稳定血液、血清或血浆样品的方法以及包含pH缓冲剂的容器的制作方法

专利名称：稳定血液、血清或血浆样品的方法以及包含pH缓冲剂的容器的制作方法
技术领域：
本发明涉及稳定血液、血清或血浆样品的方法，换句话说，本发明涉及防止血液、血清或血浆中的成分变质的方法以及用于该方法的容器。本发明可用于临床诊断测试、临床研究和基础研究领域。
背景技术：
在各种临床诊断测试、临床研究和基础研究中广泛进行血液成分的分析。通常从个体的血液制备血清或血浆，并分析其中包含的各种成分。在这些分析中，重要的是那些各种成分在分析前保持稳定并且分析结果正确反映了个体的体内情况。
欧洲专利公开号0359201公开了稳定血液凝结(或凝固)因子的方法。在该方法中，将甘氨酰甘氨酸或甘氨酰甘氨酰甘氨酸或二者同时加入到血液或血浆中。日本专利早期公开8-224227公开了封闭在管中的包含氨基羧酸和Good’s缓冲剂的血液收集管。氨基羧酸和Good’s缓冲剂有利于稳定血液凝固因子。因此，已提出了用于临床诊断测试的稳定血液凝固因子的方法。然而，还没有一种已知的能稳定所有或大部分血液成分的方法。而且，也没有一种已知的能稳定所有或大部分血清或血浆成分的方法。
在上述情况下，通常采取对新鲜血液、血清或血浆样品进行分析。如果需要短时间储存血液、血清或血浆，则在4℃下冷藏。如果需要长时间储存血液，则在采血后立即将血液冷冻，然后运输，并在用于分析前才解冻。如果需要更长时间地储存血清或血浆，则在从血液中制备出血清或血浆后立即冷冻，然后运输，并在用于分析前才解冻。
尽管在4℃下冷藏很方便，但通常认为血清或血浆即使储存在4℃下长时间后也会降解。另外，在临床参照实验室目录中，对于大部分测试项目，也要求或推荐将样品冷冻。仅对于少数几个测试项目而言，在低温(4℃)或室温(环境温度)下储存样品是可接受的。
在采血后立即冷冻血液、或在制备血清或血浆后立即将其冷冻并在使用前一直保持其处于冷冻状态，这要求对其冷冻和储存期间的温度控制要非常谨填。而且要精确控制血清或血浆在其解冻后的温度(例如将其置于冰上)，或在解冻后立即分析。因此，该方法不方便。
近年来，对某些测试项目而言，也计划设立将样品邮寄到临床参照实验室进行分析的体系。在这种体系中，非常难于将样品保持在低温或冷冻状态。因此，该体系中的样品在运输过程中就会变质。这是因为样品有可能长时间置于室温下和/或靠近样品的冷隔离物会变暖，由此样品的温度可升高。这是很麻烦的。
本发明的目的是提供通过稳定血液中的成分能够准确分析这些成分的方便方法，以及用于该方法的容器。
发明概述本发明人发现，用于临床诊断测试或研究材料的血液、血清或血浆样品，在采血或制备血清或血浆后因反映出生物体内的况状而具有中性pH(即pH值)，然而发现当它们长时间贮存、置于室温下或加热后，其pH值却出人意料地升高到碱性pH。更具体的说，样品的pH值开始在pH7.4附近，然后迅速升高到约pH9的碱性pH。而且，当样品的体积小时，其pH显著升高。
本发明人通过将新鲜血清样品(100μl)在4℃、室温、30℃或37℃下培养来检查其pH的变化，并发现其pH(即pH值)在数小时内转变到碱性pH。这种pH的转变在样品被加热后很明显。实际上，通过将其在37℃下培养，1小时内其pH几乎达到pH9。即使将其置于室温下时，其pH在1小时内也达到约pH8.5，在3或4小时内达到pH9。当将该样品的100μl样本放置在4℃下，或将1ml样本放置在室温下时，样本的pH较平缓地升高。然而，样本的pH在4小时内达到约pH8.5。
