以x射线单次测量实现对称性微纳米样品三维成像的方法
【专利摘要】本发明公开了以X射线单次测量实现对称性微纳米样品三维成像的方法，是以相干X射线衍射显微镜为成像设备，利用X射线自由电子激光全相干，高通量和短脉冲的特点，通过采集单脉冲照射下对称性微纳米样品的二维衍射数据，根据对称性样品本身的晶体学对称性，计算其衍射数据的自身等价线，确定出样品的空间取向，利用样品的空间对称性，对二维衍射数据进行其所属晶体学点群的对称操作，获得样品的三维衍射数据，再利用过度取样和迭代算法对三维重组衍射数据进行相位恢复和图像重建，最终得到对称性样品三维结构。本发明方法仅需要一次测量即可实现样品的三维重建，有效提高了三维成像实验效率，对于丰富三维成像方法提供了新思路。
【专利说明】以X射线单次测量实现对称性微纳米样品三维成像的方法
【技术领域】
[0001]本发明属于X射线成像方法【技术领域】，尤其涉及一种单次测量具有对称性微纳米样品的二维衍射数据来实现样品结构三维重建的X射线成像方法。
【背景技术】
[0002]随着同步辐射光源亮度的不断提高，X射线成像方法得到了快速的发展，新的X射线成像方法不断涌现，成像分辨率也在进一步提高。由于X射线具有波长短，穿透能力强的特点，是进行高分辨三维成像的理想光源。目前Micro-CT和Nano-CT成像技术已经日趋成熟，分别可以获取大样品的微米分辨率三维结构和较小样品的纳米分辨率的三维结构。但是由于X射线难以聚焦，目前的X射线CT的最高成像分辨率不超过30nm。利用第三代和第四代同步辐射光源高相干性和高亮度的特点，相干X射线衍射成像方法得到了广泛的重视和快速的发展。由于相干X射线衍射成像方法不以透镜为成像元件，摆脱了透镜质量对成像分辨率的限制，理论上可以达到原子分辨率。将相干X射线衍射成像方法与断层扫描成像方法相结合，目前可以获得IOnm分辨率的三维成像结果。
[0003]但是无论以上何种成像方法，在实现样品三维成像的过程中均需要测量大量的投影，不仅增加了数据采集时间，而且也会由于长时间曝光而对样品产生严重的辐射损伤。尤其对于生物样品来说，辐射损伤问题是限制生物样品分辨率进一步提高的主要因素。目前冷冻透射电子显微镜单颗粒成像技术已经被广泛应用于单颗粒病毒等全同性样品的三维高分辨成像。其利用样品具有全同性的特点，通过大量测量样品在实空间中的图像，结合图像处理方法对样品透射电镜图像进行筛选和降噪处理，利用等价线和投影匹配的方法确定样品的取向和中心以及实现各图像之间的归一化，对已处理电镜照片进行二维傅里叶变换，从而实现大量病毒样品衍射图样的三维重组，最后利用三维傅里叶逆变换实现病毒样品的三维成像。该方法已经成功实现了多种病毒三维结构的解析，并且在全同蛋白颗粒三维结构解析中得到了广泛的应用。但是冷冻电子显微镜在实现单颗粒三维成像过程中同样需要拍摄大量的全同颗粒的实空间图像，同时考虑到电子对生物样品具有严重的辐射损伤，需要减少电子剂量，因此所获得的透射电镜照片衬度较低，图像质量较差，需要对数据进行筛选和降噪音处理，使得数据处理变得繁琐。
[0004]相比于电子，X射线对样品的辐射损伤更小，但是对于病毒等生物单颗粒样品来说，由于其对X射线的衍射能力较弱，很难获取高质量的衍射信号，得到较高分辨率的重建图像。为了进一步提高成像分辨率，需要增加相干X射线衍射成像技术的曝光时间，不仅对成像设备的稳定性有较高的要求，而且也容易因为长时间X射线辐照使样品结构发生变化。目前相干X射线光源亮度的提高为解决该问题提供了光源基础。X射线自由电子激光作为第四代同步辐射光源具有全相干、亮度高、短脉冲的特点，其脉冲时间可以达到飞秒，能够在样品破坏之前记录下其衍射数据，成功的解决了样品辐射损伤的问题，能够对自然状态下的样品进行成像，是实现原位、动态成像的理想光源。X射线自由电子激光技术与相干X射线衍射成像技术相结合是目前研究的重点，其为实现单次测量对称性微纳米样品实现三维重建的成像方法提供了可能，并在解析对称性晶体结构和病毒结构以及非结晶性的全同颗粒结构，如多种细胞膜复合物，分子伴侣，核糖体等样品三维结构中具有重要的应用价值。然而，经检索以X射线自由电子激光为光源，单次照射对称性微纳米样品实现样品三维重建的方法还未见报道。
