同，以上参数仅供参考，具体调试参数由工程师做少许改动。如图1所示的通过本实施例的方法所得的总离子图，横坐标代表时间，纵坐标代表总离子数量，该图表示所有待测离子总的扫描离子数量，通过该图可以判断总离子数量是否达到检测要求，如果没有达到检测要求，对结果准确性会带来影响。如图2所示的通过本实施例的方法所得的扫描后各成分的质谱图，横坐标代表母离子的质荷比(实时的监测数，没有按大小排列)，纵坐标代表离子强度，该图表示不同检测物质的离子数量，通过该图可以计算待测维生素浓度。实施例2同时检测血清/血浆中多种维生素的试剂盒根据血样本的不同分别设定试剂配比和串联质谱条件，本实施的试剂盒可以一次性测出11水溶性和7中脂溶性维生素，可以测出的维生素如下表所示：水溶性维生素脂溶性维生素烟酸胺维生素A烟酸维生素D2维生素B1维生素D3维生素B225-羟基维生素D2盐酸吡哆醇25-羟维基生素D3盐酸吡哆胺维生素E盐酸吡哆醛维生素K1叶酸泛酸生物素维生素B12本实施例的试剂盒包括：内标混合液、去蛋白液、流动相和探针洗液，内标混合液中包括内标品，内标品采用美国剑桥同位素实验室提供的各种维生素的同位素内标及其浓度，去蛋白液和流动相互一一对应。(1)内标混合液的使用：采用美国剑桥同位素实验室提供的各种维生素的同位素内标及浓度，将各种内标混合得到高浓度内标混合液，在使用时，用流动相按照所需的比例将高浓度内标混合液稀释，并且充分混匀得到内标工作液。(2)流动相采用以下配方中的一个：配方一：按照体积百分比包括79.64～97.989％的甲醇、2～20％的水、0.01～0.35％的甲酸，以及0.001～0.01％的全氟丁酸和三氟乙酸中的至少一种，混合均匀后在常温下密闭超声脱气15～20分钟；配方二：按照体积百分比包括79.64～97.989％的乙腈、2～20％的水、0.01～0.35％的甲酸，以及0.001～0.01％的全氟丁酸和三氟乙酸中的至少一种，混合均匀后在常温下密闭超声脱气15～20分钟；配方三：按照体积百分比包括49.71～84.989％的甲醇、15～50％的乙腈、0.01～0.28％的甲酸，以及0.001～0.01％的全氟丁酸和三氟乙酸中的至少一种，混合均匀后在常温下密闭超声脱气15～20分钟。(3)去蛋白液采用以下配方中的一个：配方a：按照体积百分比包括84.75～98.95％的甲醇、1～15％的水和0.05～0.25％的甲酸；配方b：按照体积百分比包括84.75～98.95％的乙腈、1～15％的水和0.05～0.25％的甲酸；配方c：按照体积百分比包括19.95～79.75％的甲醇、20～80％的乙醇和0.05～0.25％的甲酸，并且，去蛋白液采用配方a时，须采用对应的流动相配方一；去蛋白液采用配方b时，须采用对应的流动相配方二；去蛋白液采用配方c时，须采用对应的流动相配方三。(4)探针洗液：采用以下其中一种：1.50～80％的乙腈水溶液；2.50～80％的甲醇水溶液。实施例1的方法配合国内常用的串联质谱仪(美国AB公司和美国WATERS公司的MS/MS测定仪)以及实施例2的试剂盒，能通过一次实验同时检测血清/血浆中多种水溶性维生素和脂溶性维生素，检测结果具有很高的精确度和准确度。最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。当前第1页1 2 3