具有γ干扰素的抗原呈递癌症疫苗的制作方法
【专利说明】具有Y干扰素的抗原呈递癌症疫苗
[0001] 本申请为分案申请，原申请的申请日为2012年10月22日，申请号为 201280051821. 7(PCT/US2012/061294)，发明名称为"具有γ干扰素的抗原呈递癌症疫 苗"。
[0002] 相关申请
[0003] 本申请要求享有2011年10月20日提交的美国临时申请No. 61/549681和2012 年2月2日提交的美国临时申请No. 61/594304的全部巴黎公约优先权及其权益，上述两篇 临时申请通过引用并入本文，如同其全部内容在本文中阐述一样。
技术领域
[0004] 本发明涉及治疗黑色素瘤、筛选适合治疗的受试者、物质组合物、方法和试剂盒。
[0005] 发明背景
[0006] 癌症的特征是缺乏对癌症有效的免疫应答。免疫应答的缺乏可由以下事实引起： 例如许多肿瘤抗原是"自身抗原";肿瘤细胞缺乏MHC的表达以及由此产生的肿瘤细胞缺乏 肿瘤抗原的呈递；巨噬细胞与肿瘤的关联，该巨噬细胞表达降低免疫应答的细胞因子；以 及调节性T细胞（Tregs)的免疫抑制活性。对肿瘤的免疫应答的缺乏还可以由以下事实引 起：肿瘤细胞倾向于不表达那些刺激先天性免疫应答的分子，即刺激Toll样受体（TLRs)或 核苷酸结合寡聚化结构域（N0D)样受体的分子。癌症包括实体肿瘤以及诸如白血病和骨髓 发育不良综合征的血液癌症。
[0007] 免疫系统包括细胞免疫、体液免疫、补体反应（complement response)。细胞免疫 包括多种细胞和多种活动的网络，涉及树突细胞、CD8+T细胞（细胞毒性T细胞；细胞毒性淋 巴细胞）和CD4+T细胞（辅助T细胞）。树突细胞（Dendritic cells，DCs)获得多肽抗原， 其中这些抗原可以从DC的外部获得，也可以在DC的内部由感染生物体来生物合成。DC处 理多肽，得到长度约10个氨基酸的肽，并将这些肽传输给MHC I类或MHC II类以形成复合 体，并将复合体运（shuttles)到DC的表面。当携带MHC I类/肽复合体的DC与CD8+T细 胞接触时，结果是CD8+T细胞的活化和增殖。对于MHC II类所起的作用，当携带MHC II类 /肽复合体的DC与CD4+T细胞接触时，其结果是CD4+T细胞的活化和增殖（Munz等（2010) Curr.Opin. Immunol. 22 :89-93 ；Monaco (1995)J. Leukocyte Biol. 57 :543-547 ；Robinson 等（2002) Immunology 105 :252-262)。尽管呈递抗原给T细胞的树突细胞能够"活化"该T 细胞，活化的T细胞可能不能够具有有效的免疫应答。CD8+T细胞的有效的免疫应答通常需 要DC通过一次或多次多个交互来在先刺激（prior stimulation)。这些交互包括⑶4+T细 胞与DC的直接接触（通过⑶4+Τ细胞的⑶40配体与DCs的⑶40受体接触的方式），或者 TLR激动剂与树突细胞的toll样受体（TLRs)中的一个受体的直接接触。
[0008] 体液免疫涉及B细胞和抗体。B细胞被转化成浆细胞，浆细胞表达并分泌抗体。 初始B细胞的区别在于它们不表达标志物（marker) CD27，而抗原特异性B细胞则表达 CD27(Perez_Andres等（2010)Cytometry Part B 78B(Suppl.l)S47_S60)。分泌的抗体随后 可以与驻留在肿瘤细胞表面上的肿瘤抗原结合。结果是受感染的细胞或肿瘤细胞被抗体标 记。随着抗体与受感染的细胞或肿瘤细胞的结合，结合的抗体介导（mediates)杀灭受感染 的细胞或肿瘤细胞，其中杀灭细胞是由NK细胞进行的。