【发明内容】
[0005]本发明的目的在于提供一种以X射线单次测量实现对称性微纳米样品三维成像的方法。
[0006]本发明所述以X射线单次测量实现对称性微纳米样品三维成像的方法，步骤包括:样品制备，对称性样品二维衍射数据的获取，单颗粒正入射二维衍射数据选取，单颗粒正入射衍射数据的处理，样品的空间取向确定，样品的三维衍射数据获取，对三维衍射数据进行相位恢复和三维重建。具体是:
[0007]I)制备浓度适中的单分散性样品:将具有对称外形的纳米晶体或病毒样品进行纯化处理，得到粒径和形貌相同的全同样品。
[0008]将纯化之后的样品进行稀释，利用超声或震荡方式分散处理I?10分钟，充分分散样品，用移液器取样品1-10 μ L滴至厚度为20?200nm的Si3N4薄膜上，并使膜表面上的样品密度不高于0.1个/y m2，即制得单分散样品。
[0009]上述具有对称外形的纳米晶体优选是四六面体纳米晶，偏方三八面体纳米晶，三八面体纳米晶或六八面体纳米晶；上述具有对称外形的病毒优选二十面体病毒颗粒。
[0010]2)利用相干X射线衍射显微镜装置，使用X射线自由电子激光单脉冲照射制备的样品，直接获取样品在傅里叶空间中的二维相干X射线衍射数据。
[0011]本发明所述以X射线单次测量实现对称性微纳米样品三维成像的方法需要一套完整的相干X射线衍射成像装置，该装置搭建于高性能第四代同步辐射光源(X射线自由电子激光)内，且均处于高真空环境之下，各装置之间采用真空管道连接。其中所述显微镜装置内部真空度不低于10_6torr,沿光路方向依次排列设置有脉冲宽度为6?30fs的X射线自由电子激光光源，响应时间不低于0.03s的X射线快门，狭缝尺寸为0.5?20 μ m的第一组X射线狭缝，狭缝尺寸为I?40 μ m的第二组X射线狭缝，XY方向移动范围为20±lmm且移动精度为0.3 μ m的样品台和置于样品台后20?8000mm且单个像素尺寸为50 μ mX 50 μ m 的 CCD 探测器。
[0012]将样品置于样品室中的样品台之上，利用内置光学显微镜调节样品至X射线光斑位置(即确定好Si3N4薄膜位置)，扫描膜上步骤I)制得的单分散样品，优选的实施方式是:设置X射线自由电子激光脉冲频率为10Hz，X射线快门曝光时间为0.1s,按照5?40 μ m/步的步进速度移动样品台，且每移动一步样品台，X射线快门曝光一次，对制备于Si3N4膜上的单分散样品进行单脉冲照射获取样品在傅里叶空间中的二维相干X射线衍射数据，并实现CCD探测器对衍射信号的记录和输出；其中相干X射线衍射显微镜装置中，所述X射线自由电子激光的脉冲宽度为6?20fs，第一组X射线狭缝的尺寸为2?10 μ m，第二组X射线狭缝的尺寸为5?20 μ m，所述CXD探测器置于样品台后500?4000mm处。
[0013]3)选择步骤2)获取的衍射数据中心区域100像素X 100像素?500像素X500像素的部分，计算该区域的平均衍射强度，以最高强度的50%?80%为强度阈值，凡高于该阈值的衍射数据即可确定为单颗粒样品的正入射二维衍射数据。
[0014]由于样品是随机分布于Si3N4薄膜上，因此每次曝光X射线照射样品位置是随机的，需要对衍射数据进行筛选，确定单颗粒样品的正入射二维衍射数据，凡高于该阈值的衍射数据即可确定为单颗粒样品的正入射二维衍射数据，保存筛选出的单颗粒正入射的二维衍射数据。
