一种制备高纯度人血浆转铁蛋白的方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及生物技术领域，特别涉及一种提取人血浆天然转铁蛋白的方法。
【背景技术】
[0002]转铁蛋白(Transferrin，Tf)是特异结合和转运铁的糖蛋白，已发现在血楽、粘膜、卵巢、睾丸和中枢神经系统中存在着这种蛋白。其中机体绝大部分组织的铁都是血浆转铁蛋白供给的，人血浆转铁蛋白是由两个N-相连的低聚糖链组成的糖蛋白，共含679个氨基酸，分子量为79570。血浆转铁蛋白主要在肝脏合成，转铁蛋白为血清β I球蛋白，它在正常人血清中的含量为240mg/dL左右，相当于总铁结合力250?400 μ g/m L，等电点为pH5.9，每个转铁蛋白分子能结合两个Fe3+(1.4 μ g Fe 3+/m g转铁蛋白)。
[0003]高纯转铁蛋白主要用于转铁蛋白的物理及化学特性、生理功能及其在临床上应用的深入研究、机体铁代谢的研究。作为纯抗原免疫动物制备抗体，作为质量控制的标准品用于血液、肾脏等疾病的免疫化学检验等。
[0004]从Laurell等首先从血浆中分离转铁蛋白开始至血浆转铁蛋白的分离研究已有数十年的历史。几十年来，人们研究了多种分离转铁蛋白的方法，其中包括层析法从人血浆中直接分离转铁蛋白、硫酸铵盐析和层析纯化、利凡诺沉淀和层析纯化以及由Cohn氏组分IV-4和组分IV-7分离等。这些方法中有些步骤繁琐不适于大批量制备，有些方法则因目前血楽蛋白质的分离改用低温乙醇法(如Kistle和Nstshmann)法已不适用。
【发明内容】
[0005]本发明针对转铁蛋白的制备方法繁琐、纯度低的技术问题，提供一种制备高纯度人血浆转铁蛋白的方法。
[0006]为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案是:
[0007]—种制备高纯度人血浆转铁蛋白的方法，包括以下步骤:硫酸铵盐析粗制转铁蛋白；将粗制的转铁蛋白保温处理后离心去除杂蛋白；层析纯化进一步去除杂蛋白。
[0008]进一步地，所述的保温处理方法为60°C保温2小时。
[0009]进一步地，所述硫酸铵盐析粗制转铁蛋白的方法为:加入过量的铁盐饱和转铁蛋白，然后加入低浓度硫酸铵来沉淀人血浆中的杂蛋白，获得含有转铁蛋白的血浆，接着加入高浓度硫酸铵来沉淀血浆中的转铁蛋白，获得粗制的转铁蛋白。
[0010]进一步地，所述沉淀杂蛋白的低浓度硫酸钱饱和度为30-40%，所述沉淀转铁蛋白的高浓度硫酸铵饱和度为80-95%。
[0011]进一步地，所述层析纯化采用弱碱型阴离子交换色谱。
[0012]进一步地，所述弱碱型阴离子交换色谱的电荷基团是二乙基氨基乙基，基质是纤维素、葡聚糖或琼脂糖。
[0013]本发明提供的一种制备高纯度人血浆转铁蛋白的方法，采用硫酸铵沉淀，60°C保温变性和阴离子交换柱层析的步骤来分离人血浆转铁蛋白，可以使转铁蛋白的纯度高于普通的硫酸铵沉淀和阴离子交换柱层析联用方法，由于在阴离子交换柱层析时上样的样品纯度更高，使阴离子交换柱需要除去的杂蛋白更少，由此过程制备出的转铁蛋白的纯度更高。
【附图说明】
[0014]图1本发明实施例提供的纯化铁饱和转铁蛋白的HPLC图。
【具体实施方式】
[0015]实施例1
[0016]本发明实施例提供的一种制备高纯度人血浆转铁蛋白的方法，具体步骤如下:
[0017](一 )制备转铁蛋白粗制品
[0018]I)新鲜全血中加入抗凝剂如柠檬酸钠等，离心得到血清。
