专利名称：从血清和血浆中制备dna的改进方法
技术领域：
本发明涉及从血清和血浆中制备DNA的方法，特别是在扩增反应中用作目的DNA的DNA制备方法。
扩增和检测核酸领域的技术进展十分迅速，特别当其涉及对感染性疾病、癌症和遗传疾病提供早期检测的商业诊断试验时。目前已经知道少量核酸的扩增，例如PCR(聚合酶链式反应)已相当成熟的技术(参见美国专利号4683195；4683202；和4965188)。PCR的内在灵敏性，即其扩增非常低浓度的目的DNA的能力，意味着PCR产物低水平的遗留以及样品间的污染可以产生假阳性结果。在所有因素中，遗留和样品污染是处理过程中所需的样品操作次数的指标。因此，具有使样品暴露于周围环境的最少次数的简单程序是非常理想的。
传统上，已经就由全血得到的外周血白细胞(WBC)中经PCR鉴定了人巨细胞病毒(HCMV)感染引起的病毒血症，并鉴定了其它病毒和细菌。在从WBC中提取HCMV DNA之前，通常需要从全血中分离WBC。这种分离程序包括红细胞在葡聚糖溶液中的沉降(Rasmussen等，传染病杂志.171177-82，1995)，用氯化铵溶液差别溶解(美国专利号5702884，Ekeze等)，或者应用商业提供的方法(例如，来自Becton-Dickinson的CPT-VacutainerTM试管)。这些方法通常包括除去扩增的潜在抑制物的清洗步骤；或者，分离WBC以便除去这些抑制物，所述抑制物通常以高浓度存在于血浆或血清中。
分离出WBC后，溶解并提取DNA。这包括以下程序，例如煮沸、超声、或WBC的冷冻干燥，或者应用蛋白溶解酶和/或表面活性剂溶解细胞，然后提取DNA。提取DNA还可以应用碱溶步骤(美国专利号5639599)。通常进行更严格的提取/纯化步骤以便进一步确保纯化到的DNA不含潜在抑制物，这些步骤包括，例如，应用玻璃珠(Gene Clean II试剂盒，Bio 101，Inc.)、酚-氯仿提取程序、聚合物捕获(美国专利号5582988)，旋转柱吸附(Qiagen QLAamp试剂盒)，以及其它商业提供的DNA分离试剂盒(Puregene，Gentra SystemsInc.)。
值得注意的是，用于从WBC制备物中清洗掉或除去潜在抑制物的分离和溶解WBC的程序不能被用于血浆和血清。由于大量内源性生化物质和服用药物、药物的代谢产物等在血清和血浆中保留并严重累积，因此现有技术需要一种适用于血浆和血清的快速和强效的方法，该方法将除去潜在抑制物或使该抑制物失效。
感染个体中的胞外HCMV核酸存在于血浆和血清中。选择血浆和血清作为PCR检测HCMV核酸的样品正逐步被接受。通常，目的DNA不以游离DNA的形式存在，而作为与DNA、RNA和蛋白质的复合联合体的形式存在。必须从复合物中提取DNA，然后变性，以便使其适用于扩增反应。通常对血清和血浆样品进行加热、表面活性剂处理、和蛋白酶处理。常使用另外一些精确的方案提取目的DNA，例如前面描述WBC时提到的那些(Spector等，临床微生物学杂志，302359-65，1992；Nolte等，临床微生物学杂志，331263-66，1995；Wolf等，移植，56330-4，1993；Patel等，临床微生物学杂志，321431-4，1994)。碱处理也曾被使用。然而，碱处理通常需要高NaOH浓度，随后需要中和步骤(Hansen等，传染病杂志1701271-4，1994)。
因此，现有技术需要一种快速有效地从血清和血浆中提取DNA的并与PCR扩增方法相容的方法。
