专利名称：含马兜铃酸及其内酰胺类成分的体内样品的测定方法
技术领域：
本发明涉及同时测定血液(血浆、血清、红细胞)、组织(心、肝、脾、肺、肾、脑、胃、膀胱)中马兜铃酸及其内酰胺类成分的高效液相色谱方法。
背景技术：
马兜铃酸I、II(aristolochic acid I，AA-I；aristolochic acid II，AA-II)是马兜铃属植物含有的主要活性成分，同时也是有毒成分，AA-I、AA-II的体内主要代谢产物为马兜铃内酰胺I、II(aristololactam I，AL-I；aristololactam II，AL-II)。由于“马兜铃酸肾病”(Aristolochic AcidNephrophathy，AAN)的报道，此类成分的体内的含量检测研究成为重要任务。
马兜铃酸类化合物在体内分布的分析检测方法前人有一些报道。检测AA-I、II的方法有纸色谱-分光光度法(K.Hideg，Olga H.Hankovszky，J.Méhes.Estimation of aristolochic acid and some of its derivatives bypaper chromatography and spectrophotometry in body fluids，Acta Physiologica，1963，2379-84)、紫外分光光度法(相正心，何兴全，周桂芬，等.马兜铃酸含量的紫外分光光度测定法及药代动力学研究.药学学报，1984，19(3)224～227)、气相色谱法(赖普辉，姜贵吉，裴文.马兜铃酸-A的制取及其衍生物的合成.化学通报，1990，(1)33～35)以及同位素标记法(苏涛，屈磊，张春丽，等.马兜铃酸I在大鼠体内的代谢特征研究.中国中药杂志.2004，29(7)676-681)等；马兜铃内酰胺类化合物的检测，有高效液相色谱-荧光法测定尿及粪便中的AL-I、AL-II、AL-Ia(G.Krumbiegel，et al.Studies on the metabolism of aristolochic acids I and II，Xenobiotica，1987，17(8)981-991)，及测定人尿中的AL-I、AL-II(Schulz M，Weist F，Gemahlich M.Dunnschichtchromatographischer Nachweis der Aristolochia-Saure inverschiedenen Korperflussigkeiten.Arznein Forsch，1971，21934～936)报道，但是尚无对血液、组织中的AAs和ALs同时进行检测的报道。目前仅有本课题组的一项发明专利(申请号200410033845.7)提供了血浆中同时测定马兜铃酸I、II和马兜铃内酰胺I、II的高效液相色谱方法，但未见红细胞中该类成分测定的报道，也未见组织中马兜铃内酰胺类成分测定的报道，而仅见组织中马兜铃酸类成分测定的报道。
发明内容
本发明的目的在于针对以上存在的问题，提供一种同时测定血液(血浆、血清、红细胞)和组织(心、肝、脾、肺、肾、脑、胃、膀胱等)中马兜铃酸类及马兜铃内酰胺类化合物的高效液相色谱方法。
采用以下措施来实现上述发明目的。以血浆中同时测定马兜铃酸I、II和马兜铃内酰胺I、II的高效液相色谱方法为基础，通过对血浆、红细胞、组织(心、肝、脾、肺、肾、脑、胃、膀胱)样品进行盐酸酸化、乙酸乙酯提取预处理后，采用高效液相色谱仪分析。包括含有配备二极管阵列检测器的高效液相色谱仪和十八烷基硅烷键合硅胶色谱柱，流动相为1％冰醋酸/30mmol·L-1三乙胺-乙腈梯度洗脱，检测波长分别为250nm(马兜铃酸)、260nm(马兜铃内酰胺)。