血液、血清或血浆样品的pH基本上都随着时间的变化而升高。因此，可以预料在碱性条件下不稳定的血液成分将随着时间的变化而降解。样品的pH尤其是在加热时容易从中性转化成碱性。而且，当样品具有碱性pH并被加热时，与保持样品冷却的情况相比降解有所增强。近年来，用于临床参考实验室等分析的样品的体积变得越来越小。然而，本发明人发现当样品体积小时，在储存期间或解冻后其pH容易升高。即使用于分析血液成分的试剂在适当范围内可缓冲pH，但解冻后的pH仍然升高。因此，测试结果必定受到分析前pH升高导致的血液成降解的影响。
本发明人认为，血液、血清或血浆样品的稳定性可通过防止样品的pH升高来增强，并进行了实验。结果发现，稳定性确实通过将pH缓冲剂与血液、血清或血浆样品混和而得到增强。本发明就是基于这一发现而完成的。
也就是说，本发明提供了稳定血液、血清或血浆样品的第一种方法，该方法包括1-a)向血液样品中加入pH缓冲剂，1-b)制备血清或血浆样品，并向样品中加入pH缓冲剂，或1-c)将血液、血清或血浆样品放入含有pH缓冲剂的容器中，和2)将步骤1-a、1-b或1-c中获得的样品储存，其中pH缓冲剂具有从弱酸性pH到弱碱性pH范围的初始pH，并具有将步骤1-a、1-b或1-c中获得的样品的pH在步骤2中保持在中性附近的缓冲能力。
根据上述方法的本发明可以单独地或以其中两个或多个组合的方式包括如下实施方案i)其中pH缓冲剂在步骤2中将样品的pH保持在pH7.0至pH8.0范围内的上述方法；ii)其中pH缓冲剂具有pH5.5至pH8.0的初始pH的上述方法；iii)其中pH缓冲剂具有选自固体、粉末、颗粒、涂层、液滴和微液滴的形式的上述方法；iv)其中通过将容器中所含的pH缓冲剂水溶液进行真空干燥(包括减压干燥和冷冻干燥)、传热干燥(包括对流传热干燥、辐射传热干燥和传导传热干燥)、内部发热干燥、用干燥剂干燥、超声干燥或风干来制备pH缓冲剂的上述方法；和v)其中容器为真空或非真空血液收集管、用于分离血清或血浆的离心管、尿收集杯、样品储存容器、96孔微滴定板或其组件、384孔板或用于将样品邮寄到临床参考实验室的样品容器的上述方法。
此外，本发明提供了与血液、血清或血浆样品接触的容器，该容器含有初始pH在弱酸性pH至弱碱性pH范围的pH缓冲剂，并且具有将样品的pH保持在中性附近的缓冲能力。
根据上述容器的本发明可以单独地或以其中两个或多个组合的方式包括以下实施方案i)其中pH缓冲剂保持样品的pH在pH7.0至pH8.0范围内的上述容器；ii)其中pH缓冲剂具有pH5.5至pH8.0的初始pH的上述容器；iii)其中pH缓冲剂具有选自固体、粉末、颗粒、涂层、液滴和微液滴的形式的上述容器；iv)其中通过将容器中所含的pH缓冲剂水溶液进行真空干燥(包括减压干燥和冷冻干燥)、传热干燥(包括对流传热干燥、辐射传热干燥和传导传热干燥)、内部发热干燥、用干燥剂干燥、超声干燥或风干来制备pH缓冲剂的上述容器；和v)其中容器为真空或非真空血液收集管、用于分离血清或血浆的离心管、尿收集杯、样品储存容器、96孔微滴定板或其组件、384孔板或用于将样品邮寄到临床参考实验室的样品容器。
此外，本发明提供了稳定血清或血浆样品的第二种方法，该方法包括1-a)向血液样品中加入pH缓冲剂，或1-b)将血液样品置于包含pH缓冲剂的容器中，2)将pH缓冲剂溶解在血液样品中，3)从步骤2获得的样品制备血清或血浆样品，和4)储存步骤3中获得的血清或血浆样品，其中pH缓冲剂具有从弱酸性pH到弱碱性pH的初始pH，并具有将步骤3中获得的血清或血浆样品的pH在步骤4中保持在中性附近的缓冲能力。
发明详述以下将具体解释本发明。
本发明的方法和容器的特征在于，将血液、血清或血浆样品与初始pH在弱酸性pH到弱碱性pH范围内、并具有将样品的pH保持在中性附近的缓冲剂能力的pH缓冲剂接触。