本发明提供了一种从血清或血浆样品中提取DNA的方法。该方法包括(i)将血清或血浆与碱接触，以制备碱化的血清或血浆；(ii)将碱化的血清或血浆加热至约100到110EC之间，保持约5到20分钟；(iii)离心加热的碱化血清或血浆；和(iv)提取含DNA的上清液。
在一个优选的方面，在离心加热的碱化血清或血浆之前，在步骤(iii)离心之前，将由步骤(ii)制备的加热的碱化血清或血浆放冷，或冷却至室温，即25EC。
另一方面，本发明提供了一种检测在血清或血浆中可能存在含DNA的微生物，例如人巨细胞病毒(HCMV)的方法。该方法包括(i)将血清或血浆与碱接触，以制备碱化的血清或血浆；(ii)将碱化的血清或血浆加热至约100到110EC之间，保持约5到20分钟；(iii)离心加热的碱化血清或血浆；(iv)提取含DNA的上清液；(v)用识别微生物DNA中的序列的寡核苷酸引物扩增上清液中的DNA以形成微生物特异性的扩增引物；和(vi)检测扩增产物，其中特异于微生物的扩增产物的检测表明血清或血浆中存在微生物。
在一个优选的方面中，在步骤(ii)之后，步骤(iii)的离心之前，使加热的碱化血清或血浆放冷或冷至室温，即约25EC。
本发明提供了一种从血清和血浆样品中简便、快速、高效地提取DNA的方法，该方法使得到DNA制备物不需进一步操作即可适用于随后的检测分析。
该方法包括以下步骤(i)将血清或血浆与碱接触，以制备碱化的血清或血浆；(ii)将碱化的血清或血浆加热至约100到110EC之间，保持约5到20分钟；(iii)离心加热的碱化血清或血浆；和(iv)提取含DNA的上清液。
优选在加热之后，离心之前，使加热的碱化血清或血浆冷却或冷至室温，即约25EC。冷却可以是消极的，即仅用室内空气平衡，也可以是积极的，即可以离心加热的碱化血清或血浆、或将加热的碱化血清或血浆置于冰上、或置于水浴中，直到加热的碱化血清或血浆的温度达到室温。
在本发明的实践中，合适的碱包括但不限于氢氧化钠、氢氧化钾、氨水、或上述种类的混合物。优选使用氢氧化钠。步骤(i)中制备的混合物中碱的终浓度约为10-90mM范围内，最优选约为15-50mM范围内。特别优选的碱浓度约为20mM。一个优选方案包括1体积的血清或血浆与约4体积的约25mM的碱水溶液制成混合物。
将加热碱化的血清或血浆加热到的温度优选约105EC，时间优选约5分钟。离心步骤优选在环境温度下约16,000Xg下离心约2分钟。
可以直接将从离心混合物中提取到的上清液加入PCR扩增混合物中。然而，可以在将上清液加到PCR混合物之前，进一步处理或加入需要的试剂以调整上清液。本发明的碱处理用于灭活PCR抑制物并使蛋白质变性，特别是导致目的DNA降解至不能被扩增的核酸酶。碱处理还用于使DNA变性，使它更易于与扩增引物杂交，从而进行PCR扩增。另外，本发明的简便性极大地降低了样品间污染以及PCR产物遗留的可能性。本发明还避免了对大量花费以及核酸常规分离纯化中应用的通常不稳定的材料的需要。
本发明可用于制备诊断分析的DNA样品，具体地说诊断分析是检测DNA病毒例如巨细胞病毒、单纯性疱疹病毒、Epstein-Barr病毒、乙肝病毒和一些血液细菌的分析。可以使用DNA制品的检测方法包括但不限于任何涉及杂交的方法，包括例如聚合酶链式反应、连接酶链式反应等。因此，本发明包括检测含DNA微生物的检测方法，该方法包括碱化来自受试者的血清或血浆、将碱化的血清或血浆加热到约100-110EC之间保持约5-20分钟、离心以便制备含DNA的上清液，收集上清液、用特异于含DNA微生物的DNA的引物扩增上清液中的DNA，从而得到特异于该微生物的扩增产物，然后检测扩增产物，其中它们的存在表明受试者血液或血清中存在该微生物。
