抗cd20抗原的抗体l3h3及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种抗⑶20抗原的抗体L3H3及其应用。
【背景技术】
[0002] 非霍奇金淋巴瘤（NonHodgkin'slymphoma,NHL)是一种生物学特性和组织形态 各异的淋巴系统恶性肿瘤，是威胁人类生命的十大恶性肿瘤之一，淋巴系统恶性肿瘤中约 有85 %来源于B细胞。
[0003] ⑶20分子是一种B细胞分化抗原，它在95%以上的B细胞淋巴瘤中表达，而在造 血干细胞、浆细胞和其他正常组织中不表达。⑶20分子量为33KD，是由279个氨基酸残基 组成的非糖基化蛋白质，起始表达于pre-B细胞阶段，至B细胞终端分化成楽;细胞时结束， 其一直被认为是B淋巴细胞表面特有的标识。CD20分子有4个跨膜区，在第三和第四跨膜 区之间有一个由43个氨基酸残基组成的环区，构成其主要的抗原表位。CD20分子在恶性 B淋巴细胞膜表面表达稳定，与抗体结合后不会从肿瘤细胞膜表面脱落，在血液循环中也无 游离的CD20分子存在，上述特有的表达方式及生物学作用决定了CD20是B细胞淋巴瘤单 克隆抗体治疗时的理想靶抗原。
[0004] 1997,美国食品与药品监督局（FDA)批准了抗CD20的人鼠嵌合抗体利妥昔单抗 (Rituximab，RTX)用于NHL的治疗。1998年，欧盟也批准RTX上市，RTX与CD20分子结合能 引发淋巴瘤细胞溶解的免疫反应，可能的作用机制包括：抗体依赖的细胞毒作用（ADCC)、 补体依赖的细胞毒作用（CDC)、诱导凋亡。RTX虽可增强抗体的生物学效应，但由于其是人 鼠嵌合抗体，故在临床中会产生严重的人抗鼠抗体反应（HAMA)，从而影响其功能的发挥。本 研究计划通过计算机模拟，从抗人抗体库中筛选出构象与嵌合抗体相似，但免疫原性低亲 和力高的人源化抗体，并对该人源化抗体ADCC与CDC效应进行检测。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的是提供一种抗CD20抗原的抗体L3H3及其应用。
[0006] 本发明提供的抗⑶20抗原，命名为L3H3抗体，是一种IgG，由轻链和重链组成；所 述轻链中的轻链可变区中的⑶R1、⑶R2和⑶R3依次为序列表的序列1自N末端第61-79 位氨基酸残基、第89-102位氨基酸残基和第112-123位氨基酸残基；所述重链中的重链可 变区中的CDR1、CDR2和CDR3依次为序列表的序列3自N末端第50-60位氨基酸残基、第 82-97位氨基酸残基和第107-120位氨基酸残基。
[0007] 所述轻链具体可为如下（a)或（b): (a)序列表的序列1自N末端第21-233位氨 基酸残基组成的蛋白质；(b)序列表的序列1所不的蛋白质；
[0008] 所述重链具体可为如下（C)或（d) : (C)序列表的序列3自N末端第20-471位氨 基酸残基组成的蛋白质；（d)序列表的序列3所不的蛋白质。
[0009] 本发明还保护编码所述L3H3抗体的基因，其特征在于：
[0010]编码所述轻链的基因为如下⑴或⑵或（3):
[0011] ⑴序列表的序列2自5'末端第80-718位核苷酸所示的DNA分子；
[0012] (2)序列表的序列2自5'末端第20-721位核苷酸所示的DNA分子；
[0013] (3)序列表的序列2所示的DNA分子；
[0014] 编码所述重链的基因为如下（4)或（5)或（6):
[0015] (4)序列表的序列5自5'末端第58-1413位核苷酸所不的DNA分子；
[0016] (5)序列表的序列5所不的DNA分子；
[0017] (6)序列表的序列4所示的DNA分子。
[0018] 本发明还保护所述L3H3抗体在制备用于杀伤B细胞淋巴瘤细胞的药物中的应用。 所述B细胞淋巴瘤细胞为表达CD20抗原的B细胞淋巴瘤细胞。所述B细胞淋巴瘤细胞具 体可为Daudi细胞。
[0019] 本发明还保护一种用于杀伤B细胞淋巴瘤细胞的药物，其活性成分为所述L3H3抗 体。所述B细胞淋巴瘤细胞为表达CD20抗原的B细胞淋巴瘤细胞。所述B细胞淋巴瘤细 胞具体可为Daudi细胞。
[0020] 本发明还保护所述L3H3抗体在制备用于B细胞淋巴瘤治疗药物中的应用。所述 B细胞淋巴瘤为表达⑶20抗原的B细胞淋巴瘤。
[0021] 本发明对于B细胞淋巴瘤的治疗具有重大应用价值。
【附图说明】
[0022] 图1为实施例2中的洗脱曲线。
[0023] 图2为实施例2中的10%SDS-PAGE图谱。
[0024] 图3为实施例4中的ADCC的结果。
[0025] 图4为实施例4中的⑶C的结果。
【具体实施方式】
[0026] 以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验 方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自 常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平 均值。