本发明包括生物样品预处理方法和分析测定方法2方面内容。
1、样品的预处理(1)血浆样品预处理吸取0.5～1.0ml血浆于离心管中，加入5mol·L-1的盐酸5～10μl，涡旋混合1min，室温(20℃)水浴45min，加入3ml乙酸乙酯，涡旋混合1min，取上清；下层再加入3ml乙酸乙酯，涡旋混合1min，4000转/分，离心2min，取上清液，合并两次上清液。40℃水浴，N2挥干，150μl甲醇溶解残渣，过滤，4℃保存，留待进样。
(2)红细胞样品预处理吸取0.5ml红细胞于离心管中，加入0.5ml的蒸馏水，涡旋混合1min，室温(20℃)下静置30min。红细胞破裂溶解后，同“血浆样品制备”项下“加入5mol·L-1的盐酸10μl”起操作。
(3)组织样品预处理称取适量组织样品(心、肝、脾、肺、肾、脑、胃、膀胱)，按照每克组织样品加入4ml生理盐水的比例，制备组织匀浆液。
其中，心、脾、肺采用整个组织，用眼科剪剪碎后，加入匀浆液匀浆；肝组织每次均取方叶部分称重后剪碎匀浆；肾脏取右肾下半部分，剪碎后匀浆；脑组织直接匀浆即可；胃、膀胱将组织里面翻过来，将其内容物清洗干净，剪碎后匀浆；膀胱由于较小，不进行分别测定，而是将一组大鼠的膀胱分别清洗后放在一起匀浆、测定。
吸取1ml组织匀浆液于离心管中，同“血浆样品制备”项下“加入5mol·L-1的盐酸10μl”起操作。
2.前项发明样品预处理条件的考察本发明采用含马兜铃酸类及马兜铃内酰胺类成分的人血浆样品酸化后以乙酸乙酯进行萃取的预处理方法。针对影响马兜铃酸及马兜铃内酰胺类成分提取回收率的影响因素，如萃取溶剂用量、加入盐酸浓度等进行了筛选；同时还设计了正交试验和验证实验对其它操作条件进行了优化，最终获得了对含马兜铃酸及马兜铃内酰胺类成分的人血浆或血清样品均有较高提取回收率(均大于95％)的预处理方法。
(1)测定所用色谱条件色谱柱ZORBAX SB-C18(4.6mm×250mm，5μm)，Agilent公司流动相A∶B＝1％醋酸/30mmol·L-1三乙胺∶乙腈(35％B→100％B)柱温15℃进样体积20μl检测波长260nm(AL-I，AL-II)；250nm(AA-I，AA-II)。
人血浆分离色谱图，见说明书附图1。
(2)萃取溶剂用量的确定-20℃保存正常人空白血浆，37℃水浴解冻，分别取1.0ml血浆，加入60μl混和对照品溶液(其中AL-II、AA-II、AL-I、AA-I的浓度分别为9.80、10.1、10.3、6.60μg·ml-1)，涡旋混匀1min，加入5mol·L-1盐酸溶液10μl，涡旋混匀1min，40℃水浴30min，放冷至室温，分别采用乙酸乙酯3ml萃取一次；5ml萃取一次；6ml分二次加入(3ml，3ml)萃取后合并上清液；7ml分三次加入(3ml，3ml，1ml)萃取后合并上清液。萃取后的上清液分别在40℃水浴N2挥干(约40～60min)，加入150μl甲醇溶解，过滤(0.45μm)。4℃保存。进样体积20μl。结果见表1，从表中可以看出分别采用3ml、5ml萃取一次4种成分的提取回收率均低于90％，6ml(3ml，3ml)分二次萃取后合并上清液得到的血浆中4种成分提取回收率均较高且接近100％。因此萃取溶剂用量确定为1.0ml血浆加入6ml乙酸乙酯，分二次加入(3ml，3ml)萃取后合并上清液。
表1 萃取溶剂不同用量提取后人血浆中4种成分的提取回收率比较
