一种自身免疫抗原阳性血清的制备方法
【专利摘要】本发明涉及一种自身免疫抗原阳性血清的制备方法，包括依次进行的如下步骤：步骤1、用自身免疫抗原对健康动物进行多次免疫，每次免疫之前，对健康动物进行取血测定OD值，当OD值稳定后，免疫结束，进行取血，获得抗血清；步骤2、对步骤1所得的抗血清进行亲和纯化得到IgG抗体；步骤3、将步骤2所得的IgG抗体和人IgG抗体按质量比为1:1~5偶联后，经分离纯化获得IgG-IgG连接物浓溶液，将IgG-IgG连接物浓溶液稀释至浓度为0.5~1μg/ml，即得阳性血清。本发明方法可批量制备各种自身免疫抗原的阳性血清，并且本制备方法简单易行。
【专利说明】一种自身免疫抗原阳性血清的制备方法
【技术领域】
[0001]本发明属于体外诊断【技术领域】，具体涉及一种自身免疫抗原的阳性血清的制备方法。
【背景技术】
[0002]自身免疫性疾病是自身免疫反应达到一定程度而导致的疾病。免疫系统最基本的功能是认识自身和识别异体，达到保护自身和排斥异体的目的。正常人体血清中可存在多种针对自身抗原的抗体，但它们的水平极低，不足以破坏自身成分，可清除衰老退变的自身组织，这就是自身免疫反应。当这种反应过强，导致严重组织损伤，表现出临床症状时，就称为自身免疫病。这类自身免疫疾病的自身免疫抗原包括但不限于以下所列=AMA M2、PO、His、nucl、dsDNA、PCNA、CENP B、J0-1、PM-Scl、Scl-70、SSB、SSA、Sm、nRNP、GBM、MPO、PR3、SAL/LP、GP210、SP100、LC-1、LKM 等。
[0003]常见的自身免疫病有以下几种:系统性红斑狼疮、干燥综合征、混合结缔组织病、硬皮病、多发性肌炎/皮肌炎等。
[0004]例如:系统性红斑狼疮是一种与自身免疫系统密切相关的慢性、多脏器受累的炎症性疾病。该病往往在女性人群中高发。常见的临床表现包括游走性关节疼痛和关节炎、面颊和其它皮肤部位的发疹、胸膜炎和心包炎、肾脏或中枢神经系统的病变以及血液系统中的血细胞减少等。临床对于SLE的诊断需要密切结合临床表现和血清学检测结果。对于处于活动期症状严重的患者临床通常使用皮质类固醇、羟化氯喹和一些免疫抑制剂进行治疗。
[0005]约70-90%的患者为女性(以育龄期女性为主)。SLE在黑人和亚洲人中的发病率要高于白人。该病可以在任何年龄段发病，包括新生儿。由于临床医生对于SLE的诊断越来越重视，因此每年报道的病例数持续上升。在一些国家，SLE的发病率甚至超过类风湿关节炎(RA)。环境因素引起的自身免疫反应，是遗传易感人群发病的一个主要因素。
[0006]由于SLE的临床表现具有多脏器累及的特点，因此临床往往混淆SLE与其它风湿性疾病的诊断。例如:早期具备明显关节症状的SLE患者，可能被误诊为类风湿关节炎。可能与SLE发生误诊的疾病还包括，混合结缔组织病(MCTD)、风湿样多关节炎，多发性肌炎/皮肌炎、结节病和副瘤性综合征等。值得注意的是，一些感染性疾病(例如细菌性心内膜炎和组织胞浆菌病等)也可能误诊为SLE，从而导致不必要的免疫抑制治疗。因此，实验室血清学抗体检测是区分SLE与其它临床疾患的重要依据。
[0007]但是，由于自身免疫抗原的阳性血清比较罕见，临床收集少量可行，大量或者高浓度的血清基本不能收集到。
【发明内容】
[0008]本发明所要解决的技术问题是提供一种可批量生产的自身免疫抗原阳性血清的制备方法。[0009]为解决以上技术问题，本发明采取如下技术方案:
[0010]一种自身免疫抗原阳性血清的制备方法，包括依次进行的如下步骤:
[0011]步骤1、用自身免疫抗原对健康动物进行多次免疫，每次所述免疫之前，对所述健康动物进行取血测定OD值，当OD值稳定后，免疫结束，进行取血，获得抗血清；
[0012]步骤2、对步骤I所得的抗血清进行亲和纯化得到IgG抗体；