下列实施例说明但不限制本发明。方法1.血清和血浆样品将全血样品收集到含乙烯基二氨基四乙酸(EDTA)或其他抗凝剂(例如肝素和草酸盐)的Vacutainer TM试管中，用于收集血浆，或者收集不加抗凝剂的全血样品用于收集血清。
2.样品的制备将20μl血清或血浆加入装有80μl包含0.334μg/μl小牛胸腺DNA和每μl内部阳性对照(IPC)质粒目的DNA的1.67双链拷贝的25mM NaOH溶液的螺旋盖微量离心管中。混合液经旋涡振荡，于105EC加热5分钟。使样品平衡到室温，室温下16,000Xg离心2分钟。将25μl上清液加入75μl PCR反应混合物(组成下述)中进行扩增。
3.聚合物捕获-对照按照美国专利号5582988实施例3中描述的方法应用聚合物捕获法提取DNA，差别在于本试验应用20μl的血清或血浆。使DNA-聚合物复合物沉淀，弃去上清液(预期含有PCR的潜在抑制物)。然后用100μl 20mM NaOH溶液从沉淀中洗脱DNA，然后在105EC加热5分钟，随后离心2分钟。将上清液(25μl)加入75μl的PCR反应混合物，进行扩增。聚合物捕获法作为与本发明简便的DNA提取法进行比较的对照。
4.PCR扩增和检测PCR反应混合物pH为8.0，含有160U/ml重组Taq聚合酶，5.28μg/ml TP4-9.2(过量5倍)和53.37μg/ml TPl-12.2抗Taq抗体，18mM Tris缓冲液，54mM氯化钾，IPC引物(IPC-F1(正向)生物素-5’-CGCCAGCGTGGACCATCAAGTAGTAA-3’<SEQ ID NO1>和IPC-R1(反向)5’-CACGATCCTGGAGCAGACACTGAAGA-3’<SEQ ID NO2>)各0.2μM，CMV特异性分析引物(LB42M(正向)序列为Biotin-5’-TGCACTGCCAGGTGCTICGGCTCAT-3’<SEQ ID NO.3>和引物LB41(反向)5’-CACCACGCAGCGGCCCTTGATGTIT-3’<SEQ ID NO.4>)各0.4μM，1.2mM所有脱氧核苷酸三磷酸(dNTP)，4mM氯化镁，9.5％甘油，和防腐剂。典型地，需将Taq聚合酶和抗Taq抗体在室温下预保温10分钟，将MgCl2作为单独溶液在加样品之前加入。CMV特异性分析引物设计为与编码患者样品中CMV晚期基因的pp65基质蛋白的DNA互补。将IPC目的序列和CMV pp65基质蛋白目的序列都克隆到Bluescript质粒(Stratagene，La Jolla，CA)上作为测试对照。这样可以用光谱分析进行准确的定量分析，并符合Poisson’s分布。使用作为内部阳性对照的目的DNA序列为5’-CGCCAGCGTGGACCATCAAGTAGTAATGAACGCACGGACGAGGACATCATAGAGATIACACCTITATCCACAGTTCTCGGTCTAACGCAGCAGTCAGTGTATCAGCACCAGCATCCGTAGTGAGTCTTCAGTGTCTGCTCCAGGATCGTG-3’<SEQ ID NO.5>