[0015]4)针对选出的单颗粒样品的正入射二维衍射数据，先扣除衍射数据的背景及CXD暗噪音，去除衍射数据的非连续线和非连续点，然后将衍射数据相邻的3像素X3像素?25像素X 25像素合并成一个像素，并对衍射数据做中心对称操作，即得到完整的衍射图。
[0016]由于多端口 C⑶探测器每一个像素点的响应存在差异，即为C⑶本身的暗噪音，因此需要对衍射数据进行扣除背景处理，背景选用与实验曝光时间相同的CCD暗背景；由于在X射线与微纳米样品相互作用过程中主要发生的是弹性散射，因此衍射图样是中心对称的；根据衍射图样的对称性找出其中心，并根据对称性去除衍射图样的非连续或非对称的点与线，最终得到正确的衍射信号，然后将衍射数据相邻的3像素X3像素?25像素X25像素合并成一个像素，并对衍射数据做中心对称操作，即得到完整的衍射图数据。
[0017]5)在步骤4)获得的衍射图上确定一条过其中心的线，通过每间隔0.1?2度做中心旋转方式设定另一条过中心的线，分别计算每两条线的强度差，依据强度差小于10%的强度阈值来确定自身等价线，同时记录等价线对应出现的角度及自身等价线的数量，用于确定所述样品的空间取向。
[0018]对于对称性微纳米样品，其取向总可以定义在一个非对称单元内，该样品在空间中的任一可能取向，可以通过对其进行对称操作得到。对称性样品的空间取向可由欧拉角(φ,θ，ω)和中心坐标(X，y, z)所定义，首先确定对称样品的坐标系，分别定义X, y, z轴,任何对称样品的位置及取向都可以通过该坐标系来描述；然后选定一条过中心的线，每间隔
0.1?2选取另一条过中线的线，将两条线进行拟合，计算两条线的强度差，强度差小于10%的确定为衍射图的一对自身等价线，记录该对自身等价线出现的角度；自身等价线出现的角度与样品的空间取向是一一对应的，且是成对出现的，因此根据等价线的角度可用于最终确定样品的空间取向。
[0019]6)根据步骤5)确定的样品空间取向和该样品的空间对称性，在直角坐标系中对所述样品二维衍射数据进行对称性样品所属晶体学点群对称性的旋转和中心对称处理，获取所述样品的三维衍射数据，其中直角坐标系中无数值格点位置的插值选用线性插值的方法。
[0020]首先建立一个三维空间直角坐标系，将通过步骤4)所获得的二维衍射图数据按照步骤5)所确定的空间取向放置入三维空间坐标系中，然后根据对称性样品所属的晶体学点群确定其所具有的所有空间对称操作，对二维衍射数据按照其空间对称操作进行旋转，其中直角坐标系中无数值格点位置的插值选用线性插值的方法，最终获取所述样品的三维衍射数据。
[0021]7)利用oversampling smoothness重建算法对步骤6)获取的三维衍射数据进行相位恢复和三维重建，即对三维衍射数据进行迭代计算；首次迭代过程中，三维衍射数据的初始相位信息选用随机相位信息，之后每次迭代过程中，三维衍射数据的相位信息选用前一次迭代计算所得到的相位，其强度信息选用通过步骤6)所获取的三维衍射数据；迭代过程中在实空间设定与样品尺寸相同的正方体约束条件，约束条件内的负电子密度及约束条件外的电子密度通过乘以系数0.05?0.3逐渐消去；选用渐变三维高斯低通滤波器对三维衍射数据进行梯度降噪处理，其高频通过率阈值区间为0.1?0.8 ;经过1000-10000次迭代，每经过一次迭代，相位均得到更新，最终得到对称性微纳米样品的三维结构图像。
[0022]本发明以X射线自由电子激光为光源建立了单次照射对称性微纳米样品即实现样品三维重建的方法，有效提高了三维成像实验效率，对于丰富三维成像方法提供了新思路。
[0023]X射线自由电子激光全相干、超短脉冲和超强强度的优点结合相干衍射成像方法克服了成像过程中衍射极限限制，对以X射线单次测量实现对称性微纳米样品三维成像的方法具有重要的应用价值；对于对称性微纳米样品，利用该方法仅需要通过X射线自由电子激光的单脉冲测量其在傅里叶空间中的二维衍射数据，根据样品本身的对称性，即可重建出其三维结构。本发明成功的利用X射线自由电子激光极短脉冲的优势，能够在样品结构发生变化前记录下其衍射数据，实现了样品结构的原位观察，尤其是对于对称性的病毒等生物样品的研究具有重要的应用前景。
