庆大霉素抗原合成方法及庆大霉素-IgY抗体制备方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及生物医药领域中的特异性IgY的制备和应用，具体涉及庆大霉素抗原 合成方法及庆大霉素-IgY抗体制备方法。
【背景技术】
[0002] 庆大霉素（Gentamicin)是一种氨基糖苷类抗生素，治疗细菌感染、奶牛乳房炎、 子宫内膜炎等有很好的疗效，常用作兽医临床治疗及饲料药物添加剂。不规范用药会引起 畜产品，尤其是泌乳动物的乳汁中有药物残留，对人类的健康构成潜在危害，造成耳毒性和 肾脏毒性。国内外相继规定了其在动物性食品中的最高残留限量。我国规定，庆大霉素在 牛奶中的最尚残留限量为〇. 2mg/L。
[0003] 目前国内外已建立了很多理化方法检测动物性食品中残留的庆大霉素。虽然有些 方法比较灵敏、精确，但存在花费大、时间长、技术要求高等缺点。例如为高效液相色谱法 (HPLC)、超高效液相色谱（UPLC)法等理化手段，这些方法虽然灵敏度较高，但是相应的成 本也较高，对专业技术要求较高，并不适合大量样本的快速检测，而以ELISA为基础建立的 检测方法操作简便、快速、灵敏、不需要专业人员操作，具有良好的发展前景。
[0004] 卵黄抗体（egg yolk antibody，IgY)抗体是通过对禽类（鸡）免疫注射特定抗原， 从而在体内产生IgY，经血液由母体传递到卵黄内，在卵黄中富集，进而通过分离卵黄，获得 的特异性多克隆抗体。相对于从哺乳动物血清中获得抗体，避免了常规的动物采血，减轻了 动物的痛苦，同时通过卵黄获得抗体，产量大，制备简单，每枚蛋中可以提纯50~100mg的 抗体，且母鸡易于饲养，费用低，便于大规模的生产特异性抗体，经济优势明显。
[0005] 与哺乳动物免疫球蛋白G(immunoglobulin G，IgG)相似，IgY的Fab片段包含抗 原结合位点，Fc片段包含的位点有补体激活功能、调理素作用和致敏过敏反应作用等功能。 但是其结构同哺乳动物有些不同，相对于IgG，IgY重链的氨基酸残基数量多于IgG，且重链 恒定区（CH区）数量多于IgG，而轻链小于IgG。IgY理化特性及抗酶解特性等不同于IgG， 使IgY相对于IgG更适合用于治疗制剂。IgY等电点（PI)在5. 7~7. 6之间，在pH4. 0~ 11. 0时IgY稳定，比兔IgG对酸变性更为敏感，当pH值从4降到3时，IgY活性迅速丧失， 而IgG对此只受到微小影响；IgY在低温下储存时性能较稳定，室温下可保持6个月的活 性，4°C储存6~7年活性下降仅5% ;IgY抗胃蛋白酶消化的稳定性较牛IgG差，但抗胰蛋 白酶和糜蛋白酶能力则较强。
[0006] 由于系统发生学距离造成哺乳动物和鸡抗体特异性的差异，相对于哺乳动物IgG， 卵黄抗体应用于检测也具有多方面的优势如：卵黄抗体与风湿因子、人类抗鼠抗体（HAMA) 没有交叉反应，无补体系统活性和异质性凝集素，且不结合蛋白A和蛋白G，可以避免交叉 反应。此外，禽类针对保守性强的蛋白质往往能引发较哺乳动物抗体更强烈的抗体反应，成 为有关抗体研发的重要选择因素。
【发明内容】
[0007] 发明目的：鉴于现有技术的不足，本发明的第一个目的是公开庆大霉素抗原合成 方法。本发明的第二个目的是公开庆大霉素-IgY抗体制备方法。
[0008] 技术方案：庆大霉素抗原合成方法，包括以下步骤：
[0009](1)、取40mg庆大霉素硫酸盐和12mg偶联载体蛋白溶于1. 5mLPBS，在磁力搅拌器 中搅拌1~4h得到反应液；
[0010] (2)、取280mg碳化二亚胺盐酸盐溶于lmL PBS中得到碳化二亚胺盐酸盐溶液，将 碳化二亚胺盐酸盐溶液的pH调至7.5,再将步骤（1)得到的反应液滴加到碳化二亚胺盐酸 盐溶液中，并且将混合液在室温下搅拌lh，然后于5°C放置2天后得到混合液；
[0011] (3)、将步骤（2)得到的混合液用PBS透析3d后，将透析袋中的抗原分装，即得到 庆大霉素抗原。
[0012] 进一步地，步骤（1)中偶联载体蛋白为血蓝蛋白丁二酸酯时，制备的抗原为免疫 抗原。
[0013] 进一步地，步骤（1)中偶联载体蛋白为牛血清白蛋白时，制备的抗原为包被原。
[0014] -种庆大霉素-IgY抗体制备方法，包括以下步骤：
[0015] (1)庆大霉素抗原合成，
[0016] (11)、取40mg庆大霉素和12mg牛血清白蛋白溶于1. 5mL PBS，在磁力搅拌器中搅 拌1~4h得到反应液；