[0013]步骤3、将步骤2所得的IgG抗体和人IgG抗体按质量比为1:1?5偶联后，经分离纯化获得IgG-1gG连接物浓溶液，将所述的IgG-1gG连接物浓溶液稀释至浓度为0.5?I μ g/ml，即得所述的阳性血清。
[0014]优选地，步骤I中OD值的测定方法为酶联免疫吸附测定法(ELISA)。
[0015]优选地，所述的健康动物为兔子。
[0016]优选地，步骤I中，每次免疫时所采用的所述的自身免疫抗原的质量为2?60mg。
[0017]优选地，步骤I中，先将所述的自身免疫抗原配置成浓度为4?8mg/ml的自身免疫抗原溶液，按所述的自身免疫抗原溶液与弗氏完全佐剂的体积比为I?1.5:1配置成乳液进行首次免疫；按所述的自身免疫抗原溶液与弗式不完全佐剂的体积比为I?1.5:1配置成乳液进行后续免疫。
[0018]优选地，所述的免疫次数为6?8次，每两次免疫的间隔时间为12?36天。
[0019]优选地，步骤I中，取血时采用耳缘静脉取血。
[0020]优选地，采用蛋白A sepharose CL-4B亲和柱进行所述的亲和纯化。
[0021]优选地，步骤3中，所述的IgG抗体和所述的人IgG抗体分别通过所述的2-亚胺四氢噻吩偶联剂和4-(N-马来酰亚胺基甲基)环己烷-1-羧酸琥珀酰亚胺酯偶联剂活化后，在2?8°C下进行偶联。
[0022]优选地,步骤3中，采用Supperdex200凝胶柱进行所述的分离纯化。
[0023]优选地，步骤3中，采用含质量比为0.4?6%的牛血清白蛋白、pH7.5?8.5、
0.09?0.llmol/L的三羟甲基氨基甲烷缓冲液将所述的IgG-1gG连接物浓溶液进行所述的稀释。
[0024]由于以上技术方案的实施，本发明与现有技术相比具有如下优点:
[0025]本发明方法可批量制备各种自身免疫抗原的阳性血清，并且本制备方法简单易行；该方法获得的阳性血清可用于检测试剂盒制备过程中的阳性质控，也可以作为校准品的生产原料。
【专利附图】
【附图说明】
[0026]附图1为经蛋白A sepharose CL-4B亲和柱纯化的兔抗JO-1IgG蛋白条带。【具体实施方式】
[0027]下面结合具体实施例对本发明做进一步详细的说明，但本发明并不限于以下实施例。实施例中采用的实施条件可以根据具体使用的不同要求做进一步调整，未注明的实施条件为本行业中的常规条件。
[0028]实施例1
[0029](一)自身免疫抗原的免疫和兔抗血清效价测定[0030]材料与仪器
[0031]1、自身免疫抗原:自身免疫抗原冻干粉，自身免疫抗原为JO-1 ；
[0032]2、佐剂:商品化的弗氏完全佐剂和弗氏不完全佐剂；
[0033]3、动物:选3只(每种自身免疫抗原免疫3只兔子)2月龄、体重1.5?2.0kg的健康新西兰大白兔；
[0034]4、二抗:HRP标记的羊抗兔IgG ；
[0035]5、耗材:三通器、一次性注射器、移液器等。
[0036]免疫步骤
[0037]1、免疫自身免疫抗原准备:用BCA法确定冻干粉溶解后自身免疫抗原的浓度，取4mg自身免疫抗原用PBS稀释至600ul，用三通器将自身免疫抗原与完全佐剂或不完全佐剂(自身免疫抗原V:佐剂V=6:5)乳化，直至将一滴乳液滴入水中呈现球形而不分散则自身免疫抗原准备好。首次免疫用弗氏完全佐剂，后续免疫均用弗氏不完全佐剂。
[0038]2、动物免疫:将购买的3只新西兰大白兔在动物房养殖I周，使动物适应环境；将制备好的乳液，用Iml注射器进行颈部或背部皮下免疫注射，每只新西兰大白兔注射3点，每点注射300ul ;免疫周期为14天。