将25μl处理后的样品加入75μl PCR反应混合物。加完并混合后，将反应混合物倒进塑料袋状PCR容器系统的扩增腔(Johnson & Johnson ClinicalDiagnostics，Inc.，美国专利号5089233；5229297；和5380489)。用PCR扩增和检测处理装置(Johnson & Johnson Clinical Diagnostics，Inc.，美国专利号5567617)进行扩增和检测。96EC初始预热3分钟后，使样品在96EC(5秒)变性步骤和70EC(40秒)退火步骤之间交替，进行40次循环扩增。在103EC最后加热5分钟后，将扩增产物导入袋内含对照和测试特异性探针(与捕捉玻珠相连)的检测室(表1)。
表1
INC-26.7a作为内部阴性对照，在操作适当的PCR袋内期望不给出信号。
然后目测玻珠上产生的颜色，并与颜色记录卡比较，该颜色记录卡具有10种蓝色逐步增加的渐变颜色，相应的编号为0到10(0＝无信号，10＝最高阳性信号)。2以上的目测记录表明捕捉玻珠上的阳性试验。另外，记录PCR处理装置测量得到的反射比密度(Dr)。Dr读数大于0.13表明结果为阳性。实施例1应用本发明的方法从血浆中提取DNA与聚合物捕获法比较进行下述试验以将本发明的提取法和聚合物捕获法进行比较。
按照前面所述的本发明方法和聚合物捕获法，从来自65位患者的血浆中制备样品。在聚合物捕获法中使用了20μl和50μl样品。这些样品在最初评价中，对通过聚合物捕获方案制备的50μl样品评价时均得到“未检测到”的结果。当内部阳性对照捕捉玻珠给出假阴性结果时出现“未检测到”的结果。导入样品的IPC对照质粒为每个终反应混合物中10个拷贝。制备的所有样品与PCR反应混合物混合，进行如上述的扩增和检测。
聚合物捕获法得到“未检测到”的几率与本发明处理血浆样品的方法得到“未检测到”的几率相对照，结果在下表2中列出。
表2
*IPC阴性结果的数目/操作的样品总数50μl聚合物捕获方法表明“未检测到”的几率为21％，而20μl聚合物捕获方案和20μl本发明方法的失败率为0％。对于上述两种聚合物捕获方法，显然某些样品的信号偏低，内部阳性对照接近阴性。
因此，本发明的方法显著优于50μl聚合物捕获方法，在IPC捕捉玻珠上出现假阴性结果方面，本发明的方法表现出比20μl聚合物捕获方法进步。用50μl聚合物捕获方法制备的样品显然含有PCR抑制物或者表现其它一些与聚合物捕获有关的现象。
另外，有这样一个使用20μl聚合物捕获方法的实例，其中从CMV阴性患者获得的样品得到CMV(LBSA-11)捕捉玻珠上的假阳性结果。而相应的50μl聚合物捕获方法的结果为阴性(如果为真正的阳性，患者样品中将出现多于2.5倍的CMV目标DNA)，该结果例证了多步骤操作程序的复杂性，例如产物遗留。实施例2用本发明的方法从血清中提取DNA与聚合物捕获法比较从来自100位CMV IgG-阳性，IgM-阴性的OB/GYN患者的血清样品提取DNA，这些患者由Houston TX的Texas儿童医院提供，在聚合物捕获程序和本发明的方法中应用20μl样品(参见上述实施例1)。在制备样品之前，将CMV对照质粒DNA加到各样品中，以制备在PCR反应混合物中终单链拷贝数为20的CMV质粒目的DNA。同时也将IPC对照质粒加入样品，使每PCR反应混合物终水平为10拷贝。制备的所有样品如上述与PCR反应混合物混合。如上述在PCR袋中进行双次扩增和检测。
聚合物捕获法与本发明应用血清的方法相比，假阴性结果的几率在下表3中列出。
表3
*IPC阴性结果数/操作的样品总数样品制备程序均没有在IPC捕捉玻珠上给出阴性结果。然而，使用聚合物捕获法时，将CMV质粒目的物加入样品在CMV玻珠上得到5％的假阴性几率，表明对PCR的潜在抑制作用。相反，应用本发明的方法无假阴性CMV玻珠结果。实施例3应用本发明的方法从CMV患者人群得到的血浆提取DNA与GeneClean II样品比较进行下列试验以检测本发明方法在从患者样品提取DNA中的效能。