(3)盐酸浓度的确定-20℃保存正常人空白血浆，37℃水浴解冻，分别取1ml血浆加到7ml塑料离心管中，分别加入60μl混和对照品液(其中AL-II、AA-II、AL-I、AA-I的浓度分别为9.80、10.1、10.3、6.60μg·ml-1)，涡旋混匀1min后分别加入1mol·L-1、3mol·L-1、5mol·L-1、7mol·L-1、10mol·L-1盐酸溶液10μl，涡旋混匀1min，40℃水浴30min，放冷至室温，6ml乙酸乙酯分二次加入(3ml，3ml)萃取，分别涡旋混合1min，合并上清液。萃取后的上清液在40℃水浴下N2挥干(约40～60min)，加入150μl甲醇溶解，过滤(0.45μm)。4℃冰箱保存。进样体积20μl。计算提取回收率，结果见表2。从表2可以看出加入5mol·L-1盐酸酸化后，血浆中4种目标成分的提取回收率最高且接近100％。加入盐酸浓度较低为1mol·L-1时，AA-I、AA-II的提取回收率均低于50％；加入盐酸浓度较高为10mol·L-1时，AA-I、AA-II的提取回收率低于90％。因此血浆样品酸化时加入盐酸的浓度确定为1ml血浆加入5mol·L-1盐酸溶液10μl。
表2 不同浓度盐酸酸化处理后人血浆中4种成分提取回收率比较
(4)其它操作条件的优化为了考察样品处理过程中的水浴温度、水浴时间、挥干温度等其它操作条件对加入盐酸酸化后的血浆样品中4种目标成分提取回收率的影响，我们设计了L9(34)正交表(见表3)对人血浆样品处理条件进行进一步的优化。样品预处理方法为取1ml血浆，分别加入60μl混和对照品溶液，萃取溶剂用量为6ml，分二次(3ml，3ml)萃取后合并上清液的样品预处理方法，按正交表设计正交试验方案(见表4)并进行样品处理后HPLC测定4种成分的峰面积。以血浆中4种目标成分的总平均提取回收率作为衡量指标。
表3 L9(34)正交表
表4 正交试验方案及结果
从极差分析结果(R值)可以直观地看出，血浆中马兜铃酸及马兜铃内酰胺类成分提取率的影响因素A＞B＞C＞D；各因素的最优水平组和为A2B1C3D2。对上述结果进行方差分析(见表5)表5 正交试验方差分析
从方差分析表结果可以看出，A(盐酸浓度)为影响4种马兜铃酸类成分提取回收率的主要因素(P＜0.01)，其余因素为次要因素，进一步说明含马兜铃酸类成分的血浆样品处理过程中加入盐酸酸化的必要性。随后对正交试验结果进行验证实验(见表6)，设计了A2B1C3D2、A3B1C3D2、A2B2C2D2并对结果进行比较(表7)。
表6 正交验证实验设计
表7 正交验证实验结果
注释正交验证实验中制备二份样品；优化条件1中的一份样品操作时出现误差，因此表中数值仅为一份样品的计算值。
在正交验证的三种组合条件下血浆中4种目标成分的提取回收率均大于95％，考虑到盐酸浓度太大对样品的稳定性具有一定的影响，因此样品处理方法的其它操作条件优化为取1ml血浆，加入5mol·L-1盐酸溶液10μl，20℃水浴，水浴45min，40℃水浴N2挥干。
2、色谱条件的确定及分析方法的验证色谱条件色谱柱ZORBAX SB-C18(4.6mm×250mm，5μm)，Agilent公司流动相A∶B＝1％醋酸/30mmol·L-1三乙胺∶乙腈(35％B→100％B)柱温15℃进样体积20μl检测波长260nm(AL-I、AL-II)；250nm(AA-I、AA-II)。
分析方法的验证本发明分别考察了血浆、红细胞、肝、肾中AA-I、II，AL-I、II的分析方法的方法学验证几个方面专属性、标准曲线、检测限、定量限、精密度、准确度、回收率、稳定性等。其中标准曲线的线性范围较宽，采用了加权最小二乘法，使本发明方法的适用范围更广。