尽管并没有以配置T细胞来识别靶 抗原的方式对NK细胞进行配置来识别特定的靶抗原，但是NK细胞与抗体的恒定区域结合 的能力使得NK细胞能够特异性地杀灭抗体所标记的细胞。NK细胞对抗体的识别是由与抗 体的Fc部分结合的（NK细胞的）Fc受体介导的。这种类型的杀灭被称为抗体依赖性细胞 毒作用（ADCC)。NK细胞也可以不依赖ADCC机理来杀灭细胞，在这种情况下这种杀灭需要 在靶细胞中MHC I类的表达损失或缺乏（参见例如Caligiuri(2008)Blood 112 :461-469)。
[0009] 可以使用"迟发型超敏反应"（delayed type hypersensitivity response)技术 来区分主要涉及细胞免疫的免疫应答或主要涉及体液免疫的免疫应答。迟发型超敏反应的 阳性信号表明细胞应答（参见，例如Roychowdhury等（2005)AAPS J.E834-E846)。
[0010] 自噬是一个稳态过程，细胞溶质（cytosolic)成分和细胞器通过该过程被输送到 溶酶体降解。自噬也与细胞内病原体的先天性免疫应答和适应性免疫应答有关，细胞溶质 抗原借助于细胞内病原体而被负载到主要组织相容性复合体（major histocompatibility complex，MHC) II类分子上，用于CD4+T细胞识别。
[0011] 说明
[0012] 本文中使用时，包括所附权利要求书中使用时，除文本另有明确说明外，诸如"一 个"、"一种"（"a"和"an"）和"所述"的词语的单数形式包括其相应的复数指示物。本文 中所引用的所有参考文献通过引用并入本文，并入的程度如同明确且单独地指出各个出版 物、专利、公开的专利申请和序列表以及在所述公开和专利文献中的图片和照片通过引用 并入本文一样。
[0013] 发明概述
[0014] 本发明提供制备树突细胞疫苗的方法，其包括用防止细胞分裂的试剂处理从第一 受试者获得的黑色素瘤细胞，用IFN-γ或IFN-γ模拟物（mimetic)处理黑色素瘤细胞， 选择自噬性和非凋亡性的黑色素瘤细胞，并且将所选择的黑色素瘤细胞与来自相同第一受 试者的自体树突细胞接触。本发明还提供包含通过上述方法所制得的树突细胞疫苗的组合 物。本发明还提供的是刺激对黑色素瘤特异性抗原的免疫应答的方法，其包括向患有黑色 素瘤的受试者施用/给药（administering)上述组合物。
[0015] 疫苗包含来自患有黑色素瘤的给定受试者的哺乳动物树突细胞群落，并且其中受 试者含有黑色素瘤细胞，其中当在体外用IFN-γ或IFN-γ模拟物处理时，受试者所包含的 黑色素瘤细胞包括自噬性和非凋亡性的黑色素瘤细胞，其中树突细胞包含黑色素瘤特异性 肽抗原，其中所述黑色素瘤特异性肽抗原被树突细胞从所述黑色素瘤细胞（或者在所述黑 色素瘤细胞）体外获得，其中树突细胞所包含的超过60%的黑色素瘤特异性肽来自自噬性 和非凋亡性的黑色素瘤细胞，其中树突细胞所包含的小于40%的黑色素瘤特异性肽来自非 自噬性和凋亡性的黑色素瘤细胞，并且其中树突细胞和黑色素瘤细胞来自相同的受试者。 本发明还提供上述树突细胞群落，其中通过粘附到表面来获得自噬性和非凋亡性的黑色素 瘤细胞。
[0016] 本发明公开了一种疫苗，其中在某些情况下，超过80%的黑色素瘤特异性肽来自 自噬性和非凋亡性的黑色素瘤细胞，并且其中小于20%的黑色素瘤特异性肽来自非自噬性 和凋亡性的黑色素瘤细胞。
[0017] 本发明公开了一种疫苗，其中在某些情况下，超过90%的黑色素瘤特异性肽来自 自噬性和非凋亡性的黑色素瘤细胞，并且其中小于10 %的黑色素瘤特异性肽来自非自噬性 和凋亡性的黑色素瘤细胞。