[0024]本发明所述成像方法仅需要一次测量样品的二维衍射数据即实现样品三维重建，能够有效的提高样品利用率，提高数据采集效率，在研究对称性无机微纳米晶体结构方面有可观的应用价值。
【专利附图】
【附图说明】
[0025]图1为本发明中用于成像实验的相干X射线衍射成像显微镜的装置示意图，沿光路前进方向依次排列有I一X射线光源，2—X射线快门，3—第一组X射线狭缝，4一第二组X射线狭缝，5—样品台，6—真空管道，7—多端口 CCD探测器。
[0026]图2为二八面体金单晶纳米颗粒的对称点系和对称轴系的极射赤平投影图，晶体学点群为，有三个4重轴，四个3重轴，六个2重轴。
[0027]图3为本发明中获取的代表性的显露面为{552}的三八面体金单晶纳米颗粒的二维相干衍射图样。
[0028]图4为利用单次测量实现对称性微纳米样品三维成像的X射线成像方法重建得到的显露面为{552}的三八面体金单晶纳米颗粒的三维重建结果，分别为沿2次轴，3次轴，4次轴方向的重建结果图像。
【具体实施方式】
[0029]为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，如下所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
[0030]实施例1:
[0031]在所述以单次测量实现对称样品三维成像的X射线成像方法中，本实施例选择对具有48个对称操作的高对称性三八面体金单晶纳米颗粒实施三维成像，步骤如下:
[0032]I)、样品制备:
[0033]该实施例中，对称性样品选择具有高度空间对称性的三八面体金单晶纳米颗粒；该样品属于晶体学点群，包含3个4重轴，3个对称面，4个3重旋转-反演轴，6个2重轴,6个对称面；样品平均大小为150nm ;样品的显露面是{552}；
[0034]将合成均匀的三八面体金单晶纳米颗粒用去离子水稀释，利用高速离心机选用10000转/分进行离心，清洗掉金单晶纳米颗粒的表面活性剂，同时筛选出粒径均匀的单晶金颗粒；将纳米金颗粒稀释至设定的浓度，利用超声仪将已稀释样品进行超声处理5分钟，将金单晶纳米颗粒进行充分的分散；用移液器吸取3μ I滴至厚度为lOOnm，尺寸为2mmX2mm的Si3N4薄膜上，使金单晶纳米颗粒均勻分布于薄膜之上，浓度约为0.01个/μ m2 ；
[0035]2)、利用相干X射线衍射显微镜装置，使用X射线自由电子激光单脉冲照射制备的样品，直接获取样品在傅里叶空间中的二维相干X射线衍射数据:
[0036]所述的相干X射线衍射成像设备，如图1所示，沿光束前进方向依次共轴排列有:X射线光源1，X射线快门2，第一组X射线狭缝3，第二组X射线狭缝4，样品台5，真空管道6，多端口 CXD探测器7 ;上述相干X射线衍射成像装置中，X射线光源选用其单脉冲时间为IOfs,单脉冲通量可达到IO11Photons的SACLA X射线自由电子激光光源，X射线能量选择为7KeV ；X射线快门的响应时间为0.1s ;第一组X射线狭缝距离第二组狭缝位置为300mm，狭缝开口大小为5 μ m ;第二组狭缝位置距离样品台位置为150mm,狭缝开口大小为7 μ m ;样品台距离C⑶为2700mm;整套设备内部真空度为10_6torr ;多端口 CXD单像素大小为50 μ mX 50 μ m ；