用下面两种方法提取血浆样品(i)用Gene Clean II法(Bio 101，Inc.)，特征在于利用非常灵敏的P32液体杂交CMV PCR分析和直接凝胶CMVPCR分析；(ii)用本发明的方法，分析过程如上面实施例1的描述。导入各样品的IPC对照质粒为每终反应混合物25双链拷贝。所有样品与PCR反应混合物混合，随后在PCR袋中如上述进行双次扩增和检测。
CMV捕捉玻珠上的结果列于下表4中。
表4本发明方法与GeneClean II法制备血浆样品的比较GeneClean+ -
本发明方法+-所有TCG血浆阳性样品均认为是非常低的阳性样品，因为它们仅在液体杂交分析中表现阳性，而在直接凝胶分析中表现阴性，这表明样品中CMV拷贝水平非常低。
两种样品制备方法具有80％的一致性。应用本发明的方法，通过GeneClean法，12个阳性样品中10个得到阳性结果，两个给出阴性结果。对样品制备进行重复测试后，起初的两个假阴性样品中一个变成阳性。对于GeneClean阴性血浆样品，也遇到类似的结果。对于13个阴性样品，这两种样品制备方法对于10个样品给出一致的结果。
另外，还有三个本发明方法显示为CMV阳性样品的实例。重复测试样品制备后，这三个样品中的两个再次表现CMV阳性结果。由于PCR分析的固有灵敏性，分析中常观察到非常低的目的样品给出矛盾的结果。这预示可能符合Poisson取样分布。实施例4在血浆中加入潜在干扰物质下列试验用于检测本发明方法排除血浆中潜在干扰物质的能力。
处理常规血浆样品组以调节pH，加入血样收集添加剂和其它公知的或可能干扰样品制备扩增或检测的物质。将化合物以估计血清峰水平三倍量加入样品(表5)。
如前面实施例1的描述用本发明方法和现有技术聚合物捕获法从20μl各样品中提取DNA。IPC和CMV质粒分别为每终PCR反应混合物25和10个双链拷贝。半数样品仅含IPC质粒，以便评价由于样品交叉污染或产物遗留可能引起的假阳性结果(基于CMV探针玻珠上的颜色)。所有样品与PCR反应混合物混合，然后在PCR袋内扩增并检测。对于每种化合物，在四个PCR袋中分析，其中包括0和10 CMV拷贝水平。另外，同时操作含用于制备包括在分析中的化合物的各种溶剂(水、丙酮、酒精)的适当对照。
注解*+表示存在目的物时所有CMV和IPC捕捉玻珠上均出现阳性结果；FP＝假阳性；FN＝假阴性(当CMV水平为10拷贝时，在期望CMV阳性捕捉玻珠上出现CMV阴性结果)；NT＝在期望CMV阴性样品中“未检测到”，IPC捕捉玻珠为阴性(CMV＝Neg)；
在最初测试中，各样品制备方法在CMV捕捉玻珠和IPC捕捉玻珠上均偶尔出现假阴性结果和几次“未检测到”结果，但聚合物捕获法制备的样品更多地观察到上述结果。另外，几个对照给出不期望的阴性结果，表明PCR袋失效所致。
再次测试前面的样品制备方法，聚合物捕获法和本发明方法对所有测试物质均给出阳性结果，除了用聚合物捕获法制备的25％的血样(提取DNA之前将25体积份全血加入75体积份的血浆)。四个仅含IPC目的物(无CMV目的物)的样品中，两个再次在IPC捕捉玻珠上表现“未检测到”结果。另外，四个含IPC和CMV目的DNA的样品中的三个表现IPC捕捉玻珠的抑制，目视记录仅为“1”。对于这四个样品，CMV捕捉玻珠也表现抑制信号(目视颜色记录为“3”和“4”)。还有一个利用聚合物捕获技术得到假阳性结果的实例(在pH改变较小的条件下)，再次表明少数次操作步骤的简单程序有利于防止遗留污染。