[0018] 本发明公开了一种疫苗，其中在某些情况下，基本上所有的黑色素瘤特异性肽均 来自不能细胞分裂的黑色素瘤细胞。
[0019] 本发明公开了一种疫苗，其中在某些情况下，基本上所有的黑色素瘤特异性肽来 自由于黑色素瘤细胞受到辐照而不能细胞分裂的黑色素瘤细胞。
[0020] 本发明公开了一种疫苗，其中在某些情况下，基本上所有的黑色素瘤特异性肽来 自由于黑色素瘤细胞的染色体被核酸交联剂交联而不能细胞分裂的黑色素瘤细胞。
[0021] 本发明公开了一种疫苗，其中在某些情况下，所有的黑色素瘤特异性肽来自 IFN-γ处理过或IFN-γ模拟物处理过的黑色素瘤细胞。
[0022] 本发明公开了一种疫苗，其中在某些情况下，所有的黑色素瘤特异性肽来自未经 IFN-γ处理过或未经IFN-γ模拟物处理过的黑色素瘤细胞。
[0023] 本发明公开了一种疫苗，其中在某些情况下，存在来自自噬性和非凋亡性的黑色 素瘤细胞的第一数目的黑色素瘤特异性肽，并且其中存在来自非自噬性和凋亡性的黑色素 瘤细胞的第二数目的黑色素瘤特异性肽，并且其中所述第一数目和第二数目二者均指的是 黑色素瘤特异性抗原类的数目，黑色素瘤特异性抗原类是S-100、HMB-45、Mel-2、Melan-A、 Mel-5、MAGE-1、MART-1或酪氨酸酶中的一种，并且其中所述超过60%是从第一数目获得 的，并且其中所述小于40 %是从第二数目获得的。
[0024] 本发明公开了一种疫苗，其中在某些情况下，存在来自自噬性和非凋亡性的黑色 素瘤细胞的第一数目的黑色素瘤特异性肽，并且其中存在来自非自噬性和凋亡性的黑色素 瘤细胞的第二数目的黑色素瘤特异性肽，并且其中所述第一数目和第二数目二者均指的是 黑色素瘤特异性抗原类的数目，黑色素瘤特异性抗原类是S-100、HMB-45、Mel-2、Melan-A、 Mel-5、MAGE-1、MART-1或酪氨酸酶中的两种，并且其中所述超过60%是从第一数目获得 的，并且其中所述小于40 %是从第二数目获得的。
[0025] 本发明公开了一种疫苗，其中在某些情况下，存在来自自噬性和非凋亡性的黑色 素瘤细胞的第一数目的黑色素瘤特异性肽，并且其中存在来自非自噬性和凋亡性的黑色素 瘤细胞的第二数目的黑色素瘤特异性肽，并且其中所述第一数目和第二数目二者均指的是 黑色素瘤特异性抗原类的数目，黑色素瘤特异性抗原类是S-100、HMB-45、Mel-2、Melan-A、 Mel-5、MAGE-1、MART-1或酪氨酸酶中的三种，并且其中所述超过60%是从第一数目获得 的，并且其中所述小于40 %是从第二数目获得的。其他实施方式使用上述抗原中的四种、五 种、六种、七种或八种。本发明还包含完全不同的黑色素瘤特异性抗原的用途。
[0026] 本发明公开了一种疫苗，其中在某些情况下，基本上所有黑色素瘤特异性肽来自 经IFN-γ处理的黑色素瘤细胞。
[0027] 本发明公开了一种疫苗，其中在某些情况下，基本上所有黑色素瘤特异性肽来自 在体外经处理而不能细胞分裂的黑色素瘤细胞。本发明还包括上述疫苗，其中给定受试者 是人类受试者。
[0028] 此外，本发明提供疫苗，其中给定受试者是非人的哺乳动物。
[0029] 本发明公开了刺激对黑色素瘤特异性抗原的免疫应答的方法，其包括向受试者施 用免疫刺激量的上述疫苗。
[0030] 本发明公开了一种方法，其中受刺激的免疫应答包括⑶4+T细胞应答、⑶8 +T细胞 应答和Β细胞应答中的一种或多种。
[0031] 本发明公开了一种方法，其中通过ELISP0T测定、通过细胞内细胞因子染色测定、 通过四聚体测定、或者通过检测抗原特异性抗体的产生来测定CD4+T细胞应答、CD8+T细胞 应答或B细胞应答。
[0032] 本发明公开了一种方法，其中免疫应答包括含有2年总生存率（0S)的生存时间， 并且其中2年总生存率至少为60%。