在本发明的方法中，血液、血清或血浆样品的pH通过与pH缓冲剂共存而控制在中性附近。从而可大大减少随时间推移在碱性条件下不一定总是稳定的成分的变质。该方法可通过使用本发明的容器而进行。即血液、血清或血浆样品的pH易于通过事先将pH缓冲剂或来自该试剂的缓冲溶液放入诸如血液收集管的样品容器中来控制。
“pH缓冲剂”和“缓冲剂”的含义相同，指能表现出pH缓冲作用的有效成分。“缓冲溶液”指溶解了pH缓冲剂的水溶液。缓冲溶液除缓冲剂外还可含有其它成分，如糖类、聚合物质、化学物质和生物物质。缓冲溶液的pH可用酸(如HCl)或碱(如NaOH或KOH)调节，或者是通过用一定比例混和表现出不同pH的化合物如多元酸的一钠盐和二钠盐来调节。“初始pH”指缓冲剂水溶液的pH。即缓冲剂水溶液制备后立即指示的pH，或用酸或碱调节的溶液的pH。“碱的”和“碱性的”具有相同含义，均指大于7.0的pH。术语“中性附近”此处是指约pH6.5至pH8。
可用于本发明的pH缓冲剂的实例包括但不限于磷酸盐缓冲剂、ACES[N-(2-乙酰氨基)-2-氨基乙磺酸]、ADA[N-(2-乙酰氨基)-2-亚氨基乙二酸]、BES[N，N-双(2-羟乙基)-2-氨基乙磺酸]、BICINE[N，N-双(2-羟乙基)氨基乙酸]、BIS-TRIS[双(2-羟乙基)-亚氨基-三(羟甲基)甲烷]、BIS-TRIS-PROPANE[1，3-双[三(羟甲基)甲基氨基]丙烷]、DIPSO[3-[N，N-双(2-羟乙基)氨基]-2-羟基丙磺酸]、EPPS[N-(2-羟乙基)哌嗪-N’-(3-丙磺酸)；HEPPS]、HEPES[N-(2-羟乙基)哌嗪-N’-(2-乙磺酸)]、HEPPESO[N-(2-羟乙基)哌嗪-N’-(2-羟基丙磺酸)]、IMIDAZOLE[1，3-二氮杂-2，4-环戊二烯]、MES[2-(N-吗啉代)乙磺酸]、MOBS[4-(N-吗啉代)丁磺酸]、MOPS[3-(N-吗啉代)丙磺酸]、MOPSO[3-(N-吗啉代)2-羟基丙磺酸]、PIPES[哌嗪-N，N’-二(2-乙磺酸)]、POPSO[哌嗪-N，N’-二(2-羟基丙磺酸)]、TAPS[N-三(羟甲基)甲基-3-氨基丙磺酸]、TAPSO[3-[N-三(羟甲基)甲基氨基]-2-羟基丙磺酸]、TEA[三乙醇胺]、TES[N-三(羟甲基)甲基-2-氨基乙磺酸]、TRICINE[N-三(羟甲基)甲基氨基乙酸]、TRIS[三(羟甲基)氨基乙烷]、甘氨酰甘氨酸、乙酸盐缓冲剂和柠檬酸盐缓冲剂。
除以上所列外，在pH6.0至pH8.0间有强缓冲能力的缓冲剂也可以适当采用。术语“缓冲能力”指当缓冲剂溶解在预定量的水溶液中时所能表现出的缓冲作用的pH范围。在某些特殊情况下，例如在其目的是仅仅使样品中的特定成分不降解的情况下以及在缓冲溶液的量可增加或减少的情况下，可采用在大于等于pH8.0或小于等于pH5.9时具有强缓冲能力的缓冲剂。因此，缓冲剂不限于上述那些，可由本领域普通技术人员适当选择。
在本发明的方法或容器中，这些缓冲剂或缓冲溶液可彼此独立地使用或两种或多种组合使用。
可通过pH缓冲剂将血液、血清或血浆样品的pH范围控制在中性附近，即从约PH6.5至pH8，优选pH6.8至pH8.0，更优选pH7.0至pH8.0，特别优选pH7.1至pH7.8。
为了将pH控制在上述范围(即pH6.5到pH8)内，采用初始pH在弱酸性pH到弱碱性pH范围内的缓冲剂。缓冲剂的初始pH优选为5.5至8.0，更优选6.0至7.7，特别优选6.5至7.5。原因如下。