[0039]3、抗血清的制备:每只动物免疫前先于一侧耳缘静脉抽取2mL血(作为空白对照)，之后每次免疫14天后，下次免疫前进行耳缘静脉取血用于抗血清评价；取血后取下针头，将注射器中的血缓缓转移至离心管中，于4°C冰箱中过夜，取上清即为血清，析出淡黄色抗血清；将抗血清转移至另一管中，血凝块以1500xg离心lOmin。吸出上清液合并收集到的抗血清管中；抗血清分装保存于一 70°C。
[0040]4、抗血清效价的测定:采用酶联免疫吸附测定(enzyme linked immunosorbentassay，ELISA)，用包被缓冲液将自身免疫抗原稀释至10ug/ml，除阴性孔外每孔加IOOul即Iug ;阴性对照I和阴性对照2各包被lug BSA和人血红蛋白，4°C包被过夜；空白对照1:免疫自身免疫抗原前取血；空白对照2:—抗孵育封闭液，其中没有一抗抗体；空白对照3:HRP标记的羊抗兔IgG孵育封闭液；其余孔为按1:100、1:200倍比稀释的抗血清，进行效价测定。每次效价测定时平行进行上次收集抗血清的效价测定，前后两次免疫后抗血效价差异不大，则可以终止免疫杀兔取血，如果效价还有明显提高则继续免疫。
[0041]以JO-1免疫兔后抗血清评价结果表1:
[0042]表I
[0043]
【权利要求】
1.一种自身免疫抗原阳性血清的制备方法，其特征在于:包括依次进行的如下步骤: 步骤1、用自身免疫抗原对健康动物进行多次免疫,每次所述免疫之前,对所述健康动物进行取血测定OD值，当OD值稳定后，免疫结束，进行取血，获得抗血清； 步骤2、对步骤I所得的抗血清进行亲和纯化得到IgG抗体； 步骤3、将步骤2所得的IgG抗体和人IgG抗体按质量比为1:1飞偶联后，经分离纯化获得IgG-1gG连接物浓溶液，将所述的IgG-人IgG连接物浓溶液稀释至浓度为0.5^1 μ g/ml，即得所述的阳性血清。
2.根据权利要求1所述的自身免疫抗原阳性血清的制备方法，其特征在于:所述的健康动物为兔子。
3.根据权利要求1所述的自身免疫抗原阳性血清的制备方法，其特征在于:步骤I中，每次免疫时所采用的所述的自身免疫抗原的质量为2飞Omg。
4.根据权利要求1所述的自身免疫抗原阳性血清的制备方法，其特征在于:步骤I中，先将所述的自身免疫抗原配置成浓度为4、mg/ml的自身免疫抗原溶液,按所述的自身免疫抗原溶液与弗氏完全佐剂的体积比为广1.5:1配置成乳液进行首次免疫；按所述的自身免疫抗原溶液与弗式不完全佐剂的体积比为广1.5:1配置成乳液进行后续免疫。
5.根据权利要求1或4所 述的自身免疫抗原阳性血清的制备方法，其特征在于:所述的免疫次数为6~8次，每两次免疫的间隔时间为12~36天。
6.根据权利要求1所述的自身免疫抗原阳性血清的制备方法，其特征在于:步骤I中，取血时采用耳缘静脉取血。
7.根据权利要求1所述的自身免疫抗原阳性血清的制备方法，其特征在于:采用蛋白Asepharose CL-4B亲和柱进行所述的亲和纯化。
8.根据权利要求1所述的自身免疫抗原阳性血清的制备方法，其特征在于:步骤3中，所述的IgG抗体和所述的人IgG抗体分别通过所述的2-亚胺四氢噻吩偶联剂和4-(N-马来酰亚胺基甲基)环己烷-1-羧酸琥珀酰亚胺酯偶联剂活化后，在疒8°C下进行偶联。
9.根据权利要求1所述的自身免疫抗原阳性血清的制备方法，其特征在于:步骤3中，采用Supperdex200凝胶柱进行所述的分离纯化。
10.根据权利要求1所述的自身免疫抗原阳性血清的制备方法，其特征在于:步骤3中，采用含质量比为0.4~6%的牛血清白蛋白、PH7.5~8.5,0.09^0.llmol/L的三羟甲基氨基甲烷缓冲液将所述的IgG-1gG连接物浓溶液进行所述的稀释。
【文档编号】G01N33/96GK103901218SQ201410127283
【公开日】2014年7月2日 申请日期:2014年4月1日 优先权日:2014年4月1日
【发明者】左云国, 丁俊荣, 宋孟杰, 李永红, 李庆春, 孙婵 申请人:苏州浩欧博生物医药有限公司