精密度、准确度、回收率验证为向空白样品中加入混合对照品，按上述色谱条件和实验方法测定(n＝5)，将测得的峰面积带入标准曲线，求得计算浓度(Cc)，对此5份浓度求算相对标准偏差(RSD，％)，即为精密度；将计算浓度(Cc)与实际加入的浓度(Ca)相比(Cc/Ca)，即为准确度(％)。
回收率验证中建立溶剂标准曲线，以溶剂标准曲线计算相应各浓度点的溶剂峰面积。以样品所得到的峰面积(A样品)与溶剂标准曲线所得到的峰面积(A溶剂)相比(A样品/A溶剂)，得到的百分比即为提取回收率，并计算各浓度点提取回收率的RSD值。
稳定性考察提取后样品在室温下放置24h的稳定性、样品在-20℃下冻存20天的稳定性、样品经过3次冻融后的稳定性。分别将经上述条件下存放的样品的色谱峰面积(A)与提取后即刻进样的样品的色谱峰面积(A0)相比较(A/A0)，得到的百分比(S)即为稳定性。
AA-I、AA-II、AL-I、AL-II在血浆、红细胞、肝、肾中线性良好，相关系数均大于0.99。日内、日间精密度均小于15％，准确度在80～120％以内，提取回收率在70％以上。4种被测成分在此色谱条件下的保留时间分别为AL-II为32.5min，AA-II为35.2min，AL-I为39.5min，AA-I为41.8min。
各成分的方法学验证结果见表8、9。
经方法学验证，方法适用于血浆、红细胞，肾、肝匀浆液中4种被测成分的含量测定，各成分分离良好，内源性物质无干扰。准确性、重复性、回收率均符合生物样品方法学验证的原则；样品在室温、冷冻、冻融情况下稳定性良好。
为扩大实用性，对血浆、红细胞、肝、肾4种样品的标准曲线的互代使用情况进行考察，因发现用血浆、红细胞标准曲线去计算肝、肾样品中的成分含量出现的误差较大，所以其他组织的浓度采用预处理方法较为近似的肝、肾标准曲线分别计算后得到的两个数值加以平均表示。方法学验证结果表明方法可以用于血液、组织中马兜铃酸类成分的含量测定。
说明书附图3～6为血浆、红细胞、肝、肾的分离色谱图。
表8 方法学验证结果(血浆、红细胞)
表8方法 学验证结果(血浆、红细胞)(续)
表9 方法学验证结果(肾、肝)
表9 方法学验证结果(肾、肝)(续)
图1血浆色谱分离图(a)正常人空白血浆色谱分离图(b)正常人空白血浆中加入马兜铃酸及马兜铃内酰胺类成分(分别为AL-II、AA-II、AL-I、AA-I)的色谱分离图注人血浆测定采用手动进样色谱仪，红细胞和组织测定采用自动进样色谱仪。
图2(a)空白大鼠血浆色谱图及29-44min的局部放大色谱图
(b)本发明方法制备的关木通水煎液给药大鼠血浆色谱图及29-44min的局部放大色谱图(c)蛋白沉淀法制备的关木通水煎液给药大鼠血浆色谱图及29-44min的局部放大色谱3 A空白血浆；B空白血浆加对照品色谱4 A空白红细胞；B空白红细胞加对照品色谱5 A空白肾匀浆液色谱图；B空白肾匀浆液加对照品色谱6 A空白肝匀浆液色谱图；B空白肝匀浆液加对照品色谱7 灌胃关木通水煎液大鼠血浆样品，小图为局部放大图(AL-II与左边的内源峰分离度为1.7，AA-II与右边的峰的分离度为2.0)图8 灌胃关木通水煎液大鼠红细胞样品，小图为局部放大9 灌胃关木通水煎液大鼠肾匀浆液样品图10 灌胃关木通水煎液大鼠肝匀浆液样品(AL-II与左边的内源峰的分离度为1.6)具体实施方式
1.大鼠血浆中马兜铃酸及马兜铃内酰胺类成分的测定为给患者血浆或血清中马兜铃酸及其内酰胺类成分的测定奠定基础，我们预先用关木通水煎液(浓度分别为6g·ml-1、4g·ml-1)灌胃SD雄性大鼠，模拟临床马兜铃酸肾病患者，获得含药血浆后，采用本发明方法对含药血浆进行预处理和HPLC检测，并将本发明方法与常用的蛋白沉淀法进行比较。