[0019]2)取新鲜人血清40mL，与1mL 0.lmol/L NaHC(V§合，在搅拌下加入ImL0.lmol/L NTA-Fe3+ (0.2moL/L NTA与0.2moL/L FeCl3等体积混合，用前新鲜配制)，静置过夜，使血清中的转铁蛋白被铁(Fe3+)充分饱和。
[0020]3)加固体硫酸铵使饱和度达40%，在4°C静置过液，沉淀杂蛋白，离心得上清液。
[0021]4)上清液加固体硫酸铵使饱和度达85%，在4°C静置过夜，沉淀转铁蛋白，离心。
[0022]5)取沉淀溶于小体积20mmol/L Tris-HCl缓冲液(pH7.8)，并用蒸馏水透析除去硫酸铵，再用20mmol/L Tris-HCl缓冲液(pH7.8)透析，去除血清中白蛋白、免疫球蛋白A、免疫球蛋白G等杂蛋白，得到转铁蛋白粗品。
[0023](二)制备纯度较高的转铁蛋白
[0024]将铁饱和的转铁蛋白粗制品在60°C温育2小时，目的是变性一些杂蛋白，然后进一步离心去除杂蛋白，得到纯度较高的转铁蛋白。
[0025](二)制备转铁蛋白纯品
[0026]将上步所得纯度较高的转铁蛋白通过阴离子交换柱层析来除去剩余的杂蛋白。
[0027]具体方法为:
[0028]I) DEAE纤维素层析柱(2.5cmX 32cm)预先用 20mmol/L Tris-HCl 缓冲液(pH 7.8)平衡。
[0029]2)将上述样品溶液上柱，柱平衡后先用适当体积平衡用缓冲液洗脱，然后分别用0.06mol/L NaCl、20mmol/L Tris-HCl(pH7.8)和 0.12mol/L NaCl、20mmol/L Tris-HCl(pH7.8)缓冲液洗脱，收集第一轮洗脱峰，被Fe3+饱和的转铁蛋白呈橙红色，收集橙红色的洗脱峰，即为高纯度的转铁蛋白。
[0030]3)脱铁转铁蛋白的制备:经DEAE纤维素层析得到的转铁蛋白溶液，用0.05mol/L EDTA-乙酸盐缓冲液(PH 5.2)透析，脱铁60h(4°C );超滤脱盐后冻干得白色片状结晶；冷冻干燥，得到转铁蛋白的纯品。
[0031]对比实施例1
[0032](一 )制备转铁蛋白粗制品
[0033]I)新鲜全血中加入抗凝剂如柠檬酸钠等，离心得到血清。
[0034]2)取新鲜人血清40mL，与1mL 0.lmol/L NaHCO3混合，在搅拌下加入ImL0.lmol/L NTA-Fe3+ (0.2moL/L NTA与0.2moL/L FeCl3等体积混合，用前新鲜配制)，静置过夜，使血清中的转铁蛋白被铁(Fe3+)充分饱和。
[0035]3)加固体硫酸铵使饱和度达40%，沉淀杂蛋白，在4°C静置过液，离心得上清液。
[0036]4)上清液加固体硫酸铵使饱和度达85%，沉淀转铁蛋白，在4°C静置过夜，离心。
[0037]5)取沉淀溶于小体积20mmol/L Tris-HCl缓冲液(pH7.8)，并用蒸馏水透析除去硫酸铵，再用20mmol/L Tris-HCl缓冲液(pH7.8)透析，去除血清中白蛋白、免疫球蛋白A、免疫球蛋白G等杂蛋白，得到转铁蛋白粗品。
[0038](二)制备转铁蛋白纯品
[0039]将上步所得纯度较高的转铁蛋白通过阴离子交换柱层析来除去剩余的杂蛋白。
[0040]具体方法为:
[0041]I) DEAE纤维素层析柱(2.5cmX 32cm)预先用 20mmol/L Tris-HCl 缓冲液(pH 7.8)平衡。