[0037]将制备好的载有金单晶纳米颗粒样品的Si3N4薄膜固定于样品室中的样品台上，利用内置光学显微镜调节样品至X射线光斑位置，将整个设备进行抽真空处理，待真空度达到io_6torr时进行实验；实验数据采用扫描样品台的模式来获取单颗粒样品的衍射数据，设置X射线自由电子激光脉冲频率为10Hz，X射线快门曝光时间为0.ls，样品台移动步长为10 μ m ；X射线快门打开，单个X射线脉冲通过快门，照射Si3N4薄膜上的样品，同时CXD探测器曝光，记录样品的衍射数据，关闭X射线快门，移动样品台至下一个位置，重复上述过程，通过扫描样品台的模式来获取样品的衍射图样；每测一次数据记录一次CCD探测器的暗噪音，作为背景噪音；
[0038]3)、数据筛选，确定单颗粒样品的正入射二维衍射数据:
[0039]由于样品是随机分布于Si3N4薄膜上，因此每次曝光X射线照射样品的位置是随机的，需要对衍射数据进行筛选，确定单颗粒样品的正入射二维衍射数据:本实施例中，平均衍射强度方法被用来进行数据筛选；选取衍射数据中心区域300像素X300像素的部分，计算该区域的平均衍射强度，以最高强度的70%为强度阈值，凡高于该阈值的衍射数据即可确定为单颗粒样品的正入射二维衍射数据，保存筛选出的单颗粒正入射的二维衍射数据；
[0040]4)、二维衍射数据处理:
[0041]针对选出的单颗粒样品的正入射二维衍射数据，对该数据进行处理，包括扣除衍射数据的背景，去除衍射数据的非连续线和非连续点点；其中背景选用CCD的暗噪音为背底，由于曝光时间一致，因此可以直接扣除背底，得到背景均匀的衍射信号；在该X射线能量下，单颗粒衍射数据满足中心对称条件，利用衍射数据的对称性计算出衍射数据的中心，对衍射图样进行中心对称处理；另外，由于衍射图样的过度取样率较高，可以对衍射图样进行像素叠加处理，本实施例中，我们将衍射数据的9像素X9像素叠加为一个像素点,进一步增强衍射信号的信噪比，减小矩阵，增加运算速度；
[0042]5 )、晶体样品的空间定向:
[0043]经过步骤4)过程处理，即得到了单颗粒纳米金单晶的高信噪比二维衍射数据，如图3所示，为了实现三维重建，需要将二维衍射数据整合为三维衍射数据；本实施例中选用的三八面体金单晶纳米颗粒属于体学点群，其极射赤平投影图如图2所示；其中阴影区域为其非对称单元，空间中的任一可能取向都可以通过其对称轴的对称操作得到；为了得到三维衍射图样首先需要确定晶体的空间取向，设定空间直角坐标系的XYZ轴分别为三八面体三个4次旋转轴，中心坐标为三八面体的中心；该晶体的任一空间取向均可以通过空间方位角(φ,θ,ω)来表示；因此需要确定出空间方位角来确定晶体的空间取向；
[0044]晶体的空间取向是利用自身等价线的方法来确定；首先选定一条过中心的线，每间隔1°选取另一条过中线的线，将两条线进行拟合，计算两条线的强度差，强度差小于9%的确定为衍射图的一对自身等价线，记录该对自身等价线出现的角度；最终确定该晶体一共存在14对自身等价线；自身等价线出现的角度与晶体的空间取向是一一对应的，因此根据等价线的角度最终确定了晶体的空间取向；
[0045]6)三维衍射数据的获取:
[0046]首先建立一个三维空间直角坐标系，将所获得的二维衍射数据按照所确定的空间取向放置入所述三维空间坐标系中，然后根据对称性样品所属的晶体学点群确定其所具有的48个空间对称操作，对二维衍射数据按照其空间对称操作进行旋转，其中直角坐标系中无数值格点位置的插值选用线性插值的方法，最终得到了完整的该三八面体的三维衍射图样；
[0047]7)、三维重建:
[0048]金单晶纳米颗粒的三维重建过程包括三维衍射数据的相位恢复和样品结构的三维成像,本实施例中我们采用过度取样与迭代相结合的oversampling smoothness (OSS)的算法来进行三维重建:
[0049]步骤一、首次迭代过程中，三维衍射数据的初始相位信息选用随机相位信息，即首先赋予重组三维衍射数据一随机初始相位，得到完整的三维衍射图样；之后每次迭代过程中，三维衍射数据的相位信息选用前一次迭代计算所得到的相位，其强度信息选用通过步骤6)所获取的三维衍射数据；