这些结果显示，当利用聚合物捕获技术制备样品时，在HCMV分析中25％全血表现抑制。相反，用本发明方法提取DNA不表现PCR扩增和检测的抑制。这一点十分有意义，因为临床试验室中血清和血浆样品常被红细胞污染。另外，与相比较优于聚合物捕获法的本发明方法比较，聚合物捕获技术比本发明方法更繁复，并使样品更大程度地与环境接触。
利用本发明方法提取DNA都不会导致任何试验物质对PCR扩增的抑制或扩增产物检测的抑制。这种简便的方法代表着对较笨拙耗时繁杂的现有技术方法的有意义的改进。
前面提到的所有专利、申请、文章、出版物和试验方法均参考全文插入本文。
根据上述详细描述，本发明的某些改变将对本领域技术人员是显而易见的。这种明显的改变完全落入附加的权利要求界定的范围内。
权利要求
1.从血清或血浆中提取DNA的方法，所述方法包括(i)将清或血浆与碱接触，制备碱化的血清或血浆；(ii)将所述碱化的血清或血浆加热至约100到110EC之间，保持约5到20分钟，制备加热的碱化血清或血浆；(iii)离心所述加热的碱化血清或血浆，制备含DNA的上清液；和(iv)提取所述含DNA的上清液。
2.如权利要求1的方法，其中在所述加热步骤(ii)之后，所述离心步骤(iii)之前，将所述加热的碱化血清或血浆放冷或冷却至约25EC。
3.如权利要求2的方法，其中所述碱为氢氧化钠。
4.如权利要求2的方法，其中所述温度约为105EC。
5.如权利要求2的方法，其中所述时间约为5分钟。
6.如权利要求2的方法，其中所述离心条件为约16000xg离心约2分钟。
7.如权利要求2的方法，其中所述碱化的血清或血浆含有浓度约为15-50mM范围内的碱。
8.检测血清或血浆中含DNA的微生物的方法，所述方法包括(i)将受试者的血清或血浆与碱接触，制备碱化的血清或血浆；(ii)将所述碱化的血清或血浆加热至约100到110EC之间，保持约5到20分钟，以制备加热的碱化或血浆；(iii)离心所述加热的碱化血清或血浆，以制备含DNA的上清液；(iv)提取所述含DNA的上清液；(v)用识别所述含DNA微生物的DNA中的序列的寡核苷酸引物扩增所述上清液中的所述DNA，形成对所述含DNA微生物的特异性的扩增产物；和(vi)检测所述扩增产物，其中所述扩增产物的检测表明在所述血清或血浆中存在所述微生物。
9.如权利要求8的方法，其中在所述接触步骤(ii)之后，所述离心步骤(iii)之前，将所述加热的碱化血清或血浆放冷或冷却至约25EC。
10.如权利要求8的方法，其中所述温度约为105EC。
11.如权利要求8的方法，其中所述微生物是细菌。
12.如权利要求8的方法，其中所述微生物是病毒。
13.如权利要求12的方法，其中所述病毒是人巨细胞病毒。
14.如权利要求8的方法，其中所述碱化的血清或血浆含有浓度约为20mM的碱。
全文摘要
本发明描述了从血清或血浆中提取DNA的方法,方法包括将血清或血浆与碱接触,制备碱化的血清或血浆,将碱化的血清或血浆加热至约100到110EC之间,保持约5到20分钟,离心加热后的碱化血清或血浆,制备含DNA的上清液,将加热的碱化血清或血浆冷却至室温,或冷却至约25EC,最后提取含DNA的上清液。本发明还公开了检测血清或血浆中的含DNA的微生物的方法。
文档编号C12N15/10GK1270962SQ00104698
公开日2000年10月25日 申请日期2000年2月3日 优先权日1999年2月3日
发明者L·博格梅耶, K·L·安吉 申请人:奥索临床诊断有限公司