[0042]2)将上述样品溶液上柱，柱平衡后先用适当体积平衡用缓冲液洗脱，然后分别用0.06mol/L NaCl、20mmol/L Tris-HCl(pH7.8)和 0.12mol/L NaCl、20mmol/L Tris-HCl(pH7.8)缓冲液洗脱，收集第一轮洗脱峰，被Fe3+饱和的转铁蛋白呈橙红色，收集橙红色的洗脱峰，即为高纯度的转铁蛋白。
[0043]3)脱铁转铁蛋白的制备:经DEAE纤维素层析得到的转铁蛋白溶液，用0.05mol/L EDTA-乙酸盐缓冲液(PH 5.2)透析，脱铁60h(4°C );超滤脱盐后冻干得白色片状结晶；冷冻干燥，得到转铁蛋白的纯品。
[0044]实验结果
[0045]采用高效液相色谱法测定实施例1和对比实施例1的蛋白纯度。
[0046]HPLC分析采用反相蛋白分析Symmetry 300 TM C4柱来自于Waters (5 μ m，300埃，250mmX4.6mm)采用岛津的LC-10AT栗和一个SPD-10A紫外可见探测器。用于蛋白分析的溶剂包括溶剂A (水含0.05%三氟乙酸)和溶剂B(乙腈含0.05%三氟乙酸)，流动相为25分钟内的30 %溶剂B到50 %溶剂B的线性梯度。流速为1.0mL/min，水流在280nm处检测，采用Sigma购买的人血浆转铁蛋白作为标准控制。在保证待测样品中所有组份均出峰的情况下，用目标蛋白的峰面积除以所有峰的峰面积即可的目标蛋白的纯度。实施例1的转铁蛋白HPLC见图1，测得纯度为98%，纯度较高；而采用对比实施例1的方法制备的转铁蛋白的纯度为95%。
[0047]最后所应说明的是，以上【具体实施方式】仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照实例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。
【主权项】
1.一种制备高纯度人血浆转铁蛋白的方法，其特征在于:包括以下步骤:硫酸铵盐析粗制转铁蛋白；将粗制的转铁蛋白保温处理后离心去除杂蛋白；层析纯化进一步去除杂蛋白。2.如权利要求1所述的方法，其特征在于:所述的保温处理方法为60°C保温2小时。3.如权利要求1所述的方法，其特征在于:所述硫酸铵盐析粗制转铁蛋白的方法为:加入过量的铁盐饱和转铁蛋白，然后加入低浓度硫酸铵来沉淀人血浆中的杂蛋白，获得含有转铁蛋白的血浆，接着加入高浓度硫酸铵来沉淀血浆中的转铁蛋白，获得粗制的转铁蛋白。4.如权利要求3所述的方法，其特征在于:所述沉淀杂蛋白的低浓度硫酸铵饱和度为30-40 %，所述沉淀转铁蛋白的高浓度硫酸铵饱和度为80-95 %。5.如权利要求1所述的方法，其特征在于:所述层析纯化采用弱碱型阴离子交换色谱。6.如权利要求5所述的方法，其特征在于:所述弱碱型阴离子交换色谱的电荷基团是二乙基氨基乙基，基质是纤维素、葡聚糖或琼脂糖。
【专利摘要】本发明公开了一种制备高纯度人血浆转铁蛋白的方法，包括以下步骤：硫酸铵盐析粗制转铁蛋白；将粗制的转铁蛋白保温处理后离心去除杂蛋白；层析纯化进一步去除杂蛋白。本发明制备出的转铁蛋白的方法相对简单、并且纯度高。
【IPC分类】C07K1/18, C07K14/79, C07K1/36, C07K1/30
【公开号】CN105037531
【申请号】CN201510485632
【发明人】沈鹤霄, 华权高, 徐春雷, 郑雪松
【申请人】武汉华美生物工程有限公司
【公开日】2015年11月11日
【申请日】2015年8月10日