样品的pH随时间推移而升高至约pH9。为了防止样品的pH升高到pH8.0，如果缓冲剂的初始pH接近且低于pH8.0时，该缓冲剂就必须以高浓度使用。另一方面，如果初始pH低于pH5.5，样品的最终pH就很容易地控制在中性附近。然而，当新鲜样品的体积小于容器所希望的体积时，具有中性pH的样品可在与缓冲剂接触后立即暴露于过量的酸性pH下。因此，缓冲剂的适当初始pH为5.5至8.0，优选6.0至7.7。为了避免将新鲜样品与缓冲剂(或缓冲溶液)混和而出现的瞬时pH降低以及避免储存期间pH的大幅升高，可适当采用初始pH在pH6.5至7.5范围内的缓冲剂。然而，应该注意也可以采用初始pH为6.0至6.5的缓冲剂。这是因为如果使用少量缓冲剂，样品的pH可控制在目标范围内。
当选定了缓冲剂后，应考虑其他物质阻凝剂如柠檬酸钠和促凝血剂的影响。
此外，能否将样品的pH控制在目标范围内，还取决于1)所用的具体缓冲剂具有强缓冲能力或缓冲潜力的pH范围和2)在包含血液、血清或血浆样品的水溶液中缓冲剂的浓度。它不能仅由具体缓冲剂的初始pH决定。重要的是将样品的pH控制在中性附近。为了达到该目的，本领域普通技术人员可适当选择缓冲剂的类型和用量以及初始pH等。然而，缓冲剂的用量通常是能使其在该水溶液中的浓度为优选的0.01～0.3M、更优选的0.03～0.1M的量。
优选采用基本不含水性成分的缓冲剂。即优选基本上没有水性成分。因为如果存在大量水性成分(也就是使用低浓度缓冲溶液)，则会稀释血液、血清或血浆样品，结果样品中所含成分的浓度降低。因此，预先将缓冲剂放入容器中的方法的优选实例包括除去该容器中所含缓冲溶液的水分以形成固体、粉末、颗粒或涂层。干燥缓冲溶液的方法的实例包括真空干燥(包括减压干燥和冷冻干燥)、传热干燥(包括对流传热干燥、辐射传热干燥和传导传热干燥)、内部发热干燥、用干燥剂干燥、超声干燥、风干及其两种或多种的组合。另外，可以将分析中能够忽略的体积非常小的缓冲溶液置于容器中，或者可将缓冲溶液的液滴或微液滴附着于容器内壁。优选在容器中预先制备固体、粉末或颗粒(尤其是粉末或颗粒)形式的缓冲剂，或者是液滴或微液滴形式的缓冲溶液。
在本发明中，术语“容器”可理解为能包含或盛有用于取样、储存、运输、诊断测试、研究等的血液、血清或血浆样品的器件，而不考虑时间的长短。因此，除了各种形式的玻璃或塑料管、杯、微滴定板等以外，“容器”的实例包括板状、块状或条状纸张或海绵、塑料片等。更具体地讲，“容器”的实例包括真空或非真空血液收集管、用于血清或血浆分离的离心管、尿收集管、样品储存容器、96孔微滴定板或其组件、384孔板或用于将样品邮寄到临床参考实验室的样品容器等。微滴定板组件是指在微滴定板中构造的能移动的一排或多排单元(如在96孔微滴定板情况下，包括一排或多排的单元，其中一排包括8或12个孔)。当将样品邮寄到临床参考实验室时，采用样品容器。该样品容器用于取样、运输和储存样品。尽管样品容器的形式可根据待分析的成分、临床参考实验室等的不同而变化，但经常采用滤纸。
为了防止已置于容器中的缓冲剂溢出或剥落，从操作角度看最好是采用诸如真空血液收集管的封闭型容器。
在本发明的第一种方法中，在步骤1中，a)将pH缓冲剂加入到血液样品中，b)由血液制备血清或血浆样品，并将pH缓冲剂加入到血清或血浆样品中，或c)将血液、血清或血浆样品放入包含pH缓冲剂的容器中。在本发明的第二种方法中，在步骤1中，a)将pH缓冲剂加入到血液样品中，或b)将血液样品放入到包含pH缓冲剂的容器中。即可在血液、血清或血浆样品倒入容器中之前，将缓冲剂或缓冲溶液置于容器中。另外，可在该样品倒入容器后将缓冲剂或缓冲溶液置于容器中。为了将样品的稀释降至最小程度，优选采用配制的粉末或颗粒形式的缓冲剂，所述缓冲剂溶解在预定量的含水溶液中时表现出一定范围的pH。