[0027]pcDNA-3. 3 载体（线性质粒）：Invitrogen公司，目录号K8300-01。pOptiVEC载 体（线性质粒）：Invitrogen公司，目录号 12744-017。CH0-DG44 细胞：Invitrogen公司， 目录号A13737-01。OptiPRO?SFM培养液：Invitrogen公司，目录号 12309-050。脂质 体（FreeStyle?MAXReagent):Invitrogen公司，目录号 16447-100。CDDG44Medium: Invitrogen公司，目录号 12610-010。CDOptiCHO?Medium:Invitrogen公司，目录号 12681-011。利妥昔单抗（溶液形式；100mg/10ml，无色透明液体；IgG，其轻链如序列表的 序列6所示，其重链如序列表的序列7所示）：德国RocheDiagnosticsGmbH,产品批号 H0119,查询序列号：10000661731142。
[0028] 利妥昔单抗具有30%左右的鼠源蛋白，长期使用会引起鼠抗人抗体反应而无法使 用。因此，寻求更为有效的抗CD20抗原的抗体用于B淋巴瘤的治疗显得尤为迫切。发明人 基于大量摸索、分析、验证，进行计算机建模和人源化改造，设计了一种抗CD20抗原的抗体 (命名为L3H3抗体）。L3H3抗体为IgG，其轻链（命名为轻链L3)如序列表的序列1所示， 其重链（命名为重链H3)如序列表的序列3所示。
[0029] 序列表的序列1中，自N末端第1-20位氨基酸残基组成前导肽，第21-131位氨基 酸残基组成轻链可变区VL(其中，第61-79位氨基酸残基组成⑶R1、第89-102位氨基酸残 基组成⑶R2、第112-123位氨基酸残基组成⑶R3)，第132-233位氨基酸残基组成轻链恒定 区CL〇
[0030] 序列表的序列3中，自N末端第1-19位氨基酸残基组成前导肽，第20-141位氨基 酸残基组成重链可变区VH(其中，第50-60位氨基酸残基组成⑶R1、第82-97位氨基酸残 基组成⑶R2、第107-120位氨基酸残基组成⑶R3)，第142-239位氨基酸残基组成重链恒定 区CH1，第240-254位氨基酸残基组成铰链区Hinge，第255-365位氨基酸残基组成重链恒 定区CH2,第366-471位氨基酸残基组成重链恒定区CH3。
[0031] 实施例1、构建重组质粒
[0032] 1、将序列表的序列2所示的DNA分子插入pcDNA-3.3载体，得到重组质粒 pcDNA_3. 3_L3〇
[0033] 序列表的序列2所示的DNA分子自5'末端第20-79位核苷酸编码前导肽，第 80-412位核苷酸编码VL，第413-718位核苷酸编码CL，第719-721位核苷酸为终止密码子。
[0034] 2、将序列表的序列4所示的DNA分子插入pOptiVEC载体，得到重组质粒 p0ptiVEC-H3〇
[0035] 序列表的序列4所示的DNA分子自5'末端第14-70位核苷酸编码前导肽，第 71-436位核苷酸编码VH，第437-730位核苷酸编码CH1，第731-1118位核苷酸为内含子，第 1119-1163位核苷酸编码Hinge，第1164-1281位核苷酸为内含子，第1282-1614位核苷酸 编码CH2,第1615-1711位核苷酸为内含子，第1712-2029位核苷酸编码CH3,第2030-2032 位核苷酸为终止密码子，第2033-2231位核苷酸为内含子。即去除内含子后，序列表的序列 4中的编码区如序列表的序列5所示。
[0036] 实施例2、制备L3H3抗体
[0037] 1、取 10μg重组质粒pcDNA-3. 3-L3 和 10μg重组质粒p0ptiVEC-H3,用OptiPRO? SFM培养液定容至500μ1，室温放置5min。
[0038] 2、取20μ1的脂质体，用OptiPRO?SFM培养液定容至500μ1，室温放置5min。
[0039] 3、将步骤1的溶液和步骤2的溶液混勾，室温放置20分钟。
[0040] 4、在带通气滤膜的125ml细胞培养瓶（瓶中装有30ml培养基）中接种CH0-DG44 细胞（约3X106个细胞/瓶），转染前800rpm离心4min，吸弃培养上清，每瓶加入4ml新 鲜CDDG44Medium重悬。
[0041] 5、将步骤3得到的溶液逐滴加入完成步骤4的细胞培养瓶中，混匀，在含8%C02 的摇床中37°C、150rpm振荡培养5天（先培养6-8小时，然后800rpm离心4min，吸弃上清， 重新加入30ml新鲜的⑶OptiCHO?Medium后继续培养），12000rpm离心15min，收集上清 液，调pH至6. 0-7. 0,然后用0. 45μm滤膜过滤，收集滤液。
[0042] 6、取步骤5得到的滤液，采用rProteinASepharose4B亲和层析柱进行纯化。
[0043] rProteinASepharose4B亲和层析柱（法玛西亚公司，XK16柱子）：柱体积为40 毫升，内径为16 _米。
[0044] 结合缓冲液（pH7.0):含0. 15MNaCl的20mM磷酸盐缓冲液。
[0045] 洗脱缓冲液（ρΗ3· 0) :0· 1M柠檬酸缓冲液。
[0046] 流速：l_3ml/min。
[0047] 过程：（1)用400ml结合缓冲液平衡柱子；（2)上样；（3)用400ml结合缓冲液洗涤 柱子；(4)用200ml洗脱缓冲液洗脱目