[0017] (12)、取280mg碳化二亚胺盐酸盐溶于lmL PBS中得到碳化二亚胺盐酸盐溶液，将 碳化二亚胺盐酸盐溶液的pH调至7. 5,再将步骤（11)得到的反应液滴加到碳化二亚胺盐酸 盐溶液中，并且将混合液在室温下搅拌lh，然后于5°C放置2天后得到混合液；
[0018] (13)、将步骤（12)得到的混合液用PBS透析3d后，将透析袋中的抗原分装，即得 到庆大霉素抗原；
[0019] ⑵制备含抗体的免疫蛋，
[0020] (21)向30周龄禽类初次注射步骤⑴得到的抗原，免疫剂量为500 y g/只，此后 的18周内，每隔3周进行一次加强免疫注射，免疫剂量为250 y g/只；
[0021] (22)收集步骤（21)中禽类所生产的蛋，并做标记于4°C保存；
[0022] (3)提取庆大霉素-IgY抗体，
[0023] (31)对步骤（22)得到的蛋的表面进行清洗，烘干后分离卵黄与卵清，收集卵黄， 将lml卵黄使用4ml无菌NaCl水溶液稀释得到稀释液，无菌NaCl水溶液的浓度为0. 5~ 0. 9W/V ；
[0024] (32)向稀释液加入3~4ml质量体积比为3. 5 %的PEG-6000,充分搅拌15分钟 后，置于摇床室温下摇晃20~30分钟得到混合液，其中；
[0025] (33)将步骤（32)得到的混合液离心，收集上清，过滤，向滤液中加入1~2ml质量 体积比为6%~9%的PEG-6000，充分搅拌15分钟，置于摇床室温下摇晃20~30分钟得到 混合液；
[0026](34)将步骤（33)得到的混合液离心，弃去上清液，沉淀使用4ml的无菌NaCl水 溶液悬浮，加入3ml份质量体积比为10 %~13 %的PEG-6000,充分搅拌20分钟，置于摇床 室温摇晃20~30分钟，再进行离心，获得沉淀物，其中无菌NaCl水溶液的浓度为0. 5~ 0. 9W/V ；
[0027] (35)将步骤（34)得到的沉淀物使用1. 2ml的NaCl水溶液溶解得到混合液，先将 混合液用透析带进行透析，再使用IX PBS透析过夜，再用0. 5 XPBS透析12~14h，最后用 0. 1XPBS透析6~10h，收集透析袋中庆大霉素-IgY抗体即可，其中：
[0028] NaCl水溶液浓度为0? 5~0? 9W/V ;
[0029] 1 XPBS的pH= 7. 2~7. 5 ;
[0030] 0? 5XPBS的pH= 7. 4;
[0031] 0? 1XPBS的pH= 7. 0。
[0032] 进一步地，步骤（31)中采用0.01~0.05W/V的新洁尔灭清洗清洗步骤（22)得到 的蛋。
[0033] 进一步地，所述禽类为鸡。
[0034] 进一步地，庆大霉素-IgY抗体在-20°C下保存备用。
[0035] 有益效果：本发明公开的庆大霉素抗原合成方法及庆大霉素-IgY抗体制备方法 具有以下有益效果
[0036] 可有效增强抗体--抗庆大霉素IgY在初免20天左右，开始产生抗体，在初免后 90天左右，抗体滴度达到最高，即1 :102400,停止加强免疫后，抗体效价仍能维持一个多 月。
【附图说明】
[0037] 图1为本发明制备的庆大霉素-IgY抗体的紫外分光光谱图；
[0038] 图2为本发明制备的庆大霉素-IgY抗体效价动态监测。
【具体实施方式】：
[0039] 下面对本发明的【具体实施方式】详细说明。
[0040] 具体实施例1
[0041]庆大霉素抗原合成方法，包括以下步骤：
[0042] (1)、取40mg庆大霉素硫酸盐和12mg偶联载体蛋白溶于1. 5mLPBS，在磁力搅拌器 中搅拌lh得到反应液；
[0043] (2)、取280mg碳化二亚胺盐酸盐溶于lmL PBS中得到碳化二亚胺盐酸盐溶液，将 碳化二亚胺盐酸盐溶液的pH调至7.5,再将步骤（1)得到的反应液滴加到碳化二亚胺盐酸 盐溶液中，并且将混合液在室温下搅拌lh，然后于5°C放置2天后得到混合液；
[0044] (3)、将步骤（2)得到的混合液用PBS透析3d后，将透析袋中的抗原分装，即得到 庆大霉素抗原。
[0045] 进一步地，步骤（1)中偶联载体蛋白为血蓝蛋白丁二酸酯时，制备的抗原为免疫 抗原。
[0046] 进一步地，步骤（1)中偶联载体蛋白为牛血清白蛋白时，制备的抗原为包被原。
[0047] -种庆大霉素-IgY抗体制备方法，包括以下步骤：
[0048] (1)庆大