更具体地讲，在采血时，缓冲剂可存在于诸如血液收集管的容器中。另外，可在采集血液样品后或制备血清或血浆样品后将缓冲剂与血液、血清或血浆样品混和。在后一种情况下，先采集或收集血液，然后转移到含有缓冲剂的容器中。或者先采集或收集血液、由血液制备血清或血浆，然后将血清或血浆倒入含有缓冲剂的容器中。或者可将缓冲剂直接加入到采集的血液或制备的血清或血浆中。然而理想地是，从采血后条件的可重复性来看，优选将血液直接收集到含有缓冲剂的真空管中。这是因为如果先将血液收集到不含缓冲剂的管中、需要时由该血液制备血清或血浆、然后将缓冲剂加入到血液、血清或血浆样品中或将该样品转移到含有缓冲剂的容器中，血液收集与将样品和缓冲剂进行混和之间的时间是不同的。
当将体积约1ml的样品置于25℃空气中时，血液收集与将样品和缓冲剂进行混和之间的时间优选为1小时或更短。当将体积约0.1ml的样品置于25℃空气中时，该时间优选为15分钟或更短，而当将体积约0.1ml的样品置于4℃空气中时，该时间优选为30分钟或更短。
血清中含有的某些血液成分可由以下方法制备的血清样品来分析将血液收集或采集到真空血液收集管中，然后离心分离为血清和血块。将血清立即冷冻。储存冷冻样品然后解冻。解冻后测定出成分的量。该成分的量的标准值是基于用上述已解冻的血清样品获得的值而确定的。为了与标准值比较，可在冷冻血清样品解冻后立即将pH缓冲剂加入到血清样品中。对于血液或血浆样品也可如此处理。
在本发明第一种方法中，将还含有缓冲剂的样品储存，直到进行分析。储存条件不受限制。然而，通常在冰箱中或室温下短时间储存，在冰柜中可储存更长的时间。
本发明第一种方法的步骤2中和本发明第二种方法的步骤4中的术语“储存”是指将pH缓冲剂与血液、血清或血浆样品的混合物放置一段时间。时间可以非常短或较长。例如，当将混合物立即进行配制(例如与试剂混和)以用于分析时，时间则非常非常地短。同样地在这种情况下，本发明用于避免测试期间成分的变质。
在本发明第二种方法中，将pH缓冲剂溶解在血液样品中，然后由该血液样品制备血清或血浆样品。PH缓冲剂的溶解以及血清或血浆样品的制备可用公知方法进行。将所获得的血清或血浆样品储存，直到进行分析。储存条件不受限制。然而，通常在冰箱中或室温下短时间储存，在冰柜中可储存更长时间。
根据本发明的方法，可通过防止血液、血清或血浆样品的pH升高来提高样品随时间推移的稳定性。
收集血液后，血液、血清或血浆样品的pH随时间推移而升高，并从中性变为碱性。当样品体积很小时，这种pH转变很明显。在样品的成分中，在碱性条件下稳定性差的成分根据该成分的特性和pH升高的程度而发生可逆或不可逆降解。这种降解在低温下进行得慢，然而在升高的温度下pH增加和成分的降解都加速。在本发明的方法和容器中，pH增加通过采用pH缓冲剂而避免。结果，血液、血清或血浆样品中在碱性条件下不稳定的成分的降解被避免。因此，根据本发明，可得到恒定的试验结果。更具体地讲，由已储存一段时间的样品得到的试验结果与由新鲜样品得到的结果几乎相同。同样，在诊断测试或试验期间将样品放置在室温情况下的试验结果与该样品样品冷冻情况下的试验结果几乎相同。因此，通过本发明，血液、血清或血浆样品随时间的稳定性可得到增强，结果使临床诊断测试以及临床和基本研究实验的再现性和可靠性得到提高。
通过采用本发明的第一种方法、第二种方法或本发明的容器，样品的pH保持在中性附近，因此不仅当将样品置于室温下还是加热到37℃时，可保护要分析的某些成分类型不降解。即本发明能解决样品暴露在各种温度条件下而导致的样品不稳定问题。因此，本发明有助于实现一种新的测试系统，其中将样品邮寄到临床参考实验室，并在实验室中进行分析。