[0033] 此外，本发明提供了上述方法，其中所述施用包括皮下注射疫苗。
[0034] 本发明公开了一种方法，其中施用包括将每周给予的疫苗注射三个月，然后每月 给予的疫苗注射五个月。
[0035] 本发明公开了制备树突细胞疫苗的方法。
[0036] 本发明公开了制备树突细胞疫苗的方法，该树突细胞疫苗包含来自相同受试者的 黑色素瘤细胞和树突细胞，其中用防止细胞分裂的试剂处理一种或多种（一个或多个）黑 色素瘤细胞，其中用干扰素 -γ (IFN-γ)或IFN-γ模拟物在体外处理所述一种或多种黑色 素瘤细胞，其中选择自噬性和非凋亡性的黑色素瘤细胞，其中丢弃非自噬性和凋亡性的黑 色素瘤细胞，并且其中向一种或多种自体树突细胞提供所述自噬性和非凋亡性的黑色素瘤 细胞，或者其中向一种或多种自体树突细胞提供衍生自所述自噬性和非凋亡性的黑色素瘤 细胞的肽。
[0037] 本发明公开包含至少一种经干扰素（IFN)-y处理的来自第一受试者的黑色素瘤 细胞和至少一种来自相同第一受试者的抗原呈递细胞（APCs)的组合物，其中黑色素瘤细 胞是：自噬性的；非凋亡性的；并且表达MHC II类分子。在另一方面，本发明包括上述组合 物，其中经IFN-γ处理的黑色素瘤细胞负载到APC中；以及上述组合物，其中经IFN-γ处 理的黑色素瘤细胞未负载到APC中。在另一方面，本发明包含上述组合物，其中黑色素瘤细 胞来自患有 I 期（Stage 1)、11 期（Stage II)、111 期（Stage III)或 IV 期（Stage IV)黑 色素瘤的受试者。此外，本发明涉及上述组合物、相关的试剂盒和相关的方法，其中APC包 含至少一种树突细胞。
[0038] 在一个方面，本发明的药物组合物、试剂和相关的方法利用癌症细胞的制剂，该制 剂在IFN-γ处理后为7-AAD阴性并且annexin V阴性。这种群落（population)的非限制 性例子可以是，例如约99% 7-AAD阴性和约99% annexin V阴性、或者至少约95% 7-AAD 阴性和约95% annexin V阴性、或者至少约90% 7-AAD阴性和约90% annexin V阴性。
[0039] 此外，本发明包含上述组合物，其中自噬是通过如下测试证明的，该测试测定微 管相关蛋白轻链3(1X3);以及上述组合物，其中使用7-氨基放线菌素 D(7-AAD)试剂或 annexin(膜联蛋白）试剂中至少一种来证明细胞是非凋亡性的。
[0040] 在方法方面，本发明提供制造如上所述组合物的方法，其包括从第一受试者中去 除至少一种黑色素瘤细胞，从第一受试者中去除至少一种APC，并且允许黑色素瘤细胞与 APC接触；以及刺激对受试者或患者中黑色素瘤的免疫应答的方法，其包含向受试者施用 上述组合物。
[0041] 本发明涉及一种方法，其中来自患者的黑色素瘤细胞是非凋亡性的，是自噬性的， 并且其中黑色素瘤细胞通过表达MHC II类分子来对加入的IFN-γ做出应答；以及上述方 法，其中在负载到抗原呈递细胞上之前，辐照黑色素瘤细胞。
[0042] 本发明涉及治疗黑色素瘤患者中黑色素瘤的方法，其包括确定黑色素瘤细胞对 IFN-γ的促凋亡作用不敏感，并给受试者施用一种或多种如上组合物。
[0043] 在另一方面，本发明提供刺激或增强对黑色素瘤患者中黑色素瘤的免疫应答的方 法，其包括确定黑色素瘤细胞对IFN-γ的促凋亡作用不敏感，并给受试者施用一种或多种 如上所述的组合物。还提供上述方法，其中免疫应答是体液免疫应答、细胞免疫应答和先天 性免疫应答中的一种或多种。
[0044] 在试剂盒方面，本发明提供用于测试对受试者中肿瘤抗原的免疫应答的试剂盒， 其中通过一种或多种上述方