实施本发明的具体步骤包括(1)色谱条件色谱柱ZORBAX SB-C18(4.6mm×250mm，5μm)，Agilent公司流动相A∶B＝1％醋酸/30mmol·L-1三乙胺∶乙腈(35％B→100％B)柱温15℃进样体积20μl检测波长260nm(AL-I、AL-II)；250nm(AA-I、AA-II)。
(2)样品处理方法本发明方法取灌胃关木通水煎液(浓度为6g·ml-1、4g·ml-1)的给药大鼠血浆1.0ml置于7ml塑料离心管中，加入5mol·L-1盐酸溶液10μl，涡旋混合，40℃水浴30min，放冷至室温，6ml乙酸乙酯分二次加入(3ml，3ml)萃取，分别涡旋混合，合并上清液；萃取后的上清液40℃水浴下N2挥干，150μl甲醇溶解，过滤，取滤液20μl进样。
蛋白沉淀法取灌胃关木通水煎液(浓度为6g·ml-1、4g·ml-1)取给药大鼠血浆1.0ml置于7ml塑料离心管中，加入3ml乙腈/无水乙醇/DMF混合液(30∶10∶5)，涡旋混合1min，12000转/分，离心5min，取上清，60℃水浴，N2挥干，150μl甲醇溶解，4℃保存，留待进样。进样体积20μl。
(3)色谱峰峰面积的HPLC测定从说明书附图2中可以看到本发明方法与蛋白沉淀法相比，极性较大的内源性色谱峰较少且强度较弱，说明本发明方法能够减小血浆中极性较大的内源性物质对色谱柱造成的污染；另外，本发明方法制备得到的血浆色谱图中4个目标成分的色谱峰均完全分离且峰形较好。从表10的测定结果可以看出，本发明方法制备得到的血浆中4种目标成分的峰面积值均高于蛋白沉淀法，尤其是药材中所含比例较低的马兜铃内酰胺I和II的峰面积值的增加较大。
表10 本发明方法与蛋白沉淀法制备的给药大鼠血浆测定结果比较
2.病人血浆中AA-I、II，AL-I、II的测定以此HPLC方法测定36份马兜铃酸肾病病人血浆。其中，18份马兜铃酸肾病病人血浆样品中检测到AL-II，20份样品中检测到AL-I，15份样品中同时检测到AL-I、II，采用该方法未在36份病人样品中检测到AA-I、AA-II。结果见表11表11 马兜铃酸肾病病人血浆样品中AA-I、II，AL-I、II的测定结果
注“+”表示检测出，但未达到定量限；“-”表示未检出。
表11 马兜铃酸肾病病人血浆样品中AA-I、II，AL-I、II的测定结果(续)
注“+”表示检测出，但未达到定量限；“-”表示未检出。
3.血液(血浆、红细胞)、组织(心、肝、脾、肺、肾、脑、胃、膀胱)中马兜铃酸及马兜铃内酰胺类成分的测定为了获得模拟临床马兜铃酸肾病病人的情况，我们采用关木通水煎液灌胃大鼠造成的急性肾功能损害模型来验证本发明的应用性。
(1)动物实验以关木通水煎液灌胃大鼠，连续灌胃7天，于第4天时将大鼠处死取血，解剖分取组织。获得血浆、红细胞、心、肝、脾、肺、肾、脑、胃、膀胱等样品。
(2)样品处理、色谱条件见发明内容。
(3)实验结果见说明书附图7～10，分别为血浆、红细胞、肝、肾中的马兜铃酸类及内酰胺类成分测定色谱图。可见，采用本发明方法能够同时测定血液(血浆、红细胞)、组织(心、肝、脾、肺、肾、脑、胃、膀胱)中的AA-I、II，AL-I、II，各成分均分离良好，内源性物质对测定无干扰。
权利要求