本发明还具有其他优点。即当采用血液、血清和血浆作为样品时，本发明在开发诊断试剂中很有用。在开发新型诊断试剂中，单一样品可重复用于确定试验条件，以及用于测定灵敏度、特异性、重复性、与通过不同方法获得的结果的相关性、共存物质等的影响以及储存或保存稳定性。在这种情况下，如果样品明显降解，测试结果会不同。本发明避免了至少由pH升高导致的样品降解。因此，它在重复试验样品的研究中是有益的。
本发明的上述优点在近年来研究很活跃的开发采用蛋白质芯片(即微阵列)的试验方法中很重要。这是因为与选择用于欲分析的单一成分的最佳条件进行单一成分的分析不同，为了尝试用微阵列等一次确定许多成分的多项试验方法，应找到适于所有试验的一组条件。因此，将样品进行大量次数的试验。在这种情况下，由于避免了样品的降解，所以本发明能明显加速诊断剂的开发并显著提高测量的可靠性。
实施例下面参考实施例具体描述本发明。然而，不能理解成本发明限于这些实施例。
实施例1置于固化有pH缓冲剂的96孔微滴定板中的血清样品的pH变化在用作样品容器的96孔微滴定板的每个孔中加入50μl 0.1M磷酸盐缓冲溶液(pH6.0)(以下称为“PB 6.0”)、0.1M的磷酸盐缓冲溶液(pH6.5)(以下称为“PB 6.5”)、0.1M的HEPES缓冲溶液(pH6.0)(以下称为“HEPES 6.0”)，或0.1M的HEPES缓冲溶液(pH6.5)(以下称为“HEPES 6.5”)。在干燥器中干燥孔板，除去缓冲溶液中的液体成分，将缓冲剂固化在孔表面。将这样获得的每块板称为“pH缓冲剂固化板”。作为对比，还使用未固化缓冲剂的96孔微滴定板(以下分别称为“未处理板”)和1.5ml样品管。
用如下方法制备血清样品将血液收集到含有促凝血剂和血液分离剂的真空血液收集管中。30分钟后，离心血液并收集血清。将血清分成多份并冷冻。将冷冻血清解冻后得到血清样品。
向上述制备的样品容器中以100μl/微滴定板的每个孔或以1.0ml/1.5ml样品管的量加入血清样品。将该样品容器置于25℃下。将血清加入PB固化板和HEPES固化板的孔中后，缓冲剂的浓度为50mM。将其孔中已倒入新鲜血清样品的另一个未处理板置于4℃下。在倒入血清样品后的1、2、4和20小时，测量血清样品和血清样品/缓冲剂混合物的pH。结果示于表1中。
表1血清pH的测量

*实验前血清的pH在未处理板和用作对照用的样品管中观察到血清样品的pH变化较大。特别是，在25℃储存条件下的未处理板中，血清样品的pH在1小时内从7.8升高到8.6，在20小时内达到pH9.2。储存于4℃下的未处理板中和1.5ml样品管中的血清样品的pH变化不如储存于25℃下的未处理板中的剧烈。然而，在两种情况下的pH在20小时后均达到约pH9。另一方面，在倒入pH缓冲剂固化板中的血清样品(即血清样品/缓冲剂混合物)中，倒入血清样品后的时刻与20小时后之间的pH变化较小。具体说，在PB 6.0固化板中的pH从7.0轻微变化到7.1，在PB 6.5固化板中的pH从7.5轻微变化到7.6。同样，HEPES 6.0固化板中的pH从7.1变化到7.6，HEPES 6.5固化板中的pH从7.1变化到7.7。倒入pH缓冲剂固化板中的样品的pH即使在20小时后也保持低于pH8。
实施例2pH缓冲剂固化板内的血清样品中的血清胃蛋白酶原I/II的试验按照与实施例1描述的相同的方式制备PB 6.0固化板和HEPES 6.5固化板，所不同的是将板在37℃培养箱中放置1天以将缓冲剂固化在板上。按照与实施例1描述的相同的方式制备血清样品。
以100μl/孔的量将血清样品倒入PB 6.0固化板、HEPES 6.5固化板和作为对照用的未处理板的孔中。将板在4℃(对照)、25℃、37℃、43℃和50℃下放置4小时。然后用夹心ELISA法试验血清样品中胃蛋白酶原I和胃蛋白酶原II的量。