[0050]步骤二、对完整重组三维衍射数据进行三维反傅里叶变换，得到在实空间中的样品三维结构数据，实空间设定与样品尺寸相同的正方体约束条件，约束条件内的负值部分及约束条件外的部分通过乘以系数0.1逐渐消去；约束条件以内的正值部分表示样品的电子密度，在重建过程中保留；在傅里叶空间中选用渐变三维高斯低通滤波器对三维衍射数据进行梯度降噪处理，其高频通过率阈值区间为0.1-0.8 ；
[0051]步骤三、对实空间中样品结构进行三维傅里叶变换，得到在傅里叶空间中的相位得到更新的三维衍射数据，提取该相位与实验测得的重组三维衍射数据进行重新整合，最终得到相位更新的三维衍射数据；
[0052]重复步骤二及步骤三，直到重建结果达到稳定，不再进一步收敛；最终得到高质量的大小为150nm，显露面为{552}的三八面体金单晶纳米颗粒的三维重建结构，如图4所示。
[0053]实施例2:[0054]本实施例选择对具有60个对称操作的高对称性正二十面体小鼠疱疹病毒颗粒实施三维成像，步骤如下:
[0055]I)、样品制备:
[0056]本实施例中，对称性样品选用具有高度空间对称性的灭活正二十面体小鼠疱疹病毒颗粒；该病毒样品外形对称性属于532晶体学点群，包含6个五次对称轴，10个三次对称轴，15个二次对称轴；
[0057]将小鼠疱疹病毒颗粒用紫外线灭活，利用3%的戊二醛溶液固定，利用离心机选用3000转/分进行离心，筛选出粒径均匀的病毒颗粒；利用甲醇溶液将病毒颗粒溶液稀释至约10000个/ μ L，利用涡旋震荡器将已稀释样品进行震荡处理5分钟，将病毒颗粒进行充分的分散；用移液器吸取3 μ L滴至厚度为lOOnm，尺寸为2mmX 2mm的Si4N3薄膜上，使病毒颗粒均匀分布于薄膜之上，浓度约为0.01个/ μ m2 ;
[0058]2)、用相干X射线衍射显微镜装置，使用X射线自由电子激光单脉冲照射制备的样品，直接获取样品在傅里叶空间中的二维相干X射线衍射数据:
[0059]所述相干X射线衍射成像设备与实施例1中相同，其中CXD与样品台之间的距离选择1800mm，X射线能量选择5.5KeV，成像装置其他参数与实施例1相同；数据获取步骤同实施例1中步骤2)所述方法相同；
[0060]3)、数据筛选，确定单颗粒样品的正入射二维衍射数据:
[0061 ] 数据筛选过程中，选取衍射数据中心100像素X 100像素的区域，阈值设置为最高强度的80%，其他设置与实施例1中步骤3)所述方法及参数相同；
[0062]4)、二维衍射数据处理:
[0063]数据处理过程与实施例1中步骤4)相同，其中在本实施例中，将衍射数据的15像素X 15像素叠加为一个像素点；
[0064]5)病毒颗粒的空间定向:
[0065]病毒颗粒的空间定向方法与实施例1中步骤5)所述的晶体定向方法相同；
[0066]6)、三维衍射数据获取:
[0067]由于病毒是正二十面体，属于532点群，共有60个对称操作，在直角坐标系中，XYZ轴均通过正二十面体的二次对称轴，中心坐标(X, y, z)即病毒颗粒的中心，其他获取三维衍射数据的方法与实施例1步骤6)相同；
[0068]7)、三维重建:
[0069]病毒颗粒三维重建过程与实施例1中步骤7)所述的三维重建过程相同。
【权利要求】