1.一种含马兜铃酸类及马兜铃内酰胺类成分的生物样品的预处理方法，其特征在于取0.5～1.5ml生物样品，加入盐酸(每毫升生物样品中盐酸浓度范围在3.0×10-5～1.0×10-4mol·L-1内)后涡旋混匀，室温放置30～60min，然后采用乙酸乙酯萃取1～2次，每次1.5～5.0ml，涡旋混合萃取，收集上清液，在60℃以下的水浴上用氮气(N2)挥干，加入150μl甲醇溶解残渣，过滤，供进样做高效液相色谱分析。方法中所述的生物样品来源包括人、大鼠、小鼠和兔子等的血浆样品、血清样品和红细胞溶液样品(吸取等量的红细胞和蒸馏水于离心管中，涡旋混合，静置使红细胞破裂溶解后得到红细胞溶液)以及大鼠、小鼠和兔子等的组织匀浆液样品(称取适量组织样品包括心、肝、脾、肺、肾、脑、胃、膀胱等，按照每克组织样品加入4ml生理盐水的比例，制备组织匀浆液)等；方法中所述的马兜铃酸类及马兜铃内酰胺类成分包括马兜铃酸I、马兜铃酸II、马兜铃内酰胺I和马兜铃内酰胺II。
2.根据权利要求1所述含马兜铃酸类及马兜铃内酰胺类成分的生物样品预处理方法和内容，其特征在于生物样品为人血浆、人血清或人红细胞。
3.根据权利要求1所述含马兜铃酸类及马兜铃内酰胺类成分的生物样品预处理方法和内容，其特征在于生物样品为人、大鼠、小鼠和兔子等的红细胞溶液样品以及大鼠、小鼠和兔子等的心、肝、脾、肺、肾、脑、胃、膀胱等组织匀浆液样品。
4.根据权利要求1所述含马兜铃酸类及马兜铃内酰胺类成分生物样品预处理方法和内容，其特征在于加入盐酸浓度为5mol·L-1，此时每毫升生物样品中盐酸浓度为5×10-5mol·L-1；室温放置温度为20℃时，放置时间为45min。
5.根据权利要求1所述含马兜铃酸类及马兜铃内酰胺类成分生物样品预处理方法和内容，其特征在于采用乙酸乙酯萃取2次，每次3ml，合并上清液后在40℃水浴上用N2挥干。
6.根据权利要求1所述的生物样品的预处理方法得到的血液(血浆、血清、红细胞)、组织(心、肝、脾、肺、肾、脑、胃、膀胱)中马兜铃酸及马兜铃内酰胺类成分的高效液相色谱分析测定方法，其特征在于采用配备二极管阵列检测器的高效液相色谱仪和十八烷基硅烷键合硅胶色谱柱，流动相为1％冰醋酸/30mmol·L-1三乙胺-乙腈梯度洗脱(35％→100％乙腈)，柱温15℃，，检测波长分别为250nm(马兜铃酸类)、260nm(马兜铃内酰胺类)，既可定性分析也可定量分析。方法中所述的马兜铃酸类及马兜铃内酰胺类成分包括马兜铃酸I、马兜铃酸II、马兜铃内酰胺I和马兜铃内酰胺II。
7.根据权利要求1和6所述的生物样品的预处理方法和分析测定方法，其特征在于生物样品为人的血液(血浆、血清、红细胞)。
8.根据权利要求1和6所述的生物样品的预处理方法和分析测定方法，其特征在于生物样品为人、大鼠、小鼠和兔子等的红细胞溶液样品以及大鼠、小鼠和兔子等的心、肝、脾、肺、肾、脑、胃、膀胱等组织匀浆液样品。
9.根据权利要求1和6所述的生物样品的预处理方法和分析测定方法，其特征在于对生物样品中存在的马兜铃酸类及马兜铃内酰胺类成分同时进行分析测定。
10.根据权利要求1～5所述含马兜铃酸类及马兜铃内酰胺类成分生物样品预处理方法，其特征在于可从生物样品中同时提取马兜铃酸类及马兜铃内酰胺类成分。
全文摘要
本发明涉及同时测定血液(血浆、血清、红细胞)、组织(心、肝、脾、肺、肾、脑、胃、膀胱)中马兜铃酸及马兜铃内酰胺类成分的高效液相色谱方法，其特点为样品经盐酸酸化后经乙酸乙酯提取，采用配备二极管阵列检测器的高效液相色谱仪和十八烷基硅烷键合硅胶色谱柱，流动相为1％冰醋酸/30mmol·L
文档编号G01N1/28GK1959408SQ20051011711
公开日2007年5月9日 申请日期2005年11月1日 优先权日2005年11月1日
发明者王璇, 许俊羽, 李晓玫, 高小丽, 蔡小青 申请人:北京大学