更具体地讲，将预定量的以上制备的其中一个血清样品进行取样。用ELUMINA PEPSINOGEN I/ELUMINA PEPSINOGEN II(KyokutoPharmaceutical Industrial Co.)的样机，根据制造商推荐的反应条件，分别测量血清样品中的胃蛋白酶原I和胃蛋白酶原II的量。通过固化在96孔微滴定板的孔上的抗人胃蛋白酶原I单克隆抗体捕捉胃蛋白酶原I，并用碱性磷酸酶标记的抗人胃蛋白酶原I抗体和碱性磷酸酶标记的抗人胃蛋白酶原II抗体的混合物检测。通过固化在96孔微滴定板的另一个孔上的抗人胃蛋白酶原II单克隆抗体捕捉胃蛋白酶原II，并用上述混合物检测。结果示于表2和3中。
表2血清胃蛋白酶原I的试验

表3血清胃蛋白酶原II的试验

在胃蛋白酶原I的试验中，当采用未处理板时，测量值在25℃时表现出减小的趋势，而在37℃时的测量值明显减小。在该温度下，残余含量(即每个测量值与储存于4℃下的血清样品的测量值的百分比值)仅为9.0％。另一方面，当采用PB 6.0固化板时，直到43℃都未看到测量值的波动。即残余含量分别在37℃为97.8％，在43℃为92.4％。同样，当采用HEPES 6.5固化板时，残余含量在37℃为91.5％。
在胃蛋白酶原II的试验中，温度的影响小于在胃蛋白酶原I的试验中的影响。然而，未处理板与本发明的板之间的差异仍然明显。即对于未处理板，残余含量在43℃仅为50.4％。然而，对于PB 6.0固化板和HEPES 6.5固化板，残余含量在43℃分别为92.8％和90.9％。因此，同样在胃蛋白酶原II的试验中，当采用本发明的板时，测量值相对于温度负荷的稳定性明显提高。
实施例3pH缓冲剂固化板中储存的血清样品中的前列腺特异的酸性磷酸酶(PAP)的试验按照与实施例2描述的相同的方式制备PB 6.0固化板。按照与实施例1描述的相同的方式制备血清样品。
以100μl/孔的量将血清样品倒入PB 6.0固化板和作为对照用的未处理板的孔中。将板在4℃(对照)和37℃下放置4小时。将血清样品立即分别回收并冷冻。
此后，用PAP RIA试剂盒(DPC-PAP-IRMA试剂盒，Diagnostic ProductsCorporation)，根据制造商推荐的方法试验血清中PAP的量。结果示于表4中。
表4

标准值3.5ng/ml或更低；测量方法RIA(IRMA)可见当置于37℃下时，PAP快速丧失其活性。例如，从在37℃下将血清培养4小时后的数据看，与起点(0小时)的数据相比，PAP活性(通过酶定量分析)降低到0％，PAP的蛋白质含量(通过RIA)降低到约30％。
在该实验(即实施例3)中，可见当血清样品在37℃的未处理容器中储存4小时后，与储存于4℃的相同容器中的相比，PAP的量降低到13.6％，当相同的血清样品在37℃的本发明的容器中(即PB 6.0固化板)储存4小时后，与储存于4℃的相同容器中的相比，PAP的量保持在91.3％，与储存于4℃的未处理容器中的相比，该量保持在95.5％。因此，本发明的方法和容器对于稳定PAP非常有效。
本发明仅通过以下权利要求进行定义或限制。
权利要求
1.用于稳定血液、血清或血浆样品的方法，该方法包括1-a)向血液样品中加入pH缓冲剂，1-b)制备血清或血浆样品，并向样品中加入pH缓冲剂，或1-c)将血液、血清或血浆样品放入含有pH缓冲剂的容器中，和2)储存在步骤1-a、1-b或1-c中获得的样品，其中pH缓冲剂具有从弱酸性pH到弱碱性pH范围的初始pH，并具有将步骤1-a、1-b或1-c中获得的样品的pH在步骤2中保持在中性附近的缓冲能力。
2.根据权利要求1的方法，其中pH缓冲剂将样品的pH在步骤2中保持在pH7.0至pH8.0的范围内。
3.根据权利要求1的方法，其中pH缓冲剂具有在pH5.5至pH8.0范围内的初始pH。