1.一种以X射线单次测量实现对称性微纳米样品三维成像的方法，步骤是: 1)将具有对称外形的纳米晶体或病毒样品，利用超声或震荡方式分散处理I~10分钟，然后制备于厚度为20~200nm的Si3N4薄膜上，并使膜表面上的样品密度不高于0.1个/ μ m2，即制得单分散样品； 2)利用相干X射线衍射显微镜装置，使用X射线自由电子激光单脉冲照射制备的样品，直接获取样品在傅里叶空间中的二维相干X射线衍射数据；其中所述显微镜装置内部真空度不低于10_6ton.，沿光路方向依次排列设置有脉冲宽度为6~30fs的X射线自由电子激光光源，响应时间不低于0.03s的X射线快门，狭缝尺寸为0.5~20 μ m的第一组X射线狭缝，狭缝尺寸为I~40 μ m的第二组X射线狭缝，XY方向移动范围为20± Imm且移动精度为0.3 μ m的样品台和置于样品台后20~8000mm且单个像素尺寸为50 μ mX50 μ m的CXD探测器； 3)选择步骤2)获取的衍射数据中心区域100像素X100像素~500像素X500像素的部分，计算该区域的平均衍射强度，以最高强度的50%~80%为强度阈值，凡高于该阈值的衍射数据即可确定为单颗粒样品的正入射二维衍射数据； 4)针对选出的单颗粒样品的正入射二维衍射数据，先扣除衍射数据的背景及CCD暗噪音，去除衍射数据的非连续线和非连续点，然后将衍射数据相邻的3像素X3像素~25像素X25像素合并成一个像素，并对衍射数据做中心对称操作，即得到完整的衍射图； 5)在步骤4)获得的衍射图上确定一条过其中心的线，通过每间隔0.1~2度做中心旋转方式设定另一条过中心的线，分别计算每两条线的强度差，依据强度差小于5-10%的强度阈值来确定自身等价线，同时记录等价线对应出现的角度及自身等价线的数量，用于确定所述样品的空间取向； 6)根据步骤5)确定的样品空间取向和该样品的空间对称性，在直角坐标系中对所述样品二维衍射数据进行对称性样品所`属晶体学点群对称性的旋转和中心对称处理，获取所述样品的三维衍射数据，其中直角坐标系中与衍射数据相对应的无数值格点位置的插值选用线性插值的方法； 7)利用oversamplingsmoothness重建算法对步骤6)获取的三维衍射数据进行相位恢复和三维重建，即对三维衍射数据进行迭代计算；首次迭代过程中，三维衍射数据的初始相位信息选用随机相位信息，之后每次迭代过程中，三维衍射数据的相位信息选用前一次迭代计算所得到的相位，其强度信息选用通过步骤6)所获取的三维衍射数据；迭代过程中在实空间设定与样品尺寸相同的正方体约束条件，约束条件内的负电子密度及约束条件外的电子密度通过乘以系数0.05~0.3逐渐消去；选用渐变三维高斯低通滤波器对三维衍射数据进行梯度降噪处理，其高频通过率阈值区间为0.1~0.8 ;经过1000-10000次迭代，每经过一次迭代，相位均得到更新，最终得到对称性微纳米样品的三维结构图像。
2.如权利要求1所述以X射线单次测量实现对称性微纳米样品三维成像的方法，其特征在于:所述具有对称外形的纳米晶体是四六面体纳米晶，偏方三八面体纳米晶，三八面体纳米晶或六八面体纳米晶；所述具有对称外形的病毒是二十面体病毒颗粒。
3.如权利要求1所述以X射线单次测量实现对称性微纳米样品三维成像的方法，其特征在于:相干X射线衍射显微镜装置中，所述X射线自由电子激光的脉冲宽度为6~20fs，频率为10-60HZ，第一组X射线狭缝的尺寸为2~10 μ m，第二组X射线狭缝的尺寸为5~，20 μ m,所述CXD探测器置于样品台后500~4000mm处。
4.如权利要求1所述以X射线单次测量实现对称性微纳米样品三维成像的方法，其特征在于:使用X射线自由电子激光单脉冲照射样品，直接获取样品在傅里叶空间中的二维相干X射线衍射数据的方法是:设置X射线自由电子激光脉冲频率为10Hz，X射线快门曝光时间为0.ls，按照5~40 μ m/步的步进速度移动样品台，且每移动一步样品台，X射线快门曝光一次，对制备于Si3N4膜上的单分散样品进行单脉冲照射获取样品在傅里叶空间中的二维相干X射线衍射数据，并实现 CCD探测器对衍射信号的记录和输出。
【文档编号】G01N23/20GK103487452SQ201310479860
【公开日】2014年1月1日 申请日期:2013年10月14日 优先权日:2013年10月14日
【发明者】江怀东, 范家东, 孙智斌, 刘宏 申请人:山东大学