4.根据权利要求1的方法，其中pH缓冲剂具有选自固体、粉末、颗粒、涂层、液滴和微液滴的形式。
5.根据权利要求1的方法，其中pH缓冲剂通过将已在容器中含有的pH缓冲剂的水溶液进行真空干燥(包括减压干燥和冷冻干燥)、传热干燥(包括对流传热干燥、辐射传热干燥和传导传热干燥)、内部发热干燥、用干燥剂干燥、超声干燥或风干来制备。
6.根据权利要求1所述的方法，其中容器为真空或非真空血液收集管、用于分离血清或血浆的离心管、尿收集杯、样品储存容器、96孔微滴定板或其组件、384孔板或将样品邮寄到临床参考实验室时采用的样品容器。
7.一种与血液、血清或血浆阵品接触的容器，该容器中含有pH缓冲剂，所述pH缓冲剂具有从弱酸性pH到弱碱性pH范围的初始pH，并具有将样品的pH保持在中性附近的缓冲能力。
8.根据权利要求7的容器，其中pH缓冲剂将样品的pH保持在pH7.0至pH8.0的范围内。
9.根据权利要求7的容器，其中pH缓冲剂具有在pH5.5至pH8.0范围内的初始pH。
10.根据权利要求7的容器，其中pH缓冲剂具有选自固体、粉末、颗粒、涂层、液滴和微液滴的形式。
11.根据权利要求7的容器，其中pH缓冲剂通过将已在容器中含有的pH缓冲剂的水溶液进行真空干燥(包括减压干燥和冷冻干燥)、传热干燥(包括对流传热干燥、辐射传热干燥和传导传热干燥)、内部发热干燥、用干燥剂干燥、超声干燥或风干来制备。
12.根据权利要求7的容器，其中容器为真空或非真空血液收集管、用于分离血清或血浆的离心管、尿收集杯、样品储存容器、96孔微滴定板或其组件、384孔板或将样品邮寄到临床参考实验室时采用的样品容器。
13.用于稳定血清或血浆样品的方法，该方法包括1-a)向血液样品中加入pH缓冲剂，或1-b)将血液样品置于包含pH缓冲剂的容器中，2)将pH缓冲剂溶解在血液样品中，3)从步骤2获得的样品制备血清或血浆样品，和4)储存步骤3中获得的血清或血浆样品，其中pH缓冲剂具有从弱酸性pH到弱碱性pH范围的初始pH，并具有将步骤3中获得的血清或血浆样品的pH在步骤4中保持在中性附近的缓冲能力。
全文摘要
本发明的目的是提供通过稳定血液成分而使得可正确分析这些成分的简便方法以及用于该方法的容器。该目的通过稳定血液、血清或血浆样品的方法实现，该方法包括1－a)向血液样品中加入pH缓冲剂，1－b)制备血清或血浆样品，并向样品中加入pH缓冲剂，或1－c)将血液、血清或血浆样品置于含有pH缓冲剂的容器中，和2)储存在步骤1－a、1－b或1－c中获得的样品，其中pH缓冲剂具有从弱酸性pH到弱碱性pH范围的初始pH，并具有将步骤1－a、1－b或1－c中获得的样品的pH在步骤2中保持在中性附近的缓冲能力。该目的还通过使用与血液、血清或血浆样品接触的容器来实现，该容器中含有pH缓冲剂，该pH缓冲剂具有从弱酸性pH到弱碱性pH范围的初始pH，并具有将样品的pH保持在中性附近的缓冲能力。该目的通过稳定血清或血浆样品的另一种方法来实现，该方法包括1－a)向血液样品中加入pH缓冲剂，或1－b)将血液样品置于含有pH缓冲剂的容器中，2)将pH缓冲剂溶解在血液样品中，3)从步骤2获得的样品制备血清或血浆样品，和4)储存步骤3中获得的血清或血浆样品，其中pH缓冲剂具有从弱酸性pH到弱碱性pH范围的初始pH，并具有将步骤3中获得的血清或血浆样品的pH在步骤4中保持在中性附近的缓冲能力。
文档编号G01N1/28GK1515907SQ03103729
公开日2004年7月28日 申请日期2003年1月3日 优先权日2003年1月3日
发明者有马和久, 小嵨雅晴, 中野真也, 郡司知子, 也, 子, 晴 申请人:极东制药工业株式会社